体外循环肺缺血再灌注损伤的实验研究
作者：王辉山 汪曾炜 易定华 徐鹏
单位：王辉山 汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科 110015)；易定华 徐鹏(西安第四军医大学西京医院心胸外科 710032)
关键词：肺损伤；体外循环；一氧化氮
心肺血管病杂志000221
摘要 研究兔体外循环中肺的缺血再灌注损伤并探讨其可能机制。采用兔体外循环模型，测定肺组织的丙二醛(MDA)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮(NO)含量、肺血管通透性(EB值)及肺组织湿干比(W/D值)。CPB组肺组织MDA含量(139.4±17.0)mmol/g明显高于对照组(27.6±1.8)mmol/g,P<0.01；MPO含量(9.4±0.6)u/g明显高于对照组(1.9±0.7)u/g，P<0.01；NO含量(8.4±3.8)μmol/g明显低于对照组(20.9±1.7)μmol/g，P<0.01；W/D值(8.5±2.1)明显高于对照组(4.5±0.9)P<0.01；EB值(3.233±0.07)明显高于对照组(1.394±0.06)，P<0.01。动物实验提示CPB中肺的缺血再灌注是肺损伤的重要原因，内源性NO减少是肺损伤的重要环节。
, 百拇医药
Experimental Study of the Ischemia-reperfusion Injury of Lung During CPB
Wang Huishan,Yi Dinghua,Wang Zengwei,et al.
(Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital of
Shenyang Command,Shenyang 110015)
(Department of Cardiothoracic Surgery,Xijing Hospital,Fourth
Military Medical University 710032)
, 百拇医药
Abstract Aim:To study the ischemia reperfusion injury of lung during CPB and its possible mechanism.Method:CPB models were set up with living rabbits.MDA,MPO,NO contents in lung tissue were determined.Ratio of wet lung tissue to dry one and the EB value were tested.The micro-and ultra-structure were observed.Results:MDA content of lung tissue in CPB(139.4±17.0 mmol/g) was significantly higher than that in control group (27.6±1.8),P<0.01;MPO content (9.4±0.6 u/g) was significantly higher than that of sham group (1.9±0.7 u/g),P<0.01;No content (8.4±3.9 μmol/g) was lower than that in sham group (20.9±1.7 μmol/g),P<0.01;Ratio of wet/dry (8.5±2.1) was higher than that in sham group (4.5±0.9),P<0.05;EB value (3.233±0.07) was higher than that in sham group (1.394±0.06).Conclusion:There is ischmic reperfusion injury during CPB and NO plays an important role in the injury.
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Key words：Lung injury; Cardiopulmonary bypass; Nitric oxide
体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)是心脏外科的一项重要技术。CPB中肺经历了缺血再灌注过程，引起炎性及内皮损害，导致肺功能损害，严重者可引起死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是内皮释放的一种小分子物质，可使血管舒张，并在缺血再灌注损伤中有调节作用。本研究应用兔CPB模型，探讨肺缺血再灌注损伤后发生机制及NO的作用。
材料和方法
1.动物及分组 健康家兔20只，体重2.0 kg～2.5 kg，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组，每组10只：手术对照组，CPB组。
2.CPB模型的建立 实验兔术前禁食水6 h，采用戊巴比妥钠35 mg/kg，腹腔注射。气管切开插管，小动物呼吸机辅助呼吸(上海医疗仪器厂)。股动脉插管测压，胸骨正中开胸，3 mg/kg肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉引流管和左房引流管，连接小型CPB机(Sarns-7000血泵，自制实验用氧合器)。体外循环温度为28～32℃中度血液稀释(HCT：0.20～0.24)，流量为70～110 ml.kg-1.min-1，平均动脉压维持在8 kPa～12 kPa(60～90 mmHg)。总转流时间为120 min，其中主、肺动脉阻断60 min。停跳液采用冷晶体St.ThomasⅡ液。开放主动脉、肺动脉，心脏复跳，辅助循环60 min。留取组织标本。手术对照组为单纯开胸，肝素化，120 min后，取标本。
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3.检测指标与方法 (1)病理切片 取右下肺组织1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm,100 ml/L福尔马林固定、石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下观察肺间质水肿及白细胞浸润程度。(2)电镜 取右下肺组织，置于戊二醛中固定，透射电镜标本常规制备。电镜下观察血管内皮细胞及上皮细胞损伤情况。(3)组织丙二醛(MDA)含量 100 g/L肺组织匀浆。应用南京建成生物研究所提供的试剂盒，采用硫代巴比妥酸法，756型分光光度计在532 nm处比色。(4)组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定 参照Suzuki等的方法，用消耗过氧化氢的量测定肺组织的MPO活性。取100 g/L组织匀浆4℃，16 000 g离心15 min，弃去上清，再次匀浆，反复冰融2次，加入显色剂TMB及H202的PBS中，37℃下，756型分光光度计655 nm处比色。(5)组织湿干重量比 取肺组织称重，烘干至恒重，计算湿干重量比。(6)血管通透性的测定 每组取4只动物，在CPB结束前，由肺动脉灌注1%伊文氏蓝(Evan's Blue,EB)，20 mg/kg，灌注后静置10 min，取出肺脏用生理盐水以2.94 kPa(22 mmHg)压力灌注肺动脉。取小块肺组织称重，加入甲酰胺3 mol/100 mg，置于50℃隔水式培养箱中24 h，提取肺组织渗出的伊文氏蓝，称干重。将肺组织伊文氏蓝提取液3 ml倒入测试杯。756型分光光度计在620 nm处比色以EB强度值计算。(7)一氧化氮的测定100 g/L肺组织匀浆，测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。应用硝酸还原酶特异性地将NO3-还原为NO2-，756分光光度计在550 nm处比色。
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4.统计方法 所有数据均以
±S表示。各组以团体t检验，P<0.05为差异显著界限。
结 果
1.组织显微结构观察 光镜下见CPB组肺组织间质水肿，内有较多的白细胞浸润。而对照组肺泡结构完整，无明显壁增厚。
2.组织超微结构观察 电镜下见CPB组Ⅱ型细胞胞浆空泡化，板层体消失，毛细血管破损，线粒体消失。而对照组Ⅱ型细胞胞浆内有大量板层体结构存在，完整清晰胞核完整。
3.MDA含量的变化 CPB组MDA含量明显高于对照组(P<0.01)，见表1。
4.MPO含量的变化 CPB组MPO含量明显高于对照组(P<0.01)，见表1。
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5.组织湿干比(W/D)的变化 CPB组的W/D值明显高于对照组(P<0.05)，见表1。
6.血管通透性的变化 与对照组的EB值相比，CPB组明显增高(P<0.01)，见表1。
7.NO含量的变化 CPB组明显低于对照组(P<0.01)，见表1。
表1 各组肺组织MDA、MPO、PLA2、W/D及NO的变化(X±S)
MDA(mmol/g)
MPO(U/g)
EB
W/D
NO(μmol/g)
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对照组
27.6±1.8
1.9±0.7
1.394±0.06
4.5±0.9
20.9±1.7
CPB组
139.4±17.0
9.4±0.6
3.233±0.7
8.5±2.1
8.4±3.8
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讨 论
体外循环(CBP)后肺部并发症是心血管外科手术后常见的并发症。CPB时，肺动脉血流完全停止，肺不通气，仅靠支气管动脉的少量灌注，此时肺处于缺血缺氧状态。当循环开放后，肺血流恢复，肺经历了缺血再灌注的过程 。本研究结果显示，体外循环后肺白细胞浸润加重；氧自由基产物(MDA)含量亦上升，W/D值增大，MPO，EB值升高。肺组织经受氧自由基损伤，血管通透性增加，出现肺水肿。
体外循环相关的急性肺损伤的原因是多方面的。肺的缺血再灌注是重要原因之一。许多血管活性物质，如白三烯B4和血小板激活因子的产生，使血管收缩，通透性增加，促使白细胞对血管壁的粘附。同时大量白细胞被激活，使得被“扣押”在肺血管中的中性粒细胞与大量的炎症介质浸润至肺组织间质中，引起氧自由基产生，破坏脂质细胞膜，蛋白质和酶。因此，可以认为肺缺血再灌注损伤中，中性粒细胞起着至关重要的作用，它贯穿了肺损伤的全过程。
近年来，对于血管内皮细胞研究发现，中性粒细胞的激活及氧自由基的产生可引起血管内皮功能的损害。这可能是介导肺损伤的重要环节。内皮细胞受损后，释放大量的活性因子，其表面的粘附分子表达增强，增加了与白细胞的粘附。同时，血管通透性改变，引起中性粒细胞渗入肺组织，发生肺间质水肿，甚至肺水肿。
, 百拇医药
一氧化氮(Nitric oxide,NO)是新近发现的一种重要的调节生命活动的小分子物质。由左精氨酸通过NO合酶(Nitric oxide synthase,NOS)催化生成。NO在急性炎症期具有很强的抑制炎症和调节功能，通过改变细胞内GMP水平降低血管通透性，亦可中和氧自由基。本研究发现，CPB后NO水平明显下降，与Morita等的结论相一致，这表明CPB肺损伤中，NO的调节能力下降。
总之，CPB使肺经历了缺血再灌注过程，内皮细胞受损伤，内源性NO减少。内皮功能失调，导致其抑制中性粒细胞粘附的能力下降，血管内皮通透性增多，大量中性粒细胞浸润至肺组织，引起氧自由基损伤，导致细胞膜稳定性破坏，引起肺损伤及肺水肿。
参考文献
1，Suzuki K,Ota H,Sasagawa S,et al.Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes.Anal Biochem,1983,132(4):345～352.
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2，Oilver JA.Endothelium-derived relaxing factor contributes to the regulation of endothelial permeability.J Cell Physiol,1992,151(3):506～511.
3，Rubanyi GM,Elena H,Cantor EH et al.Cytoprotective function of nitric oxide:Inactivation of superoxide radicals produced by human leukocytes.Biochem Biophys Res Commun,1991,81(77):1392～1397.
4，Morita K,Ihnken K,Buckberg GD,et al.Pulmonary vasoconstriction due to impaired nitric oxide production after cardiopulmonary bypass.Ann Thorac Surg,1996,61(5):1775～1780.
收稿日期：1999-02-23
修回日期：1999-04-01, 百拇医药
单位：王辉山 汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科 110015)；易定华 徐鹏(西安第四军医大学西京医院心胸外科 710032)
关键词：肺损伤；体外循环；一氧化氮
心肺血管病杂志000221
摘要 研究兔体外循环中肺的缺血再灌注损伤并探讨其可能机制。采用兔体外循环模型，测定肺组织的丙二醛(MDA)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮(NO)含量、肺血管通透性(EB值)及肺组织湿干比(W/D值)。CPB组肺组织MDA含量(139.4±17.0)mmol/g明显高于对照组(27.6±1.8)mmol/g,P<0.01；MPO含量(9.4±0.6)u/g明显高于对照组(1.9±0.7)u/g，P<0.01；NO含量(8.4±3.8)μmol/g明显低于对照组(20.9±1.7)μmol/g，P<0.01；W/D值(8.5±2.1)明显高于对照组(4.5±0.9)P<0.01；EB值(3.233±0.07)明显高于对照组(1.394±0.06)，P<0.01。动物实验提示CPB中肺的缺血再灌注是肺损伤的重要原因，内源性NO减少是肺损伤的重要环节。
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Experimental Study of the Ischemia-reperfusion Injury of Lung During CPB
Wang Huishan,Yi Dinghua,Wang Zengwei,et al.
(Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital of
Shenyang Command,Shenyang 110015)
(Department of Cardiothoracic Surgery,Xijing Hospital,Fourth
Military Medical University 710032)
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Abstract Aim:To study the ischemia reperfusion injury of lung during CPB and its possible mechanism.Method:CPB models were set up with living rabbits.MDA,MPO,NO contents in lung tissue were determined.Ratio of wet lung tissue to dry one and the EB value were tested.The micro-and ultra-structure were observed.Results:MDA content of lung tissue in CPB(139.4±17.0 mmol/g) was significantly higher than that in control group (27.6±1.8),P<0.01;MPO content (9.4±0.6 u/g) was significantly higher than that of sham group (1.9±0.7 u/g),P<0.01;No content (8.4±3.9 μmol/g) was lower than that in sham group (20.9±1.7 μmol/g),P<0.01;Ratio of wet/dry (8.5±2.1) was higher than that in sham group (4.5±0.9),P<0.05;EB value (3.233±0.07) was higher than that in sham group (1.394±0.06).Conclusion:There is ischmic reperfusion injury during CPB and NO plays an important role in the injury.
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Key words：Lung injury; Cardiopulmonary bypass; Nitric oxide
体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)是心脏外科的一项重要技术。CPB中肺经历了缺血再灌注过程，引起炎性及内皮损害，导致肺功能损害，严重者可引起死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是内皮释放的一种小分子物质，可使血管舒张，并在缺血再灌注损伤中有调节作用。本研究应用兔CPB模型，探讨肺缺血再灌注损伤后发生机制及NO的作用。
材料和方法
1.动物及分组 健康家兔20只，体重2.0 kg～2.5 kg，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组，每组10只：手术对照组，CPB组。
2.CPB模型的建立 实验兔术前禁食水6 h，采用戊巴比妥钠35 mg/kg，腹腔注射。气管切开插管，小动物呼吸机辅助呼吸(上海医疗仪器厂)。股动脉插管测压，胸骨正中开胸，3 mg/kg肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉引流管和左房引流管，连接小型CPB机(Sarns-7000血泵，自制实验用氧合器)。体外循环温度为28～32℃中度血液稀释(HCT：0.20～0.24)，流量为70～110 ml.kg-1.min-1，平均动脉压维持在8 kPa～12 kPa(60～90 mmHg)。总转流时间为120 min，其中主、肺动脉阻断60 min。停跳液采用冷晶体St.ThomasⅡ液。开放主动脉、肺动脉，心脏复跳，辅助循环60 min。留取组织标本。手术对照组为单纯开胸，肝素化，120 min后，取标本。
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3.检测指标与方法 (1)病理切片 取右下肺组织1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm,100 ml/L福尔马林固定、石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下观察肺间质水肿及白细胞浸润程度。(2)电镜 取右下肺组织，置于戊二醛中固定，透射电镜标本常规制备。电镜下观察血管内皮细胞及上皮细胞损伤情况。(3)组织丙二醛(MDA)含量 100 g/L肺组织匀浆。应用南京建成生物研究所提供的试剂盒，采用硫代巴比妥酸法，756型分光光度计在532 nm处比色。(4)组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定 参照Suzuki等的方法，用消耗过氧化氢的量测定肺组织的MPO活性。取100 g/L组织匀浆4℃，16 000 g离心15 min，弃去上清，再次匀浆，反复冰融2次，加入显色剂TMB及H202的PBS中，37℃下，756型分光光度计655 nm处比色。(5)组织湿干重量比 取肺组织称重，烘干至恒重，计算湿干重量比。(6)血管通透性的测定 每组取4只动物，在CPB结束前，由肺动脉灌注1%伊文氏蓝(Evan's Blue,EB)，20 mg/kg，灌注后静置10 min，取出肺脏用生理盐水以2.94 kPa(22 mmHg)压力灌注肺动脉。取小块肺组织称重，加入甲酰胺3 mol/100 mg，置于50℃隔水式培养箱中24 h，提取肺组织渗出的伊文氏蓝，称干重。将肺组织伊文氏蓝提取液3 ml倒入测试杯。756型分光光度计在620 nm处比色以EB强度值计算。(7)一氧化氮的测定100 g/L肺组织匀浆，测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。应用硝酸还原酶特异性地将NO3-还原为NO2-，756分光光度计在550 nm处比色。
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4.统计方法 所有数据均以
±S表示。各组以团体t检验，P<0.05为差异显著界限。结 果
1.组织显微结构观察 光镜下见CPB组肺组织间质水肿，内有较多的白细胞浸润。而对照组肺泡结构完整，无明显壁增厚。
2.组织超微结构观察 电镜下见CPB组Ⅱ型细胞胞浆空泡化，板层体消失，毛细血管破损，线粒体消失。而对照组Ⅱ型细胞胞浆内有大量板层体结构存在，完整清晰胞核完整。
3.MDA含量的变化 CPB组MDA含量明显高于对照组(P<0.01)，见表1。
4.MPO含量的变化 CPB组MPO含量明显高于对照组(P<0.01)，见表1。
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5.组织湿干比(W/D)的变化 CPB组的W/D值明显高于对照组(P<0.05)，见表1。
6.血管通透性的变化 与对照组的EB值相比，CPB组明显增高(P<0.01)，见表1。
7.NO含量的变化 CPB组明显低于对照组(P<0.01)，见表1。
表1 各组肺组织MDA、MPO、PLA2、W/D及NO的变化(X±S)
MDA(mmol/g)
MPO(U/g)
EB
W/D
NO(μmol/g)
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对照组
27.6±1.8
1.9±0.7
1.394±0.06
4.5±0.9
20.9±1.7
CPB组
139.4±17.0
9.4±0.6
3.233±0.7
8.5±2.1
8.4±3.8
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讨 论
体外循环(CBP)后肺部并发症是心血管外科手术后常见的并发症。CPB时，肺动脉血流完全停止，肺不通气，仅靠支气管动脉的少量灌注，此时肺处于缺血缺氧状态。当循环开放后，肺血流恢复，肺经历了缺血再灌注的过程 。本研究结果显示，体外循环后肺白细胞浸润加重；氧自由基产物(MDA)含量亦上升，W/D值增大，MPO，EB值升高。肺组织经受氧自由基损伤，血管通透性增加，出现肺水肿。
体外循环相关的急性肺损伤的原因是多方面的。肺的缺血再灌注是重要原因之一。许多血管活性物质，如白三烯B4和血小板激活因子的产生，使血管收缩，通透性增加，促使白细胞对血管壁的粘附。同时大量白细胞被激活，使得被“扣押”在肺血管中的中性粒细胞与大量的炎症介质浸润至肺组织间质中，引起氧自由基产生，破坏脂质细胞膜，蛋白质和酶。因此，可以认为肺缺血再灌注损伤中，中性粒细胞起着至关重要的作用，它贯穿了肺损伤的全过程。
近年来，对于血管内皮细胞研究发现，中性粒细胞的激活及氧自由基的产生可引起血管内皮功能的损害。这可能是介导肺损伤的重要环节。内皮细胞受损后，释放大量的活性因子，其表面的粘附分子表达增强，增加了与白细胞的粘附。同时，血管通透性改变，引起中性粒细胞渗入肺组织，发生肺间质水肿，甚至肺水肿。
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一氧化氮(Nitric oxide,NO)是新近发现的一种重要的调节生命活动的小分子物质。由左精氨酸通过NO合酶(Nitric oxide synthase,NOS)催化生成。NO在急性炎症期具有很强的抑制炎症和调节功能，通过改变细胞内GMP水平降低血管通透性，亦可中和氧自由基。本研究发现，CPB后NO水平明显下降，与Morita等的结论相一致，这表明CPB肺损伤中，NO的调节能力下降。
总之，CPB使肺经历了缺血再灌注过程，内皮细胞受损伤，内源性NO减少。内皮功能失调，导致其抑制中性粒细胞粘附的能力下降，血管内皮通透性增多，大量中性粒细胞浸润至肺组织，引起氧自由基损伤，导致细胞膜稳定性破坏，引起肺损伤及肺水肿。
参考文献
1，Suzuki K,Ota H,Sasagawa S,et al.Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes.Anal Biochem,1983,132(4):345～352.
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2，Oilver JA.Endothelium-derived relaxing factor contributes to the regulation of endothelial permeability.J Cell Physiol,1992,151(3):506～511.
3，Rubanyi GM,Elena H,Cantor EH et al.Cytoprotective function of nitric oxide:Inactivation of superoxide radicals produced by human leukocytes.Biochem Biophys Res Commun,1991,81(77):1392～1397.
4，Morita K,Ihnken K,Buckberg GD,et al.Pulmonary vasoconstriction due to impaired nitric oxide production after cardiopulmonary bypass.Ann Thorac Surg,1996,61(5):1775～1780.
收稿日期：1999-02-23
修回日期：1999-04-01, 百拇医药