心脏移植中HLA-Ⅱ类抗原基因配型的实验研究
作者：董然 陈宝田 邱长春 石镜
单位：邱长春(中国医学科学院基础医学研究所)；董然 陈宝田 石镜(北京市心肺血管疾病研究所 首都医科大学附属北京安贞医院，100029)
关键词：器官移植；HLA-Ⅱ类抗原基因配型；PCR-SSCP
心肺血管病杂志0000314
摘要 建立人类白细胞抗原(HLA)-Ⅱ型抗原4个基因位点DRB1、DQA1、DQB1、DPB1的聚合酶链式反应-单-链构象多态分析(PCR-SSCP)配型方法。实验分三部分：1.通过预实验确定使用PCR-SSCP检测HLA-DRB1、DA1、DQB1、DPB1 4个位点的实验条件；2.使用以上方法对1例拟行心脏移植的患者在127例健康人群中进行基因位点的检测配型；3.对配型一致及不一致的供体和受体，进行体外混合淋巴细胞培养(MLC)，以检验这种基因配型方法的可靠性。通过PCR-SSCP的检测配型，在127例供体中，2例DRB1位点、2例DQA1位点、3例DQB1位点、2例DPB1位点与受体相一致。体外MLC证实与受体不一致的供、受体MLC中，受体淋巴细胞呈高度增殖反应；而与受体某一位点一致的供体，其MLC中受体淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。PCR-SSCP是一种快速、准确的HLA-Ⅱ类抗原基因位点检测配型的方法。
, 百拇医药
Experimental Research of Genotyping for HLA Class Ⅱ Antigens in Cardiar Transplantation
Dong Ran,Chen Baotian,Qiu Changchun,et al.
(Beijing Heart,Lung and Blood Vessel Medical Center-Anzhen Hospital，100029)
Abstract To establish a genotyping method for HLA-DRB1,DQA1,DQB1 and DQP1 polymorphic loci-Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism(PCR-SSCP).The experiment is divided into three steps:To set up the experimental conditions of PCR-SSCP for detecting and typing HLA-DRB1,DQA1,DQB1 and DPB1 loci through pre-experiment;Then by using the method of PCR-SSCP,we genotyped for HLA class Ⅱ between one heart tranplatation recipient and 127 cases of health people,In order to determinate the reliability of this genotyping method,we carried out mixed lymphocyte cultures (MLC) with cells from the recipient and donors,including the mismatched and matched donors ascertained by PCR-SSCP typing.By genotyping in 127 cases using PCR-SSCP analysis,we have gotten donors who are compatible with the recipient for one locus of HLA class Ⅱ gene.Of which,two were identical to the recipient for DRB1 locus,two for DQA1,three for DQB1 locus and two for DPB1 locus.MLCs performed donors respectively showed that the lymphocytes of the recipient had high proliferation response in MLCs with mismatched donors,and significant lower response(P<0.01) in MLCs with one-locus identical donors.Conclusion:PCR-SSCP genotyping is a rapid and accurate method for detecting and typing HLA Class Ⅱ genes.
, 百拇医药
Key words：Organ transplantation;HLA Class Ⅱ genotyping;PCR-SSCP
人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen,HLA)是引起器官移植后排斥反应的重要因素，特别是HLA-Ⅱ类抗原在排斥反应中递呈抗原，参与免疫识别及激活，具有调节机体排斥反应的功能[1]。在心脏移植中，供、受体HLA-Ⅱ类抗原一致时，早期排斥反应频率低、反应轻，晚期移植心脏血管病变(Cardiac Allograft Vasculopathy,CAV)发生率低，移植术后近、远期疗效好[2]。但由于目前HLA-Ⅱ类抗原的配型方法耗时长、费用高，而且不能于移植术前进行供体的配型。本实验目的是建立一种快速、简单、准确、又经济的HLA-Ⅱ类抗原基因配型方法。
实验方法
1.实验对象 1例先天性心脏病患者拟为心脏移植受体，127例随机健康人群为供体。
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2.DNA样本制备及PCR扩增 取5ml外周血，EDTA抗凝，按Stafford报道方法[3]，制备浓度为0.2μg/ml的基因组DNA样本。编码HLA-Ⅱ类抗原多态位点HLA-DRB1、DQA1、DQB1、DPB1的是其第二外显子基因片段，引物序列及扩增条件如表1、2[4，5]。PCR产物鉴定：取5ml扩增产物加1μl载样缓冲液在2%琼脂糖凝胶电泳，100v×20min，紫外灯下观察。
表1 特异性引物序列 扩增片段
引物序列
DRB1第
二外显子
DRB15’-3’-TGTCATTTCTTTCAATGGGACG
, 百拇医药
DRB13’-5’-TCGCCGCTGCACTGTGAAG
DQA1第
二外显子
DQA15’-3’-GGTGTAAACTTGTACCAG
DQA13’-5’-GGTAGCAGCGGTAGAGTTG
DQB1第
二外显子
DQB15’-3’-TGCTACTTCACCAACGGGGAC
DQB13’-5’-CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC
, 百拇医药
DPB1第
二外显子
DPB15’-3’-GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT
DPB13’-5’-CTCACTCCCGAAACCCGGCCG
表2 PCR扩增条件
变性温度
时间
退火温度
时间
延伸温度
时间
, http://www.100md.com
扩增片段
长度
DRB1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
240bp
DQA1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
225bp
, 百拇医药
DQB1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
214bp
DPB1
95℃1min
60℃1min
72℃2min
327bp
3.SSCP配型(1)确定SSCP的实验条件 在预实验中对胶浓度、交联度、电泳条件、温度及胶中甘油含量5个因素，固定4个因素而改变一个条件，反复试验寻找能够分辨DNA多态性的实验条件。(2)为1例心脏移植受体(R)行SSCP配型 取5μl PCR产物，加10μl反应终止液(98%甲酰胺、20mM EDTA、0.01%溴酚蓝)，96℃变性5min，取出迅速插入冰水中，对DRB1、DQA1、DQB1、DPB1各位点采用预实验中确定的SSCP条件(表3)进行电泳分析，电泳结束后均采用硝酸银染色显示单链DNA电泳条带。
, 百拇医药
4.MLCs验证PCR-SSCP配型 实验分为对照组和实验组；对照组又分为阴性和阳性对照组。按Olerup报道方法进行MLC[6]。取10ml外周血肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，悬于完全培养液中，调整浓度为2×106/ml，用经丝裂霉素C处理后的自身淋巴细胞为阴性对照组；取20例经PCR-SSCP配型证实与受体HLA-Ⅱ类基因不一致的供体为阳性对照组；实验组：与受体HLA-Ⅱ类基因某个位点相一致的供体淋巴细胞和受体淋巴细胞混合培养。取供体及部分受体细胞，调整浓度为2×106/ml，在96孔板中进行混合培养，每对MLC设4个复孔。加样完毕后用微量搅拌器搅拌5 min，置37℃5%CO2培养箱中培养5天，每孔加入3H-TαR，终浓度为0.5μci/孔，培养16h收集于49型玻璃纤维纸上，加少量5%三氯醋酸固定，置70～80℃烤箱中烤干，用液闪仪记数cpm值，每孔以4个复孔cpm平均值为准。表3 SSCP实验条件 分析片段
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胶浓度
(%)
交联度
甘油
电泳条件
时间
(h)
温度
(℃)
DRB1
12
50：1
1%
, 百拇医药
恒流5m AMP
8
4
DQA1
10
50：1
无
恒流7.5m AMP
7
4
DQB1
10
50：1
, http://www.100md.com
1%
恒流7.5m AMP
7
4
DPB1
8
50：1
无
恒压5V/cm
5
室温20
结 果
1.PCR扩增 供、受体128例PCR扩增产物经电泳鉴定均见清晰亮带。
, 百拇医药
2.SSCP配型 经预实验确定的PCR-SSCP配型实验条件见表3。1例受体配型得到9例供体的HLA-Ⅱ类基因某一位点与受体相一致，其中2例DRB1、2例DQA1、3例DQB1、2例DQP1位点与受体相应位点一致。
3.MLCs 阴性对照组cpm值为145.33±7.18，SI为1.0(设定值)，受体淋巴细胞无明显增殖反应；阳性对照组cpm值为1701.13±139.32，受体淋巴细胞呈高度增殖反应；实验组中受体淋巴细胞反应性均明显降低，与阳性对照组相比P<0.01，结果见表4。
图1 受体与供体1及供体2的PCR-SSCP图谱
表4 MLCs液闪计数结果(cpm) 组别
, http://www.100md.com
X±SD
SI
RR
阴性对照组
145.33±7.18
1
0
DRB1配合
1224.30±87.32
8.42
0.66
DQA1配合
, 百拇医药
1372.34±69.19
9.44
0.74
DQB1配合
1417.31±81.22
9.75
0.80
DPB1配合
1285.87±98.72
8.84
0.71
阳性对照组
, http://www.100md.com
1707.13±139.34
11.75
1.0
注：本组cpm为81.42±6.71；SI：刺激指数，SI=试验组cpm/阴性对照组cpm；RR：相对反应值RR=(阳性对照组cpm-试验组cpm)/(阳性对照组cpm-阴性对照组cpm)讨 论
一、心脏移植HLA-Ⅱ类抗原基因配型的发展及临床意义 心脏移植是治疗终末期心脏病的有效措施。术后排斥反应及晚期发生的移植心脏血管病变(CAV)是影响患者临床疗效的主要原因[2]。研究表明：供、受体之间HLA-Ⅱ类抗原的配合程度与移植后早期排斥反应程度、发生的时间及频率，晚期CAV发生率同患者存活时间有密切关系[2]。无疑，如果能够在术前选择HLA-Ⅱ类抗原一致或部分一致的供体进行移植，将会提高心脏移植的近远期疗效。但是由于供体缺血时间有限，目前HLA-Ⅱ类抗原的配型需时较长，因此在心脏移植中仅为回顾性研究。
, 百拇医药
HLA-Ⅱ类抗原传统配型有血清学和细胞学两种，需大量标准血清及纯合子分型细胞，耗时大、精确性差(DR抗原血清学配型与基因配型相比错配率达25%[27])。随着聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用及HLA复合体等位基因碱基序列的阐明，基因配型迅速发展，目前已有近十种基因配型方法，常用的有序列特异性寡核苷酸探针配型(PCR-SSO)，限制性片段长度多态分析(RFLP)，序列特异性引物PCR扩增(PCR-SSP)，等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)配型，异源双链分析配型，反向杂交配型等[8～10]。这些配型技术原理各异，但技术条件均要求较高，需合成大量探针或需昂贵的限制性内切酶，方法建立困难，不可能在短时间内完成多个供体的筛选配型，故临床应用仍有相当距离。
二、PCR-SSCP配型的特点 PCR-SSCP分析技术基本原理：在非变性条件下，单链DNA分子自身折叠成一定空间结构，这种空间结构由单链DNA分子的碱基序列所决定。因此长度相同的单链DNA分子在非变性胶中电泳时，碱基序列不同的单链DNA泳动速度及距原点的距离均不相同，造成了不同的电泳带型(SSCP带型)[11]。可以看出PCR-SSCP配型不需确定供、受体HLA-Ⅱ类基因的基因编码，只需比较两者的SSCP带型是否一致，即可确定供、受体是否配合[5]。
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我们在预实验中观察到胶浓度、交联度、甘油含量、电泳时电压或电流强度及电泳湿度是影响SSCP对单链DNA多态性分析的主要因素，通过固定4个因素而改变一个条件，反复试验，得到较为稳定的实验条件如表3。应用这种实验条件，对127例健康人群的HLA-Ⅱ类基因4个位点DRB1、DQA1、DQB1及DQP1进行检测，与受体比较完成配型。整个配型只需10h，与其它基因配型相对比，PCR-SSCP具有快速、经济、简单的特点，尤其适用于较多样本的检测和筛选，有利于器官移植的临床应用。
三、MLCs验证 结果表明当受体淋巴细胞与经PCR-SSCP证实与受体不配合的供体淋巴细胞混合培养时，呈现出高度增殖反应；当与受体的HLA-Ⅱ类基因某一个位点相配合的供体淋巴细胞混合培养时，受体淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。这说明PCR-SSCP配型与体外混合淋巴细胞培养是一致的。Rood指出：HLA配型的实验是建立一种能够快速、准确预测MLC反应的技术[12]。本组实验结果说明：PCR-SSCP是一种快速、经济、与MLC相一致的HLA-Ⅱ类抗原基因配型的方法。不足之处是这种配型方法不能获得受体及供体的等位基因编码，可结合其他的基因检测技术加以完善。
, 百拇医药
参考文献
1，赵相茂.HLA分型原理及应用.上海科学技术出版社，1982，103.
2，Jarcho J,Naftel DC,Kirkin JK,et al.Dose HLA mistach affect the influence of rejectin response after cardiac transplantation?A multi-clinical inatitution study.J Heart Lung Transplant,1992,121:577.
3，Stafford DW,Blin N.A general method for isolation of high mollecular weight DNA from eukaryotes.Nucleic Acid Res,1978,3:2303
, 百拇医药
4，Carring M,Miller T,White M,et al.Typing of HLA-DQA1 and DQB1 Using DNA single-strand confirmation polymorphism.Hum Immunol,1992,33:208.
5，Hoshino S,Kimura A,Fukuda Y,et al.PCR-SSCP analysis of polymorphism in DPA1 and DPB1 genes:A simple,economocal and rapid method for histocompatibility testing.Hum Immunol,1992,33:98.
6，Olerup O,Moller E,Persson U.HLA-DP incompati
, 百拇医药
bilities might induce significant proliferation in primary mixed lymphocyte cultures in HLA-a,b,DR,DQ,compatible individuals:Implications for allogenic bone marrow transplantation.Tissue Antigens,1990,36:194.
7，Opele G.For the collaborative transplant study:Surval of DNA HLA-DR typed and matched cardaver kidney transplants.Lancet,1991,338:461.
8，Olerup O,Zetterquist H.HLA-DR typing by PCR-amplification with sequence-sspecific primers in 2 hours:an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation.Tissue Antigens,1992,39.
, http://www.100md.com
9，Saiki RK,Bugawan TL,Horn GT,et al.Analysis of enzymatically amplified betaglobin and HLA-DQ DNA with allele-specific olignucleotide probes.Nature,1986,324:163.
10，Kaneshige T,Murayama A,Hirasawa T,et al.Rapid and practical HLA class Ⅱ genotyping by reverse dot blotting.Transplant Proc,1993,25:194.
11，Orita M,Suzuki Y,Sekiya T,et al.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction.Genomics,1989,5:874
12，Schroeijers WEM,Van Rood JJ,et al.HLA-DR and HLA-DP induce comparable proliferation in primary mixed lymphocyte culture.Tissue Antigen,1988,32:145.
2000-04-18收稿, http://www.100md.com
单位：邱长春(中国医学科学院基础医学研究所)；董然 陈宝田 石镜(北京市心肺血管疾病研究所 首都医科大学附属北京安贞医院，100029)
关键词：器官移植；HLA-Ⅱ类抗原基因配型；PCR-SSCP
心肺血管病杂志0000314
摘要 建立人类白细胞抗原(HLA)-Ⅱ型抗原4个基因位点DRB1、DQA1、DQB1、DPB1的聚合酶链式反应-单-链构象多态分析(PCR-SSCP)配型方法。实验分三部分：1.通过预实验确定使用PCR-SSCP检测HLA-DRB1、DA1、DQB1、DPB1 4个位点的实验条件；2.使用以上方法对1例拟行心脏移植的患者在127例健康人群中进行基因位点的检测配型；3.对配型一致及不一致的供体和受体，进行体外混合淋巴细胞培养(MLC)，以检验这种基因配型方法的可靠性。通过PCR-SSCP的检测配型，在127例供体中，2例DRB1位点、2例DQA1位点、3例DQB1位点、2例DPB1位点与受体相一致。体外MLC证实与受体不一致的供、受体MLC中，受体淋巴细胞呈高度增殖反应；而与受体某一位点一致的供体，其MLC中受体淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。PCR-SSCP是一种快速、准确的HLA-Ⅱ类抗原基因位点检测配型的方法。
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Experimental Research of Genotyping for HLA Class Ⅱ Antigens in Cardiar Transplantation
Dong Ran,Chen Baotian,Qiu Changchun,et al.
(Beijing Heart,Lung and Blood Vessel Medical Center-Anzhen Hospital，100029)
Abstract To establish a genotyping method for HLA-DRB1,DQA1,DQB1 and DQP1 polymorphic loci-Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism(PCR-SSCP).The experiment is divided into three steps:To set up the experimental conditions of PCR-SSCP for detecting and typing HLA-DRB1,DQA1,DQB1 and DPB1 loci through pre-experiment;Then by using the method of PCR-SSCP,we genotyped for HLA class Ⅱ between one heart tranplatation recipient and 127 cases of health people,In order to determinate the reliability of this genotyping method,we carried out mixed lymphocyte cultures (MLC) with cells from the recipient and donors,including the mismatched and matched donors ascertained by PCR-SSCP typing.By genotyping in 127 cases using PCR-SSCP analysis,we have gotten donors who are compatible with the recipient for one locus of HLA class Ⅱ gene.Of which,two were identical to the recipient for DRB1 locus,two for DQA1,three for DQB1 locus and two for DPB1 locus.MLCs performed donors respectively showed that the lymphocytes of the recipient had high proliferation response in MLCs with mismatched donors,and significant lower response(P<0.01) in MLCs with one-locus identical donors.Conclusion:PCR-SSCP genotyping is a rapid and accurate method for detecting and typing HLA Class Ⅱ genes.
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Key words：Organ transplantation;HLA Class Ⅱ genotyping;PCR-SSCP
人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen,HLA)是引起器官移植后排斥反应的重要因素，特别是HLA-Ⅱ类抗原在排斥反应中递呈抗原，参与免疫识别及激活，具有调节机体排斥反应的功能[1]。在心脏移植中，供、受体HLA-Ⅱ类抗原一致时，早期排斥反应频率低、反应轻，晚期移植心脏血管病变(Cardiac Allograft Vasculopathy,CAV)发生率低，移植术后近、远期疗效好[2]。但由于目前HLA-Ⅱ类抗原的配型方法耗时长、费用高，而且不能于移植术前进行供体的配型。本实验目的是建立一种快速、简单、准确、又经济的HLA-Ⅱ类抗原基因配型方法。
实验方法
1.实验对象 1例先天性心脏病患者拟为心脏移植受体，127例随机健康人群为供体。
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2.DNA样本制备及PCR扩增 取5ml外周血，EDTA抗凝，按Stafford报道方法[3]，制备浓度为0.2μg/ml的基因组DNA样本。编码HLA-Ⅱ类抗原多态位点HLA-DRB1、DQA1、DQB1、DPB1的是其第二外显子基因片段，引物序列及扩增条件如表1、2[4，5]。PCR产物鉴定：取5ml扩增产物加1μl载样缓冲液在2%琼脂糖凝胶电泳，100v×20min，紫外灯下观察。
表1 特异性引物序列 扩增片段
引物序列
DRB1第
二外显子
DRB15’-3’-TGTCATTTCTTTCAATGGGACG
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DRB13’-5’-TCGCCGCTGCACTGTGAAG
DQA1第
二外显子
DQA15’-3’-GGTGTAAACTTGTACCAG
DQA13’-5’-GGTAGCAGCGGTAGAGTTG
DQB1第
二外显子
DQB15’-3’-TGCTACTTCACCAACGGGGAC
DQB13’-5’-CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC
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DPB1第
二外显子
DPB15’-3’-GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT
DPB13’-5’-CTCACTCCCGAAACCCGGCCG
表2 PCR扩增条件
变性温度
时间
退火温度
时间
延伸温度
时间
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扩增片段
长度
DRB1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
240bp
DQA1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
225bp
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DQB1
95℃1min
55℃2min
72℃2min
214bp
DPB1
95℃1min
60℃1min
72℃2min
327bp
3.SSCP配型(1)确定SSCP的实验条件 在预实验中对胶浓度、交联度、电泳条件、温度及胶中甘油含量5个因素，固定4个因素而改变一个条件，反复试验寻找能够分辨DNA多态性的实验条件。(2)为1例心脏移植受体(R)行SSCP配型 取5μl PCR产物，加10μl反应终止液(98%甲酰胺、20mM EDTA、0.01%溴酚蓝)，96℃变性5min，取出迅速插入冰水中，对DRB1、DQA1、DQB1、DPB1各位点采用预实验中确定的SSCP条件(表3)进行电泳分析，电泳结束后均采用硝酸银染色显示单链DNA电泳条带。
, 百拇医药
4.MLCs验证PCR-SSCP配型 实验分为对照组和实验组；对照组又分为阴性和阳性对照组。按Olerup报道方法进行MLC[6]。取10ml外周血肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，悬于完全培养液中，调整浓度为2×106/ml，用经丝裂霉素C处理后的自身淋巴细胞为阴性对照组；取20例经PCR-SSCP配型证实与受体HLA-Ⅱ类基因不一致的供体为阳性对照组；实验组：与受体HLA-Ⅱ类基因某个位点相一致的供体淋巴细胞和受体淋巴细胞混合培养。取供体及部分受体细胞，调整浓度为2×106/ml，在96孔板中进行混合培养，每对MLC设4个复孔。加样完毕后用微量搅拌器搅拌5 min，置37℃5%CO2培养箱中培养5天，每孔加入3H-TαR，终浓度为0.5μci/孔，培养16h收集于49型玻璃纤维纸上，加少量5%三氯醋酸固定，置70～80℃烤箱中烤干，用液闪仪记数cpm值，每孔以4个复孔cpm平均值为准。表3 SSCP实验条件 分析片段
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胶浓度
(%)
交联度
甘油
电泳条件
时间
(h)
温度
(℃)
DRB1
12
50：1
1%
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恒流5m AMP
8
4
DQA1
10
50：1
无
恒流7.5m AMP
7
4
DQB1
10
50：1
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1%
恒流7.5m AMP
7
4
DPB1
8
50：1
无
恒压5V/cm
5
室温20
结 果
1.PCR扩增 供、受体128例PCR扩增产物经电泳鉴定均见清晰亮带。
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2.SSCP配型 经预实验确定的PCR-SSCP配型实验条件见表3。1例受体配型得到9例供体的HLA-Ⅱ类基因某一位点与受体相一致，其中2例DRB1、2例DQA1、3例DQB1、2例DQP1位点与受体相应位点一致。
3.MLCs 阴性对照组cpm值为145.33±7.18，SI为1.0(设定值)，受体淋巴细胞无明显增殖反应；阳性对照组cpm值为1701.13±139.32，受体淋巴细胞呈高度增殖反应；实验组中受体淋巴细胞反应性均明显降低，与阳性对照组相比P<0.01，结果见表4。
图1 受体与供体1及供体2的PCR-SSCP图谱
表4 MLCs液闪计数结果(cpm) 组别
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X±SD
SI
RR
阴性对照组
145.33±7.18
1
0
DRB1配合
1224.30±87.32
8.42
0.66
DQA1配合
, 百拇医药
1372.34±69.19
9.44
0.74
DQB1配合
1417.31±81.22
9.75
0.80
DPB1配合
1285.87±98.72
8.84
0.71
阳性对照组
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1707.13±139.34
11.75
1.0
注：本组cpm为81.42±6.71；SI：刺激指数，SI=试验组cpm/阴性对照组cpm；RR：相对反应值RR=(阳性对照组cpm-试验组cpm)/(阳性对照组cpm-阴性对照组cpm)讨 论
一、心脏移植HLA-Ⅱ类抗原基因配型的发展及临床意义 心脏移植是治疗终末期心脏病的有效措施。术后排斥反应及晚期发生的移植心脏血管病变(CAV)是影响患者临床疗效的主要原因[2]。研究表明：供、受体之间HLA-Ⅱ类抗原的配合程度与移植后早期排斥反应程度、发生的时间及频率，晚期CAV发生率同患者存活时间有密切关系[2]。无疑，如果能够在术前选择HLA-Ⅱ类抗原一致或部分一致的供体进行移植，将会提高心脏移植的近远期疗效。但是由于供体缺血时间有限，目前HLA-Ⅱ类抗原的配型需时较长，因此在心脏移植中仅为回顾性研究。
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HLA-Ⅱ类抗原传统配型有血清学和细胞学两种，需大量标准血清及纯合子分型细胞，耗时大、精确性差(DR抗原血清学配型与基因配型相比错配率达25%[27])。随着聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用及HLA复合体等位基因碱基序列的阐明，基因配型迅速发展，目前已有近十种基因配型方法，常用的有序列特异性寡核苷酸探针配型(PCR-SSO)，限制性片段长度多态分析(RFLP)，序列特异性引物PCR扩增(PCR-SSP)，等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)配型，异源双链分析配型，反向杂交配型等[8～10]。这些配型技术原理各异，但技术条件均要求较高，需合成大量探针或需昂贵的限制性内切酶，方法建立困难，不可能在短时间内完成多个供体的筛选配型，故临床应用仍有相当距离。
二、PCR-SSCP配型的特点 PCR-SSCP分析技术基本原理：在非变性条件下，单链DNA分子自身折叠成一定空间结构，这种空间结构由单链DNA分子的碱基序列所决定。因此长度相同的单链DNA分子在非变性胶中电泳时，碱基序列不同的单链DNA泳动速度及距原点的距离均不相同，造成了不同的电泳带型(SSCP带型)[11]。可以看出PCR-SSCP配型不需确定供、受体HLA-Ⅱ类基因的基因编码，只需比较两者的SSCP带型是否一致，即可确定供、受体是否配合[5]。
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我们在预实验中观察到胶浓度、交联度、甘油含量、电泳时电压或电流强度及电泳湿度是影响SSCP对单链DNA多态性分析的主要因素，通过固定4个因素而改变一个条件，反复试验，得到较为稳定的实验条件如表3。应用这种实验条件，对127例健康人群的HLA-Ⅱ类基因4个位点DRB1、DQA1、DQB1及DQP1进行检测，与受体比较完成配型。整个配型只需10h，与其它基因配型相对比，PCR-SSCP具有快速、经济、简单的特点，尤其适用于较多样本的检测和筛选，有利于器官移植的临床应用。
三、MLCs验证 结果表明当受体淋巴细胞与经PCR-SSCP证实与受体不配合的供体淋巴细胞混合培养时，呈现出高度增殖反应；当与受体的HLA-Ⅱ类基因某一个位点相配合的供体淋巴细胞混合培养时，受体淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。这说明PCR-SSCP配型与体外混合淋巴细胞培养是一致的。Rood指出：HLA配型的实验是建立一种能够快速、准确预测MLC反应的技术[12]。本组实验结果说明：PCR-SSCP是一种快速、经济、与MLC相一致的HLA-Ⅱ类抗原基因配型的方法。不足之处是这种配型方法不能获得受体及供体的等位基因编码，可结合其他的基因检测技术加以完善。
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2000-04-18收稿, http://www.100md.com