心脏移植后外周血SRP68基因表达的研究
作者：许秀芳 孟旭 刘艳霞 李文 刘舒 周健 黄益民
单位：许秀芳(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)；孟旭(安贞医院心外科)；刘艳霞 李文 刘舒(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)；周健(中科院微生物研究所)；黄益民(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)
关键词：
心肺血管病杂志000321 对扩张性心肌病患者来说，施行原位心脏移植术是其最佳选择，移植术后排斥反应的检测是指导临床用药的关键措施，目前有许多移植术后急性排斥反应的诊断方法，但是特异性较差。本文目的是从分子水平探讨免疫排斥反应的机理和寻找外周血免疫排斥反应的早期监测指标。
1.临床资料(1)患者移植前情况 男，44岁，临床诊断为扩张性心肌病，施行原位心脏移植术，供者配型：HLAI：Al,28;B8,35;[BW6]HLAⅡ:DR13;[DR52]DQ5(1)DQ2受者配型：HLAI：All，B52(5)，62(15)[BW4 BW4] HLAⅡ:DR15(2),1304(6) DR52 DQ6(1) DQ(3)。术前超声心动图示：左心增大，室间隔肥厚，室壁运动普遍减低，左心功能减低，二尖瓣关闭不全。(2)患者移植后情况 术后1周心功能Ⅱ级；超声心动图示右心右房轻度增大，左室顺应性降低，极少量心包积液；CsA(环孢霉素A)浓度检测第一日354.59ng/ml，第三日434 ng/ml，第五日303.4ng/ml，第六日318ng/ml，第七日611.8ng/ml，第八日466.88ng/ml，第九日502.22ng/ml，第十日856ng/ml。第十天心肌活检示部分心肌肥厚，轻度急性细胞排斥反应，间质水肿，内皮细胞增生，不排除轻度体液排斥。
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2.外周血(1)外周血白细胞的分离 术前取受体和供体的外周血及受体术后1h、72h、187h、283h、305h外周血用淋巴细胞分离液分离白细胞。(2)利用RNeasy kit试剂盒(Qiagene)提取总RNA。
3.仪器PCR仪是Perkin Elmer R/Cetus公司的DNA Thermal Cycler 480,电泳仪为genomyxLRTM DNA Sequencer electrophoresis System(G×100)。
4.DD-PCR CDNA第一链合成以T7(d12)AP(anchored primer)为引物，按HIEROGLYRHTM mRNA Profile System试剂盒说明书操作，3′端锚定引物AP(2μM)2μl，加入1μg总RNA，70℃变性5min，置于冰上。再加入dNTP(250μM)2μl，5Xbuffer4μl,DTT(100mM)2μl,SuperscriptⅡ(200u/μl)0.3μl，加水补充到总反应体系20μl,42℃，10min，50℃ 60min。50℃ 60min；70℃ 15min。3′端引物(7#)5′ACGACTCACTCTATAGGGCTTTTTTTTTTTTT CG3′。差异显示PCR和差异片段回收以反转录产物为模板进行PCR，反应体系为10μl,其中3μl反转录产物，2μl dNTP(250 μm),1.5μl的水，1μl10Xbuffer,0.6μl Taq酶(10U/μl)，0.7μl的TMR-AP(fluroDD anchored primer,5μm,7#)，分别加1.75μl的ARP(9#10#11#)。反应条件：95℃，2min，1个循环；94℃，30s；50℃,30s;72℃,2min,进行4个循环；94℃，30s,60℃,30s,72℃,2min,共进行25个循环，于72℃，延伸7min。3′荧光引物(7#)5′*ACGACTCACTCTATAGGGCTTTTTTTTTTTT
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CG 3′5′引物 9# 5′ACAATTTCACAGGATAAGA
CTAGC 3′10# 5′ACAATTTCACAGGAGATCTCA
GAC 3′11# 5′ACAATTTCACAGGAACGCTAGTG
T 3′
5.变性PAGE分离差示条带与荧光显影 将10μl的PCR产物加4μl荧光上样缓冲液，95℃浓缩，加到5.6%变性聚丙烯酰胺胶(HR-1000)上，以3000V，52℃，100W恒功率电泳，4h后gemomyXSC扫锚仪荧光显示差异条带，比较差异条带。差异条带回收与二次PCR将凝胶上回收的差示表达条带，溶于30μl TE缓冲液中，37℃温育60min。取3μl作模板，按下述反应体积：4μl dNTP(250μm),5′端引物和3′端引物各2μm 2μl，2μl10Xbuffer,0.06μlTaq酶(10/μ)。反应条件：95℃，2min,1个循环；95℃，30s;60℃,30s;72℃,2min,进行29个循环；72℃，7min3′引物(T7 promotor)5′ GTAATACGACTCACTATAGGGC(T)12GG 3′5′引物(M13 reverse)5′ AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3′
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6.克隆测序 用PGEM-T easy克隆试剂盒(Promega)对差异表达的cDNA片段进行连接和克隆，具体操作参照试剂盒提供的方法进行。核酸序列分析，双链DNA测序采用Big Dye Terminator试剂盒，在ABI PRISM 377+96型自动测序仪进行测序。测序后将差示cDNA的核苷酸序列与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较和读框分析。
结果 1.mRNA差示条带 利用差异显示PCR技术分析移植后外周血白细胞基因表达的差异，共选用了1个3′端锚定引物(dT12CG)与3个5′端随机引物共同进行DDPCR反应，在聚丙烯酰胺凝胶显示的cDNA条带中有10条cDNA条带的表达量在移植前后发生变化(图1)，其中第七条带是特殊的，这一条带基因在术前表达，而术后不表达。
2.序列分析 见图2。将第七条带cDNA的核苷酸序列与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较和读框分析，结果显示与SRP68基因有95%同源性。
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图1 DDPCR凝胶电泳显影
注：A供体，B受体术前，CDEFGH分别为1、72、187、283、305h(1～10)分别为移植前后表达量改变的cDNA条带
图2 SRP68部分核苷酸序列分析
讨论 mRNA差异显示技术已广泛用于鉴定和克隆真核生物不同细胞之间、不同器官之间以及不同环境条件下差异表达的基因，与cDNA文库差示筛选和减法杂交等技术相比，DD-PCR具有简便、快速、灵敏度高等优点。本文应用DD-PCR技术检测心脏移植后外周血白细胞基因的表达。外周血检查与活组织检查方法相比具有对移植器官无创伤、患者痛苦少等优点，在探讨基因在移植中的作用以及对排斥反应的诊断有一定的应用价值。移植后第十天心肌活检示部分心肌肥厚，轻度急性细胞排斥反应，间质水肿，内皮细胞增生，轻度体液排斥，而DD-PCR结果显示外周血特殊基因有变化：SRP68基因术前表达，术后不表达，在急性排斥反应发生时仍不表达，活检结果与基因变化是否相关值得探讨。
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SRP68是Politz首次测得的，SRP是信号识别体，它是一种核糖核酸蛋白质构成的颗粒，它的沉降系数为11S，含有7SRNA和6条分子量为72K、68K、54K、19K、14K以及9K的多肽。SRP能专一地识别带有信号肽段的核糖体，它与这类核糖体的信号肽结合后，多肽合成暂时中止，随后，SRP将带有信号肽的核糖体引向内质网表面，与分布其上的停靠蛋白(又称信号识别体受体)相结合。停靠蛋白通过与SRP作用使暂时抑制的翻译过程恢复进行，它可引起内质网上核糖体受体蛋白的聚集，这种受体具有形成孔道的功能，可使翻译出来的肽链直接进入内质网腔，进入内质网的蛋白质在信号肽切除之后即进入折叠、糖基化及二硫键形成等加工过程。总之SRP68基因是蛋白表达调控元件。
移植后SRP68不表达，是否会影响多肽的合成和加工或细胞因子的表达，SRP68表达的变化是否是移植后环孢霉素药物作用(CsA能抑制calcineurin的丝氨酸磷酸酯酶活性，抑制胞浆中对CsA敏感的NF-AT的活化，从而阻断IL-2基因的活化)，或是排斥反应其它转录因子的作用所致有待进一步的研究证实。
北京市卫生局重点学科基金资助项目
2000-03-06收稿，2000-04-29修回, http://www.100md.com
单位：许秀芳(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)；孟旭(安贞医院心外科)；刘艳霞 李文 刘舒(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)；周健(中科院微生物研究所)；黄益民(北京市心肺血管疾病研究所，100029，细胞免疫室)
关键词：
心肺血管病杂志000321 对扩张性心肌病患者来说，施行原位心脏移植术是其最佳选择，移植术后排斥反应的检测是指导临床用药的关键措施，目前有许多移植术后急性排斥反应的诊断方法，但是特异性较差。本文目的是从分子水平探讨免疫排斥反应的机理和寻找外周血免疫排斥反应的早期监测指标。
1.临床资料(1)患者移植前情况 男，44岁，临床诊断为扩张性心肌病，施行原位心脏移植术，供者配型：HLAI：Al,28;B8,35;[BW6]HLAⅡ:DR13;[DR52]DQ5(1)DQ2受者配型：HLAI：All，B52(5)，62(15)[BW4 BW4] HLAⅡ:DR15(2),1304(6) DR52 DQ6(1) DQ(3)。术前超声心动图示：左心增大，室间隔肥厚，室壁运动普遍减低，左心功能减低，二尖瓣关闭不全。(2)患者移植后情况 术后1周心功能Ⅱ级；超声心动图示右心右房轻度增大，左室顺应性降低，极少量心包积液；CsA(环孢霉素A)浓度检测第一日354.59ng/ml，第三日434 ng/ml，第五日303.4ng/ml，第六日318ng/ml，第七日611.8ng/ml，第八日466.88ng/ml，第九日502.22ng/ml，第十日856ng/ml。第十天心肌活检示部分心肌肥厚，轻度急性细胞排斥反应，间质水肿，内皮细胞增生，不排除轻度体液排斥。
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2.外周血(1)外周血白细胞的分离 术前取受体和供体的外周血及受体术后1h、72h、187h、283h、305h外周血用淋巴细胞分离液分离白细胞。(2)利用RNeasy kit试剂盒(Qiagene)提取总RNA。
3.仪器PCR仪是Perkin Elmer R/Cetus公司的DNA Thermal Cycler 480,电泳仪为genomyxLRTM DNA Sequencer electrophoresis System(G×100)。
4.DD-PCR CDNA第一链合成以T7(d12)AP(anchored primer)为引物，按HIEROGLYRHTM mRNA Profile System试剂盒说明书操作，3′端锚定引物AP(2μM)2μl，加入1μg总RNA，70℃变性5min，置于冰上。再加入dNTP(250μM)2μl，5Xbuffer4μl,DTT(100mM)2μl,SuperscriptⅡ(200u/μl)0.3μl，加水补充到总反应体系20μl,42℃，10min，50℃ 60min。50℃ 60min；70℃ 15min。3′端引物(7#)5′ACGACTCACTCTATAGGGCTTTTTTTTTTTTT CG3′。差异显示PCR和差异片段回收以反转录产物为模板进行PCR，反应体系为10μl,其中3μl反转录产物，2μl dNTP(250 μm),1.5μl的水，1μl10Xbuffer,0.6μl Taq酶(10U/μl)，0.7μl的TMR-AP(fluroDD anchored primer,5μm,7#)，分别加1.75μl的ARP(9#10#11#)。反应条件：95℃，2min，1个循环；94℃，30s；50℃,30s;72℃,2min,进行4个循环；94℃，30s,60℃,30s,72℃,2min,共进行25个循环，于72℃，延伸7min。3′荧光引物(7#)5′*ACGACTCACTCTATAGGGCTTTTTTTTTTTT
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CG 3′5′引物 9# 5′ACAATTTCACAGGATAAGA
CTAGC 3′10# 5′ACAATTTCACAGGAGATCTCA
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5.变性PAGE分离差示条带与荧光显影 将10μl的PCR产物加4μl荧光上样缓冲液，95℃浓缩，加到5.6%变性聚丙烯酰胺胶(HR-1000)上，以3000V，52℃，100W恒功率电泳，4h后gemomyXSC扫锚仪荧光显示差异条带，比较差异条带。差异条带回收与二次PCR将凝胶上回收的差示表达条带，溶于30μl TE缓冲液中，37℃温育60min。取3μl作模板，按下述反应体积：4μl dNTP(250μm),5′端引物和3′端引物各2μm 2μl，2μl10Xbuffer,0.06μlTaq酶(10/μ)。反应条件：95℃，2min,1个循环；95℃，30s;60℃,30s;72℃,2min,进行29个循环；72℃，7min3′引物(T7 promotor)5′ GTAATACGACTCACTATAGGGC(T)12GG 3′5′引物(M13 reverse)5′ AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3′
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6.克隆测序 用PGEM-T easy克隆试剂盒(Promega)对差异表达的cDNA片段进行连接和克隆，具体操作参照试剂盒提供的方法进行。核酸序列分析，双链DNA测序采用Big Dye Terminator试剂盒，在ABI PRISM 377+96型自动测序仪进行测序。测序后将差示cDNA的核苷酸序列与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较和读框分析。
结果 1.mRNA差示条带 利用差异显示PCR技术分析移植后外周血白细胞基因表达的差异，共选用了1个3′端锚定引物(dT12CG)与3个5′端随机引物共同进行DDPCR反应，在聚丙烯酰胺凝胶显示的cDNA条带中有10条cDNA条带的表达量在移植前后发生变化(图1)，其中第七条带是特殊的，这一条带基因在术前表达，而术后不表达。
2.序列分析 见图2。将第七条带cDNA的核苷酸序列与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较和读框分析，结果显示与SRP68基因有95%同源性。
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图1 DDPCR凝胶电泳显影
注：A供体，B受体术前，CDEFGH分别为1、72、187、283、305h(1～10)分别为移植前后表达量改变的cDNA条带
图2 SRP68部分核苷酸序列分析
讨论 mRNA差异显示技术已广泛用于鉴定和克隆真核生物不同细胞之间、不同器官之间以及不同环境条件下差异表达的基因，与cDNA文库差示筛选和减法杂交等技术相比，DD-PCR具有简便、快速、灵敏度高等优点。本文应用DD-PCR技术检测心脏移植后外周血白细胞基因的表达。外周血检查与活组织检查方法相比具有对移植器官无创伤、患者痛苦少等优点，在探讨基因在移植中的作用以及对排斥反应的诊断有一定的应用价值。移植后第十天心肌活检示部分心肌肥厚，轻度急性细胞排斥反应，间质水肿，内皮细胞增生，轻度体液排斥，而DD-PCR结果显示外周血特殊基因有变化：SRP68基因术前表达，术后不表达，在急性排斥反应发生时仍不表达，活检结果与基因变化是否相关值得探讨。
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SRP68是Politz首次测得的，SRP是信号识别体，它是一种核糖核酸蛋白质构成的颗粒，它的沉降系数为11S，含有7SRNA和6条分子量为72K、68K、54K、19K、14K以及9K的多肽。SRP能专一地识别带有信号肽段的核糖体，它与这类核糖体的信号肽结合后，多肽合成暂时中止，随后，SRP将带有信号肽的核糖体引向内质网表面，与分布其上的停靠蛋白(又称信号识别体受体)相结合。停靠蛋白通过与SRP作用使暂时抑制的翻译过程恢复进行，它可引起内质网上核糖体受体蛋白的聚集，这种受体具有形成孔道的功能，可使翻译出来的肽链直接进入内质网腔，进入内质网的蛋白质在信号肽切除之后即进入折叠、糖基化及二硫键形成等加工过程。总之SRP68基因是蛋白表达调控元件。
移植后SRP68不表达，是否会影响多肽的合成和加工或细胞因子的表达，SRP68表达的变化是否是移植后环孢霉素药物作用(CsA能抑制calcineurin的丝氨酸磷酸酯酶活性，抑制胞浆中对CsA敏感的NF-AT的活化，从而阻断IL-2基因的活化)，或是排斥反应其它转录因子的作用所致有待进一步的研究证实。
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2000-03-06收稿，2000-04-29修回, http://www.100md.com