高血压大鼠心脏和血管丝裂素活化蛋白激酶与其磷酸酶-1的表达
作者：庞永正 许松 柴三葆 彭旭 佟利家 唐朝枢
单位：庞永正 许松 (北京医科大学第一医院中心实验室)；柴三葆 彭旭 佟利家 唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所 北京100034)
关键词：高血压；丝裂素活化蛋白激酶；丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶
高血压杂志000430
摘要:目的：探讨MAPK与MKP-1在高血压心血管重塑中的可能作用。
方法：应用Western-blot 的方法观察了自发性高血压大鼠(SHR)及WKY大鼠心脏和血管丝裂素活化蛋白激酶及丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶表达的改变。
结果：(1)WKY大鼠心脏中未见有丝裂素活化蛋白激酶的表达，而SHR心脏中检测到了丝裂素活化蛋白激酶的表达；并且SHR血管中丝裂素活化蛋白激酶的表达较WKY大鼠增强90%(P<0.01);(2)SHR心脏及血管中丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1的表达较WKY大鼠分别降低53%及45% (P均<0.01)。
, 百拇医药
结论：SHR心脏和血管重塑的发生除与丝裂素活化蛋白激酶表达增强有关外，可能还与丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1的表达下降有关。
中图分类号：R541.3；Q556；Q493.2 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(2000)11-0343-03
The Changes of Mitogen-Activated Protein Kinase and Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Cardiac and Vascular Smooth Muscles of Hypertensive Rats
CHAI San-bao PENG Xu Tong Li-jia TANG Chao-shu
, http://www.100md.com
(Institute of Cardiovascular Research,The First Hospital,Bei Jing Medical University,100034 China)
XU Song PANG Yong-zheng
(The Central Lab of The First Hospital,Bei Jing Medical University 100034, China)
Abstract:Aim: The purpose of this study is to investigate the expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 in cardiac and vascular smooth muscles of SHR.
, 百拇医药
Methods:The expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase-phosphatase-1 were studied by Western-blot.
Results:The expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 were found in cardiac muscles of SHR, but not in cardiac muscle of WKY rat. Meanwhile,the expression of mitogen-activated protein kinase in vascular smooth muscles of SHR was 108% higher than that of WKY rat (P<0.01). Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 expression in cardiac and vascular smooth muscles of SHR was marked decreased by 53% and 45% (all P<0.01), compared with WKY rat.
, 百拇医药
Conclusions:The results suggested that the remodelling of cardiac and vascular smooth muscles in SHR might be related to the increased expression of mitogen-activated protein kinase and the decreased expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1.
Key words: hypertension; mitogen-activated protein kinase; mitogen-activated protein kinase phosphatase-1
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的过度活化与心肌细胞肥大、平滑肌细胞增殖密切相关[1,2]。MAPK介导的信号通路是细胞外生物信号引起细胞核反应的重要通路，在细胞生长、增殖、分化的调节中起到重要作用，目前研究发现其家族成员主要有细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)及p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase ,p38MAPK)。其中ERK途径与细胞肥大、增殖反应最密切，在高血压时是高表达[1,2]。丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)是丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶家族成员之一，能够使MAPK上的苏氨酸/酪氨酸脱磷酸化而使MAPK失活，作为MAPK活性的重要调节者之一[3]，MKP-1与MAPK在高血压发病过程中的相互作用尚不清楚。本工作用Western-blot方法观察自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat , SHR)及对照WKY大鼠心脏和血管ERK-1与MKP-1的变化，以探讨MAPK与MKP-1在高血压心血管重塑中的可能作用。
, 百拇医药
对象与方法：
1 动物及药品SHR及WKY大鼠(体重250-280g)由北京阜外医院动物中心提供。ERK-1单抗及MKP-1多抗及Western-blot有关试剂均购自SIGMA公司，其余为分析纯产品。
2 血压及心系数测定:
应用RBP-1型大鼠血压计，测定SHR及WKY大鼠(各6只)尾动脉压，连续3日取平均值。测定血压后，将大鼠处死，速取心脏，以滤纸吸干称重，计算心系数[心重(mg)/体重(g)]比值。
3 ERK-1及MKP-1水平的Western-blot检测:
参照文献[4，5]加以改进，取大鼠心脏及胸腹主动脉，剥离血管外结缔组织，将心脏和血管分别剪碎，各加入1ml改良的RIPA裂解液(Tris-HCL 50 mmol/L, pH 7.5; NaCL 150 mmol/L; NP-40 1%; 脱氧胆酸钠 0.5% ;SDS 0.1%; EDTA 1 mmol/L; PMSF 1 mmol/L; Leupeptin 2 μg/ml)，冰浴条件下进行组织匀浆；4℃，10,000g离心10min，弃除沉淀，用考马斯亮蓝对上清液进行蛋白定量，ERK-1检测取10 μg蛋白，MKP-1的检测取40 μg蛋白，分别加入上样缓冲液，煮沸3 min后进行SDS-PAGE电泳，转膜，抗ERK-1兔抗鼠单抗及抗MKP-1兔抗鼠多克隆抗体分别按照1∶1000及1∶2500稀释进行抗原抗体结合反应，羊抗兔二抗均采用1∶10，000稀释，利用化学发光法进行显色反应，结果用光密度扫描分析。
, 百拇医药
4 统计学处理： 数据以均数±标准差(
±s)表示，采用组间t检验。
结果：
1 血压及心系数测定：
SHR组的平均血压(kPa)较 WKY大鼠组升高23%(9.81±0.84 mmHg vs 7.97±0.80 mmHg, P<0.05)。心系数平均增加35%(4.20±0.14 vs 3.10±0.55, P<0.01)。
2 ERK-1蛋白含量的半定量分析:
蛋白印迹杂交结果如图1显示，WKY大鼠心脏未检测到ERK-1蛋白，而SHR心脏ERK-1明显高表达，SHR血管ERK-1蛋白与WKY大鼠血管相比也明显增加90%(P<0.01)。
, 百拇医药
图 1 SHR和WKY大鼠心脏和血管ERK-1表达的改变
Fig 1 The changes of ERK-1 in heart and vascular of SHR and WKY
*:P<0.01 vs Wv；v:vascular,h:heart,W:WKY,S:SHR
3 MKP-1蛋白含量的半定量分析:
蛋白印迹杂交结果如图2显示，SHR组大鼠心脏及血管中MKP-1表达与WKY大鼠组相比较，分别降低53%和45% (P均<0.01)。SHR及WKY大鼠心脏ERK-1与MKP-1的比值分别为0.16±0.13和0，血管ERK-1与MKP-1的比值分别为 0.42±0.09和0.05±0.06。
, 百拇医药
图 2： SHR和WKY大鼠心脏和血管MKP-1表达的改变
*:P<0.01 vs Wv；v:vascular,h:heart,W:WKY,S:SHR
讨论：
许多具有促丝裂作用的胞外刺激信号与细胞膜上的受体结合后活化MAPK通路的级联反应:MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAPKK)→MAPK，MAPK上的苏氨酸/酪氨酸磷酸化而活化MAPK，活化的(磷酸化的)MAPK转位入核后引起肥大相关基因表达，促进细胞增生或肥大。近年研究表明，MAPK信号通路受到MKPs的去磷酸化调节，发现MKPs家族有MKP-1、MKP-2、MKP-3、MKP-4、MKP-5、hVH-3、hVH-5、PAG-1、Pyst-2九个成员[6]，其中MKP-1使磷酸化的MAPK去磷酸化而失活。心肌细胞肥大与平滑肌细胞增殖是高血压发展过程中的重要病理变化，其细胞分子机制尚未完全阐明。本实验观察到成年WKY大鼠ERK-1在心脏无明显表达,在血管呈低表达;高血压和心肌肥厚的SHR,其心脏和血管ERK-1表达都明显增加(P<0.01) 。反之,SHR心脏和血管MKP-1表达明显低于WKY大鼠(P<0.01) 。以至于心血管组织ERK-1/MKP-1的比值在SHR较WKY大鼠显著增加(P<0.01) ,表明SHR心血管组织促增殖肥大的MAPK系统较其失活的MKP系统占优势。MAPK通路是将细胞因子、生长因子等丝裂原信号传递到核内引起细胞增殖、分化的主要信号传导系统之一，许多体液因素如内皮素、血管紧张素、儿茶酚胺等都可使其活化[8]，MKP-1作为MAPK活性的重要调节者之一，它与MAPK之间的动态平衡对于心血管组织稳态维持有着十分重要的意义，MAPK与MKP-1比例失衡,MAPK的去磷酸化作用减弱可能是高血压时促进心血管重塑发病机制之一。高血压MAPK和MKP-1表达改变的机制目前尚不清楚, Begum等[9]在胰岛素抵抗的SHR血管平滑肌细胞上发现胰岛素引起MAPK通路的激活与胰岛素引起酪氨酸磷酸化有关,而MKP-1低表达可能与其自身基因表达缺陷有关,其确切机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题 No 39970295
作者简介：柴三葆(女，28岁)：医师
参考文献：
[1] Qingbo Xu,Timothy W.Fawcett, M G, et al. Induction of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 during acute hypertension[J]. J Hypertens 1997,30:106-111.
[2] 李淑敏 , 胡大一, 汪丽惠, 等. 高血压心肌肥大丝裂素活化蛋白激酶的活性[J].北京医科大学学报 1996,28:199.
[3] Hong Sun, Catherine H, Charles, L F, et al. MKP-1(3CH134),an immediate early gene product,is a dual specificity phosphatase that dephosphorylates MAP kinase in vivo[J]. J Cell 1993,75:487-493.
, http://www.100md.com
[4] Zheng CH, Zheng X, Bian ZC, et al. Differential regulation of Pyk2 and focal adhesion kinase(FAK)[J]. J Biol Chem 1998,273:2384.
[5] Gunter D, Vif H, Yunxia W, et al. Diverse effects of heparin on mitogen-activated protein kinase-dependent siganal transduction in vascular smooth muscle cells[J].Cirs Res 1997,81:17
[6] Brondello JM, Brunet A, Pouyssegur J, et al.The dual specificity mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 and -2 are induced by the p42/p44mapk cascade[J].J Biol Chem 1997,272:1368-1376.
, 百拇医药
[7] Tanoue T, Moriguchi T, Nishida E, et al. Molecular cloning and characterization of a novel dual specificity phosphatase,MKP-5[J].J Biol Chem 1999,274:19949.
[8] 李田昌 田青 赵冬,等. 肾上腺髓质素抑制内皮素的促血管平滑肌细胞增殖作用[J].高血压杂志 1996,4:171.
[9] Begum N, Song Y, Rienzie J, et al. Vascular smooth muscle cell growth and insulin regulation of mitogen-activated protein kinase in hypertension[J]. Am J Physiol 1998,275:C42.
收稿日期：2000-07-16, 百拇医药
单位：庞永正 许松 (北京医科大学第一医院中心实验室)；柴三葆 彭旭 佟利家 唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所 北京100034)
关键词：高血压；丝裂素活化蛋白激酶；丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶
高血压杂志000430
摘要:目的：探讨MAPK与MKP-1在高血压心血管重塑中的可能作用。
方法：应用Western-blot 的方法观察了自发性高血压大鼠(SHR)及WKY大鼠心脏和血管丝裂素活化蛋白激酶及丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶表达的改变。
结果：(1)WKY大鼠心脏中未见有丝裂素活化蛋白激酶的表达，而SHR心脏中检测到了丝裂素活化蛋白激酶的表达；并且SHR血管中丝裂素活化蛋白激酶的表达较WKY大鼠增强90%(P<0.01);(2)SHR心脏及血管中丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1的表达较WKY大鼠分别降低53%及45% (P均<0.01)。
, 百拇医药
结论：SHR心脏和血管重塑的发生除与丝裂素活化蛋白激酶表达增强有关外，可能还与丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1的表达下降有关。
中图分类号：R541.3；Q556；Q493.2 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(2000)11-0343-03
The Changes of Mitogen-Activated Protein Kinase and Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Cardiac and Vascular Smooth Muscles of Hypertensive Rats
CHAI San-bao PENG Xu Tong Li-jia TANG Chao-shu
, http://www.100md.com
(Institute of Cardiovascular Research,The First Hospital,Bei Jing Medical University,100034 China)
XU Song PANG Yong-zheng
(The Central Lab of The First Hospital,Bei Jing Medical University 100034, China)
Abstract:Aim: The purpose of this study is to investigate the expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 in cardiac and vascular smooth muscles of SHR.
, 百拇医药
Methods:The expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase-phosphatase-1 were studied by Western-blot.
Results:The expression of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 were found in cardiac muscles of SHR, but not in cardiac muscle of WKY rat. Meanwhile,the expression of mitogen-activated protein kinase in vascular smooth muscles of SHR was 108% higher than that of WKY rat (P<0.01). Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 expression in cardiac and vascular smooth muscles of SHR was marked decreased by 53% and 45% (all P<0.01), compared with WKY rat.
, 百拇医药
Conclusions:The results suggested that the remodelling of cardiac and vascular smooth muscles in SHR might be related to the increased expression of mitogen-activated protein kinase and the decreased expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1.
Key words: hypertension; mitogen-activated protein kinase; mitogen-activated protein kinase phosphatase-1
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的过度活化与心肌细胞肥大、平滑肌细胞增殖密切相关[1,2]。MAPK介导的信号通路是细胞外生物信号引起细胞核反应的重要通路，在细胞生长、增殖、分化的调节中起到重要作用，目前研究发现其家族成员主要有细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)及p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase ,p38MAPK)。其中ERK途径与细胞肥大、增殖反应最密切，在高血压时是高表达[1,2]。丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)是丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶家族成员之一，能够使MAPK上的苏氨酸/酪氨酸脱磷酸化而使MAPK失活，作为MAPK活性的重要调节者之一[3]，MKP-1与MAPK在高血压发病过程中的相互作用尚不清楚。本工作用Western-blot方法观察自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat , SHR)及对照WKY大鼠心脏和血管ERK-1与MKP-1的变化，以探讨MAPK与MKP-1在高血压心血管重塑中的可能作用。
, 百拇医药
对象与方法：
1 动物及药品SHR及WKY大鼠(体重250-280g)由北京阜外医院动物中心提供。ERK-1单抗及MKP-1多抗及Western-blot有关试剂均购自SIGMA公司，其余为分析纯产品。
2 血压及心系数测定:
应用RBP-1型大鼠血压计，测定SHR及WKY大鼠(各6只)尾动脉压，连续3日取平均值。测定血压后，将大鼠处死，速取心脏，以滤纸吸干称重，计算心系数[心重(mg)/体重(g)]比值。
3 ERK-1及MKP-1水平的Western-blot检测:
参照文献[4，5]加以改进，取大鼠心脏及胸腹主动脉，剥离血管外结缔组织，将心脏和血管分别剪碎，各加入1ml改良的RIPA裂解液(Tris-HCL 50 mmol/L, pH 7.5; NaCL 150 mmol/L; NP-40 1%; 脱氧胆酸钠 0.5% ;SDS 0.1%; EDTA 1 mmol/L; PMSF 1 mmol/L; Leupeptin 2 μg/ml)，冰浴条件下进行组织匀浆；4℃，10,000g离心10min，弃除沉淀，用考马斯亮蓝对上清液进行蛋白定量，ERK-1检测取10 μg蛋白，MKP-1的检测取40 μg蛋白，分别加入上样缓冲液，煮沸3 min后进行SDS-PAGE电泳，转膜，抗ERK-1兔抗鼠单抗及抗MKP-1兔抗鼠多克隆抗体分别按照1∶1000及1∶2500稀释进行抗原抗体结合反应，羊抗兔二抗均采用1∶10，000稀释，利用化学发光法进行显色反应，结果用光密度扫描分析。
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4 统计学处理： 数据以均数±标准差(
±s)表示，采用组间t检验。结果：
1 血压及心系数测定：
SHR组的平均血压(kPa)较 WKY大鼠组升高23%(9.81±0.84 mmHg vs 7.97±0.80 mmHg, P<0.05)。心系数平均增加35%(4.20±0.14 vs 3.10±0.55, P<0.01)。
2 ERK-1蛋白含量的半定量分析:
蛋白印迹杂交结果如图1显示，WKY大鼠心脏未检测到ERK-1蛋白，而SHR心脏ERK-1明显高表达，SHR血管ERK-1蛋白与WKY大鼠血管相比也明显增加90%(P<0.01)。
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图 1 SHR和WKY大鼠心脏和血管ERK-1表达的改变
Fig 1 The changes of ERK-1 in heart and vascular of SHR and WKY
*:P<0.01 vs Wv；v:vascular,h:heart,W:WKY,S:SHR
3 MKP-1蛋白含量的半定量分析:
蛋白印迹杂交结果如图2显示，SHR组大鼠心脏及血管中MKP-1表达与WKY大鼠组相比较，分别降低53%和45% (P均<0.01)。SHR及WKY大鼠心脏ERK-1与MKP-1的比值分别为0.16±0.13和0，血管ERK-1与MKP-1的比值分别为 0.42±0.09和0.05±0.06。
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图 2： SHR和WKY大鼠心脏和血管MKP-1表达的改变
*:P<0.01 vs Wv；v:vascular,h:heart,W:WKY,S:SHR
讨论：
许多具有促丝裂作用的胞外刺激信号与细胞膜上的受体结合后活化MAPK通路的级联反应:MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAPKK)→MAPK，MAPK上的苏氨酸/酪氨酸磷酸化而活化MAPK，活化的(磷酸化的)MAPK转位入核后引起肥大相关基因表达，促进细胞增生或肥大。近年研究表明，MAPK信号通路受到MKPs的去磷酸化调节，发现MKPs家族有MKP-1、MKP-2、MKP-3、MKP-4、MKP-5、hVH-3、hVH-5、PAG-1、Pyst-2九个成员[6]，其中MKP-1使磷酸化的MAPK去磷酸化而失活。心肌细胞肥大与平滑肌细胞增殖是高血压发展过程中的重要病理变化，其细胞分子机制尚未完全阐明。本实验观察到成年WKY大鼠ERK-1在心脏无明显表达,在血管呈低表达;高血压和心肌肥厚的SHR,其心脏和血管ERK-1表达都明显增加(P<0.01) 。反之,SHR心脏和血管MKP-1表达明显低于WKY大鼠(P<0.01) 。以至于心血管组织ERK-1/MKP-1的比值在SHR较WKY大鼠显著增加(P<0.01) ,表明SHR心血管组织促增殖肥大的MAPK系统较其失活的MKP系统占优势。MAPK通路是将细胞因子、生长因子等丝裂原信号传递到核内引起细胞增殖、分化的主要信号传导系统之一，许多体液因素如内皮素、血管紧张素、儿茶酚胺等都可使其活化[8]，MKP-1作为MAPK活性的重要调节者之一，它与MAPK之间的动态平衡对于心血管组织稳态维持有着十分重要的意义，MAPK与MKP-1比例失衡,MAPK的去磷酸化作用减弱可能是高血压时促进心血管重塑发病机制之一。高血压MAPK和MKP-1表达改变的机制目前尚不清楚, Begum等[9]在胰岛素抵抗的SHR血管平滑肌细胞上发现胰岛素引起MAPK通路的激活与胰岛素引起酪氨酸磷酸化有关,而MKP-1低表达可能与其自身基因表达缺陷有关,其确切机制尚有待进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助课题 No 39970295
作者简介：柴三葆(女，28岁)：医师
参考文献：
[1] Qingbo Xu,Timothy W.Fawcett, M G, et al. Induction of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 during acute hypertension[J]. J Hypertens 1997,30:106-111.
[2] 李淑敏 , 胡大一, 汪丽惠, 等. 高血压心肌肥大丝裂素活化蛋白激酶的活性[J].北京医科大学学报 1996,28:199.
[3] Hong Sun, Catherine H, Charles, L F, et al. MKP-1(3CH134),an immediate early gene product,is a dual specificity phosphatase that dephosphorylates MAP kinase in vivo[J]. J Cell 1993,75:487-493.
, http://www.100md.com
[4] Zheng CH, Zheng X, Bian ZC, et al. Differential regulation of Pyk2 and focal adhesion kinase(FAK)[J]. J Biol Chem 1998,273:2384.
[5] Gunter D, Vif H, Yunxia W, et al. Diverse effects of heparin on mitogen-activated protein kinase-dependent siganal transduction in vascular smooth muscle cells[J].Cirs Res 1997,81:17
[6] Brondello JM, Brunet A, Pouyssegur J, et al.The dual specificity mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 and -2 are induced by the p42/p44mapk cascade[J].J Biol Chem 1997,272:1368-1376.
, 百拇医药
[7] Tanoue T, Moriguchi T, Nishida E, et al. Molecular cloning and characterization of a novel dual specificity phosphatase,MKP-5[J].J Biol Chem 1999,274:19949.
[8] 李田昌 田青 赵冬,等. 肾上腺髓质素抑制内皮素的促血管平滑肌细胞增殖作用[J].高血压杂志 1996,4:171.
[9] Begum N, Song Y, Rienzie J, et al. Vascular smooth muscle cell growth and insulin regulation of mitogen-activated protein kinase in hypertension[J]. Am J Physiol 1998,275:C42.
收稿日期：2000-07-16, 百拇医药