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编号:10255702
黄芪总提取物抗衰老作用的实验研究
http://www.100md.com 2003年8月25日 《中国临床药理学与治疗学》 2000年第4期
     作者:雷红 王斌 李卫平 杨雁 周爱武 陈敏珠

    单位:雷红(安徽省卫生干部进修学校,合肥230061);王斌(北京协和医院风湿免疫学博士后);李卫平 杨雁 周爱武 陈敏珠(安徽医科大学临床药理研究所)

    关键词:黄芪衰老D;半乳糖脂质过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶锰;超氧化物歧化酶谷胱甘肽

    中国临床药理学与治疗学000403

    目的研究黄芪总提取物(totalextractofastragalus,TEA)延缓衰老的作用机理。方法采用小鼠D_半乳糖(D_galactose,D_gal)人工衰老模型和自然衰老模型(17mon),从氧自由基代谢方面进行研究。结果TEA(40mg.kg-1.d-1ig×10wk)可明显降低D_gal衰老小鼠过高的MDA含量,上调其过低的抗氧化酶(GSHPX、Mn_SOD)活性和GSH/GSSG比值。TEA(40mg.kg-1.d-1ig×3mon)对17mon小鼠亦有类似作用。结论TEA对D_gal衰老小鼠和由中年期(14mon)进入老前期(17mon)小鼠的自然衰老进程有明显的延缓作用,可能与其抗氧化作用有关。
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    中图分类号R965

    Anti_oxidative effect of total extract of astragalus(TEA) on aging mice

    LEI Hong WANG Bin LI Wei_Ping YANG Yan ZHOU Ai_Wu CHEN Min_Zhu

    (Institute of Clinical Pharmacology,Anhui Medical University,Hefei 230032)

    Aim To study the mechanism of the anti_aging effect of total extract of astragalus(TEA) in mice. Methods MDA content, the activities of Mn_SOD and GSHpx and the reduced to oxidized glutathione (GSH/GSSG) ratio in mitochondria of D_galactose(D_gal) treated mice and 17_month_old mice were measured. Results Treatment with TEA(40 mg. kg- 1. d- 1 ig) for 10 wk would lower the content of MDA and restore activities of Mn_SOD,GSHpx and GSH/GSSG ratio in mitochondria of D_gal treated mice.Treatment with TEA (40 mg. kg- 1 . d- 1 ig) for 3 mon had the same effect on 17_month_old mice.Conclusion TEA has anti_aging effect on D_gal treated mice and 17_month_old mice significantly, probably being related to its anti_oxidative effect.
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    Key words astragalus; aging; D_galactose; LPO; GSHpx; Mn_SOD; glutathione

    黄芪是一种常用中药,始载于《神农本草经》,为中医传统的重要益气药。现代药理研究报道,黄芪有抗衰老、免疫调节、促进造血、加强心肌收缩力、保护肾功能等多方面的药理作用[1,2],在清除自由基作用方面亦有报道[3]。黄芪总提取物(TEA)是从膜荚黄芪根中提取的有效成份,其中黄芪总甙(totalsaponinsofastragalus,TSA)含量占50%以上,已有报道TSA有良好的清除氧自由基作用[4],我们研究亦表明,TEA具有抗氧化、免疫调节与抗炎等作用(待发表)。已知氧自由基和免疫功能减退可能参与衰老进程[5],本文观察TEA在延缓小鼠自然或人工衰老进程中的抗氧化作用。

    1 材料与方法
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    1.1动物昆明种小白鼠,♂,,3~4mon龄,100只,体重(30±3)g;14mon龄,40只,体重(55±4)g,均购于安徽医科大学实验动物中心,合格证号为:皖医实动准第01号。

    1.2药品TEA由江苏药物研究所植化室提供,黄芪总甙含量占50%以上。用1%羧甲基纤维素钠(CMC_Na)制成混悬液,供ig给药;维生素E(VE),Merck公司产品,用少量无水乙醇溶解后,再用1%CMC_Na制成混悬液,供ig给药(乙醇终浓度<0.2%);D_半乳糖(D_gal),Sigma公司产品,用生理盐水配成浓度为0.5%溶液,高压灭菌,置4℃冰箱贮存备用。

    1.3试剂硫代巴比妥酸(TBA),上海试剂二厂产品;三氯乙酸(TCA),如皋市化学试剂厂;1,1,3,3_四乙氧基丙烷(TEP),5,5′_二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB),均为Fluka产品;还原型谷胱甘肽(GSH,AR级),上海试剂三厂产品;氧化型谷胱甘肽(GSSG),上海丽珠东风生物技术有限公司;邻苯二甲醛(OPT),上海试剂一厂产品;牛血清白蛋白,N_乙基马来酰亚胺(NEM)均为Sigma公司产品;酚试剂,上海市医学化验所产品;SOD测定试剂盒,南京建成生物工程研究所产品。
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    1.4仪器GL20A型全自动高速冷冻离心机,湖南仪器总厂离心机厂生产;Hitach_650型荧光分光光度计,日本日立公司产品;721分光光度计,上海第三分析仪器厂产品;7530_G紫外分光光度计,上海雷磁仪器厂;CPS_1A超声波粉碎机,上海超声波仪器厂;内切式组织匀浆机,浙西机械厂。

    1.5方法

    1.5.1D_gal衰老小鼠模型的制备[6]小鼠scD_gal40mg.kg-1,隔日1次,共10wk。每周称体重1次,并按此调整D_gal剂量。

    1.5.2肝、脑细胞中线粒体的制备[7]眼球放血处死小鼠,立即取出肝脏和脑组织,分别用冰冷的生理盐水制成10%匀浆(W/V),4℃离心,(3500r.min-1,10min),取上清液,再4℃离心(11812r.min-1,15min),沉淀为线粒体。将线粒体悬于生理盐水中,-20℃贮存待测。一部分线粒体悬液经CPS_1A超声波粉碎机粉碎,60μA,5s/次,间隙10s,反复4次使线粒体微粒破碎,4℃离心(2000r.min-1,10min),取上清液供酶活力测定。以上操作皆在4℃以下进行。另一部分线粒体悬液直接供丙二醛(MDA)与蛋白质的测定。
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    1.5.3线粒体MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法[8],根据TEP标准曲线计算MDA含量,结果以nmol.mg-1Pr表示。蛋白质含量测定采用改良Lowry氏法[9]

    1.5.4线粒体中谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)活性测定取线粒体裂解液上清0.4ml,用DTNB法检测[10],GSHpx活力单位以μmol.min-1.mg-1Pr表示。

    1.5.5线粒体锰超氧化物歧化酶(Mn_SOD)活性测定按SOD测定试剂盒说明书进行,采用黄嘌呤氧化酶法测Mn_SOD活性。其活力单位以NU(国际单位).mg-1Pr表示。
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    1.5.6线粒体GSH含量测定采用DTNB比色法[11],在412nm处测吸光度值。根据标准曲线计算GSH含量,结果以nmol.mg-1Pr表示。

    1.5.7线粒体GSSG含量测定[12]取线粒体裂解液上清1.0ml,加入0.04mol.L-1NEM水溶液0.4ml,室温放置30min后,加0.187mol.L-1NaOH溶液1.5ml,OPT溶液(1mg.ml-1)0.1ml充分混合,室温放置30min。在激发波长350nm,发射波长430nm处测荧光强度(F)值,并在标准曲线上查出相应的GSSG含量,以nmol.mg-1Pr表示。
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    1.6数据处理实验数据以±s表示,采用t检验判定。

    表1 TEA对D-半乳糖衰老小鼠肝、脑线粒体中MDA含量和抗氧 分组

    剂量

    MDA/nmol.mg-1pr

    GSHpx/mol.min-1

    Mn-SOD -/NU.MG-1Pr

    肝

    脑

    肝

    脑
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    肝

    脑

    正常

    -

    4.3±0.6(11)

    7.3±1.1(11)

    13.0±2.5(12)

    12.5±2.9(12)

    41.0±4.8(10)

    69.4±5.2(10)

    模型

    -
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    7.5±1.0

    12.8±1.5(17)

    5.4±0.5(18)

    4.7±1.0(18)

    25.2±(11)

    35.2±5.6(11)

    TEA

    40

    5.1±0.8

    9.4±1.1(11)

    10.7±(12)

    9.2±1.6(12)
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    34.7±3.7

    43.6±5.6(11)

    VE

    50

    4.8±0.4

    8.1±1.0(12)

    8.4±2.6(13)

    9.8±1.5**(13)

    37.2±1.8*

    47.1±4.2(10)

    表2 TEA 对D-半乳糖哀老小鼠肝.脑线粒体中GSH ,GSSG 分组
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    剂量/mg.kg-1.d-1

    CSH/nmol.mg-1Pr

    GSH/px/mol.min-1.mg-1 Pr

    Mn SOD/NU.mg-1Pr

    肝

    脑

    肝

    脑

    肝

    脑

    正常

    -
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    38.5±5.1(10)

    12.6±2.2(10)

    3.8±1.0(10)

    0.60±0.13(10)

    10.8±3.0(10)

    22.0±6.0(10)

    模型

    -

    24.7±4.1(11)

    8.3±1.8(11)

    6.3±1.5(11)
, 百拇医药
    0.79±0.19(11)

    4.1±0.8(11)

    11.0±3.0(11)

    TEA

    40

    41.4±6.3(11)

    13.2±2.0(11)

    4.5±0.6(11)

    0.63±0.13(11)

    9.4±1.5(11)

    21.4±3.9(11)
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    VE

    50

    31.8±5.2(10)

    12.3±(10)

    3.5±0.6(10)

    0.75±0.15(10)

    9.4±2.0(10)

    16.4±2.5(10)

    表3 TEA对17月龄小鼠肝,脑线粒体中MDA含量和抗氧化酶活性的影响(±s) 分组

    剂量
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    MDA/nmol.mg-1pr

    GSHpx/mol.min-1

    Mn-SOD -/NU.MG-1Pr

    肝

    脑

    肝

    脑

    肝

    脑

    3月龄

    -

    7.4±1.8(10)

, http://www.100md.com     12.6±0.4(10)

    13.0±2.2(10)

    8.7±0.8(10)

    30.4±4.8(10)

    65.8±3.6(10)

    17月龄

    -

    14.0±1.6(10)

    16.0±1.1(10)

    6.0±1.8(10)

    5.6±0.9(10)

, http://www.100md.com     19.7±4.8(10)

    37.7±9.7(10)

    TEA

    40

    8.4±1.4(11)

    13.2±1.0(11)

    11.2±2.3(11)

    7.3±1.0(11)

    27.7±3.8(11)

    44.8±8.7(11)

    VE

    50
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    8.6±2.8(5)

    12.9±0.8(5)

    9.4±2.0(5)

    7.6±0.8(5)

    32.4±0.9(5)

    62.1±8.5(5)

    表4 TEA 对17月龄小鼠肝,脑线粒体中GSH、脑线粒体中GSH、GSSH含量和GSH/GSSG比值的影响(±s) 分组

    剂量/mg.kg-1.d-1

    CSH/nmol.mg-1Pr
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    GSH/px/mol.min-1.mg-1 Pr

    Mn SOD/NU.mg-1Pr

    肝

    脑

    肝

    脑

    肝

    脑

    3月龄

    -

    22.2±7.5(10)

    10.4±2.9(10)
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    4.9±1.6(10)

    5.1±0.9(10)

    5.1±0.9(10)

    14.8±4.2(10)

    17月龄

    -

    16.5±1.3(11)

    8.8±2.8(11)

    6.2±1.8(11)

    2.9±0.9(11)

    2.9±0.9(11)

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    TEA

    40

    21.0±5.3(11)

    9.0±1.4(11)

    5.3±1.1(11)

    3.8±1.0(11)

    3.8±1.0(11)

    9.4±2.6(11)

    VE

    50

    18.7±3.7(5)
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    9.1±1.9(5)

    4.9±1.4(5)

    4.0±1.0(5)

    4.0±1.0(5)

    11.8±2.1(5)

    2 结果

    2.1TEA对D_gal衰老小鼠肝、脑细胞中线粒体MDA含量和抗氧化能力的影响设同龄(5~6mon)正常对照组、D_gal模型组、VE(50mg.kg-1.d-1)阳性对照组和TEA(40mg.kg-1.d-1)4组。D_gal处理10wk后,检测各项指标(见表1、2)。结果表明,与同龄正常对照组相比,D_gal衰老小鼠肝、脑线粒体的MDA含量显著升高;GSHPX活性和Mn_SOD活性均显著降低;GSH含量明显降低,GSSG含量明显升高,GSH/GSSG比值显著下降(P<0.01)。TEA和VE均可使MDA含量显著降低;GSHPX和Mn_SOD活性显著升高(P<0.01);TEA和VE均可使其降低的GSH含量升高,增高的GSSG含量下降,从而使降低的GSH/GSSG比值显著升高(P<0.01),但VE不能明显降低脑线粒体中GSSG含量。表1、2提示TEA与VE均可使D_gal衰老小鼠的脂质过氧化物MDA含量降低,同时上调D_gal衰老小鼠的抗氧化能力。
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    2.2TEA对老前期小鼠肝、脑细胞线粒体MDA含量和抗氧化能力的影响设青龄对照(3mon)、衰老前期对照(17mon)、TEA(40mg.kg-1.d-1ig,14~17mon)和VE(50mg.kg-1.d-1ig,14~17mon)4组。给药12wk,末次给药后24h处死动物,检测各种指标(见表3,4)。结果表明,与青龄小鼠相比,17mon小鼠肝、脑线粒体中MDA含量显著升高;GSHPX活性和Mn_SOD活性均显著降低;GSH含量明显降低或有下降趋势,GSSG含量明显升高或有上升趋势,从而使GSH/GSSG比值显著降低(P<0.05或P<0.01)。TEA和VE均可使MDA含量显著降低;并均可上调GSHPX、Mn_SOD活性;上调GSH含量,降低GSSG含量,使GSH/GSSG比值显著升高(P<0.05或P<0.01)。表3、4提示,TEA和VE均可降低衰老前期小鼠体内活性氧的损伤效应和改善其体内抗氧化能力。
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    3 讨论

    正常机体的自由基氧化作用与抗氧化防御作用处于动态平衡状态,当清除自由基的酶和非酶系统的防御功能减退时,这种动态平衡失调,导致生物体老化[13]。已证明D_gal可产生拟衰老反应,对氧自由基代谢的损伤与人体衰老的改变基本一致[14]。细胞线粒体是氧自由基损伤的主要靶位,也是细胞内源性氧自由基的主要来源[15],线粒体的老化是细胞衰老的重要原因之一[16]。脂质过氧化(LPO)产物MDA的水平往往可反映活性氧损伤效应;抗氧化酶(GSHPX、Mn_SOD)活性和GSH/GSSG比值,是反映机体抗氧化能力的重要指标。故本文采用自然衰老和D_gal衰老两种模型,以肝、脑线粒体中MDA含量、抗氧化酶(GSHPX、Mn_SOD)活性和抗氧化分子(GSH/GSSG)比值作为指标,探讨TEA延缓衰老的作用及其机理。本文结果表明,与同龄鼠相比,D_gal衰老小鼠肝、脑线粒体中MDA
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    含量明显升高,而GSHPX、Mn_SOD的活性和GSH/GSSG比值均明显下降。与青龄鼠相比,老前期小鼠(17mon)肝、脑线粒体中MDA含量,GSHPX、Mn_SOD活性和GSH/GSSG比值亦有上述变化。表明D_gal衰老模型和自然衰老模型均符合衰老的自由基学说,即氧自由基损伤效应参与两种模型的衰老进程。TEA可使D_gal衰老模型肝、脑线粒体中MDA含量明显降低,并上调GSHPX、Mn_SOD的活性和GSH/GSSG比值,说明TEA对D_gal衰老小鼠具有延缓作用。衰老是一渐进性过程,老前期(17mon)小鼠已出现衰老效应,TEA对小鼠的自然衰老过程亦具有延缓作用,且与VE的作用基本相似。本室研究表明,TEA兼有直接捕获和减少产生的双重作用,且对OH.有直接的清除作用,这些作用与其降低衰老小鼠的LPO有关(待发表)。TEA与VE对青龄小鼠(3mon)体内抗氧化酶活性没有影响;TEA体外给药对正常小鼠红细胞内抗氧化酶(GSHPX、CAT)活性亦无明显作用,但可上调衰老小鼠的抗氧化酶活性,说明TEA提高机体抗氧化酶的活性是一种扶正作用,其机理有待进一步研究。
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    综上所述,TEA对D_gal衰老小鼠和小鼠的自然衰老过程均具有明显的延缓作用,该作用与其抗氧化作用有关。

    雷红,女,27岁,医学硕士,主要从事抗炎免疫药理学研究。

    陈敏珠,女,教授,博士生导师。

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    2000-06-14收稿,2000-07-25修回, http://www.100md.com