大鼠肝贮脂细胞、枯否细胞的同时分离和培养
作者：宋少刚 杨雁 陈敏珠
单位：安徽医科大学临床药理研究所,合肥230032
关键词：
中国临床药理学与治疗学000419
中图分类号R965.2
贮脂细胞(Ito细胞)又叫肝星状细胞(hepaticstellattecells,HSC)，位于肝Disse间隙内，有合成细胞外基质(ECM)的功能[1]。目前研究表明，枯否细胞介导的贮脂细胞激活是肝纤维化形成的主要机制，枯否细胞所产生的介质可能是肝纤维化形成的启动因素[2～4]。因此，建立同时分离贮脂细胞和枯否细胞的方法，为贮脂细胞和枯否细胞的共同培养，以及研究肝纤维化的机制和药物作用奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1动物SD大鼠，雌雄兼用，体重350～450g，安徽医科大学提供，皖实动准字第01号。
1.2试剂Nycodenz(美国δ公司产品),蛋白酶E(美国δ公司产品),完全DMEM(Gibco)培养液(内含HEPSE25mmol.L-1,谷氨酰胺2mmol.L-1，丙酮酸钠1mmol.L-1，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)，小牛血清(本校微生物教研室提供)，完全PRMI_1640(Gibco)培养液(内含10%小牛血清，HEPSE25mmol.L-1，谷氨酰胺2mmol.L-1，丙酮酸钠1mmol.L-1，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)。
, 百拇医药
1.3主要仪器Y_1型脏器灌流仪(北京真空仪表厂)，Napco_6100型CO2培养箱(美国杜帮公司)，GL20A型全自动高速冷冻离心机(湖南离心机厂)，荧光显微镜(日本Olympus)。
2 方法
21肝脏灌流，分散肝细胞参照Glanfranco[5]及陈原稼[6]报道法分离贮脂细胞，参照Glanfranco[5]及Knittel[7]报道法分离枯否细胞。大鼠用4%戊巴比妥钠(0.1ml.100g-1，ip)麻醉，常规消毒。剪开腹部皮肤、腹膜，行门静脉插管，用37℃预温D_Hank's液(5.6%NaHCO3调至pH7.4，37℃)灌流，流速20ml.min-1。剪开下腔静脉放血，边灌流边将肝脏游离取出，换用37℃预温的酶灌流液(灌流液中含IV型胶原酶0.05%,W/V,蛋白酶E0.1%,HEPSE10mmol.L-1,青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)，流速15ml.min-1。约30min可见肝组织变软，与肝包膜游离。取肝脏置培养皿中，加20ml肝组织消化液(内含IV型胶原酶0.02%，蛋白酶E0.01%，DNA酶I0.001%)。轻轻撕开包膜，37℃继续消化30min，剔除肝包膜和结缔组织。细胞分散，200目滤网过滤，离心(450×g，5min，4℃)。以Hank's液重新悬浮细胞，与18%(W/V)的Nycodenz以1∶2比例充分混匀，移入离心管中，上覆约1mlHank’s液，进行密度梯度离心(1500×g，20min，4℃)。此时，由于贮脂细胞与枯否细胞密度不同，而处在不同位置，贮脂细胞处在界面，而枯否细胞处在界面下。
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22贮脂细胞的分离、培养用尖头吸管小心吸取界面细胞，在DMEM培养液中悬浮，离心(450×g，10min)，洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含20%小牛血清的DMEM培养液中，以2×105/ml细胞浓度接种于培养瓶中，留取少量细胞进行纯度及活力鉴定。5%CO2，37℃恒温培养48h，换液除去未贴壁细胞，由此纯化贮脂细胞，以后每隔3～4d换液1次。
23枯否细胞的分离、培养用尖头吸管小心吸取界面下细胞，在PRMI_1640培养液中悬浮，离心(450×g，10min)，洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含10%小牛血清的PRMI_1640培养液中，以2×105/ml细胞浓度接种于24孔培养板中，留取少量细胞进行纯度及活力鉴定。5%CO2，37℃的CO2孵箱中贴壁6h，吸弃培养液，用37℃预温的Hank's液洗涤3次，除去未贴壁细胞。重新加入含10%小牛血清的PRMI_1640培养液，继续培养。首次24h更换新鲜的1640培养液。以后每3～4d换液1次。
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2.4细胞活力及纯度鉴定常规台盼蓝拒染试验鉴定细胞活力；倒置显微镜下观察贮脂细胞和枯否
细胞形态；荧光显微镜下计数每视野的蓝绿荧光阳性细胞数，鉴定细胞纯度。
3 结果
31贮脂细胞的分离和培养经本法分离，纯化的贮脂细胞得率2×107/肝，活力在90%以上,在荧光显微镜下新分离的贮脂细胞胞浆呈现出蓝绿色荧光,荧光阳性细胞的百分率约90%。新分离未贴壁的贮脂细胞呈圆形,内含折光颗粒。48h后,细胞贴壁,呈椭圆形,部分细胞伸展。培养至第4～7d,部分细胞开始伸出伪足,呈星形状,胞浆仍可见有折光颗粒。10d后,细胞逐渐融合,增殖细胞形态较大,并呈局灶性生长。细胞生长成单层,铺满培养瓶后,用0.125%的Trypsin_0.02%EDTA消化并传代。传代后的贮脂细胞24h就可贴壁生长。
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图1原代培养至15d的大鼠肝贮脂细胞(相差显微镜， ×300)
3.2枯否细胞的分离与培养经本法分离的枯否细胞,其得率约为3～6×106/肝,台盼蓝染色,细胞活力90%以上。培养的枯否细胞在倒置显微镜下观察,细胞大小不一,形态多样,呈多角形,十字型等不规则形。培养48h大部分细胞伸展生长。从接种细胞至铺慢单层约需14d左右。
图2原代培养至14d的大鼠肝枯否细胞(×100)
4 讨论
肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础,肝纤维化形成的过程渐趋明朗。目前认为，贮脂细胞的激活在肝纤维化发生中起着非常重要的作用[3]。枯否细胞通过分泌细胞因子可调节贮脂细胞的激活[8]。因此,建立经济、简便、稳定的同时分离培养贮脂细胞及枯否细胞的方法,对深入研究肝纤维化发生的机理及药物的治疗作用都有重要意义。
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同时分离和培养大鼠贮脂细胞和枯否细胞，国内尚未见报道。本文应用蛋白酶和IV型胶原酶原位灌流，分离大鼠肝脏细胞，经密度梯度离心，使肝脏各种细胞得到很好的分离。界面细胞为贮脂细胞，界面下为枯否细胞和内皮细胞，管底为破碎的肝细胞和红细胞。枯否细胞能较快且易于附着在塑料、玻璃等固体表面。内皮细胞则不贴壁或贴壁较慢。因此，可通过6h贴壁与内皮细胞分离而纯化。结果表明，贮脂细胞的得率约为2×107/肝，枯否细胞的得率为2×106/肝，细胞活力均在90%以上。我们体会影响细胞得率及活力的因素主要有以下几点：(1)选用体重较大的大鼠，其贮脂细胞密度更低，有利于与其他非实质细胞的分离；(2)前灌流一定要冲净肝脏血液，尽可能不出现花斑，否则会影响下一步酶消化效果；(3)门静脉插管要合适，不能太深，以免伤及肝脏,结扎要迅速，以免凝血；(4)正确判断酶消化程度，一般以肝脏明显变软，胞膜内容物成胶冻状为佳；(5)取出肝脏，不要伤及肝脏及胃肠道，以免造成污染。
我们建立的肝脏原位消化，同时分离贮脂细胞和枯否细胞，分别精制、纯化，在细胞得率、纯度和活力三方面均能达到实验要求，具有经济、方便、稳定的特点。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Mak K,Leo M,Lieber C.Alcoholic liver injury in ba_ boons transformation of lipocutes to transitional cells. Gasteroenterology,1984;87(1):188
2，Buhunche E, Wake K. Role of mesenchymal cell populations in porcine serium_induced rat liver fibro_sis.Hepatology,1992;16(6):1452
3，Friedman SL. Molecular mechanism of hepatic fibro_ sis and principles of therapy.J Gastroenterol,1997; 32:423
, http://www.100md.com
4，Friedman SL. Activation of cultured rat hepatic lipocytes by Kupffer cell conditioned medium.Direct enhancement of matrix synthesis and stimulatation of cell proliferation via induction of platelet_derived growth factor receptors.J Clin Invest,1989;84(6): 1780
5，Glanfranco A, Philips J, Benjamin,et al. Recent ad_ vances in the isolation of liver cells.Hepatology,1994; 20(2)： 494
6 陈原稼，王宝恩，马雪梅，等.大鼠贮脂细胞的分离肝脏病杂志，1993；1(1)：17
, 百拇医药
7，Knittel T, Fellmer P, Ramadori G. Gene expression and regulation of plasminogen activator inhibition type Iin hepatic stellatte cells of rat liver. Gasteroen_ terology,1996;111:745
8，Bachem MG,Sell KM,Melchior R,et al. Tumor necrosis factor alpha andtransforming growth factor_ betal stimulate fibronectin synthesis and the transdif_ ferentiation of fat_storing cells in the rat liver into myofibroblasts.Virchows Arch B Cell Pathol,1993; 63:12
2000-09-11收稿，2000-11-06修回, http://www.100md.com
单位：安徽医科大学临床药理研究所,合肥230032
关键词：
中国临床药理学与治疗学000419
中图分类号R965.2
贮脂细胞(Ito细胞)又叫肝星状细胞(hepaticstellattecells,HSC)，位于肝Disse间隙内，有合成细胞外基质(ECM)的功能[1]。目前研究表明，枯否细胞介导的贮脂细胞激活是肝纤维化形成的主要机制，枯否细胞所产生的介质可能是肝纤维化形成的启动因素[2～4]。因此，建立同时分离贮脂细胞和枯否细胞的方法，为贮脂细胞和枯否细胞的共同培养，以及研究肝纤维化的机制和药物作用奠定基础。
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1 材料
1.1动物SD大鼠，雌雄兼用，体重350～450g，安徽医科大学提供，皖实动准字第01号。
1.2试剂Nycodenz(美国δ公司产品),蛋白酶E(美国δ公司产品),完全DMEM(Gibco)培养液(内含HEPSE25mmol.L-1,谷氨酰胺2mmol.L-1，丙酮酸钠1mmol.L-1，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)，小牛血清(本校微生物教研室提供)，完全PRMI_1640(Gibco)培养液(内含10%小牛血清，HEPSE25mmol.L-1，谷氨酰胺2mmol.L-1，丙酮酸钠1mmol.L-1，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)。
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1.3主要仪器Y_1型脏器灌流仪(北京真空仪表厂)，Napco_6100型CO2培养箱(美国杜帮公司)，GL20A型全自动高速冷冻离心机(湖南离心机厂)，荧光显微镜(日本Olympus)。
2 方法
21肝脏灌流，分散肝细胞参照Glanfranco[5]及陈原稼[6]报道法分离贮脂细胞，参照Glanfranco[5]及Knittel[7]报道法分离枯否细胞。大鼠用4%戊巴比妥钠(0.1ml.100g-1，ip)麻醉，常规消毒。剪开腹部皮肤、腹膜，行门静脉插管，用37℃预温D_Hank's液(5.6%NaHCO3调至pH7.4，37℃)灌流，流速20ml.min-1。剪开下腔静脉放血，边灌流边将肝脏游离取出，换用37℃预温的酶灌流液(灌流液中含IV型胶原酶0.05%,W/V,蛋白酶E0.1%,HEPSE10mmol.L-1,青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1)，流速15ml.min-1。约30min可见肝组织变软，与肝包膜游离。取肝脏置培养皿中，加20ml肝组织消化液(内含IV型胶原酶0.02%，蛋白酶E0.01%，DNA酶I0.001%)。轻轻撕开包膜，37℃继续消化30min，剔除肝包膜和结缔组织。细胞分散，200目滤网过滤，离心(450×g，5min，4℃)。以Hank's液重新悬浮细胞，与18%(W/V)的Nycodenz以1∶2比例充分混匀，移入离心管中，上覆约1mlHank’s液，进行密度梯度离心(1500×g，20min，4℃)。此时，由于贮脂细胞与枯否细胞密度不同，而处在不同位置，贮脂细胞处在界面，而枯否细胞处在界面下。
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22贮脂细胞的分离、培养用尖头吸管小心吸取界面细胞，在DMEM培养液中悬浮，离心(450×g，10min)，洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含20%小牛血清的DMEM培养液中，以2×105/ml细胞浓度接种于培养瓶中，留取少量细胞进行纯度及活力鉴定。5%CO2，37℃恒温培养48h，换液除去未贴壁细胞，由此纯化贮脂细胞，以后每隔3～4d换液1次。
23枯否细胞的分离、培养用尖头吸管小心吸取界面下细胞，在PRMI_1640培养液中悬浮，离心(450×g，10min)，洗去Nycodenz。将细胞沉淀重悬于含10%小牛血清的PRMI_1640培养液中，以2×105/ml细胞浓度接种于24孔培养板中，留取少量细胞进行纯度及活力鉴定。5%CO2，37℃的CO2孵箱中贴壁6h，吸弃培养液，用37℃预温的Hank's液洗涤3次，除去未贴壁细胞。重新加入含10%小牛血清的PRMI_1640培养液，继续培养。首次24h更换新鲜的1640培养液。以后每3～4d换液1次。
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2.4细胞活力及纯度鉴定常规台盼蓝拒染试验鉴定细胞活力；倒置显微镜下观察贮脂细胞和枯否
细胞形态；荧光显微镜下计数每视野的蓝绿荧光阳性细胞数，鉴定细胞纯度。
3 结果
31贮脂细胞的分离和培养经本法分离，纯化的贮脂细胞得率2×107/肝，活力在90%以上,在荧光显微镜下新分离的贮脂细胞胞浆呈现出蓝绿色荧光,荧光阳性细胞的百分率约90%。新分离未贴壁的贮脂细胞呈圆形,内含折光颗粒。48h后,细胞贴壁,呈椭圆形,部分细胞伸展。培养至第4～7d,部分细胞开始伸出伪足,呈星形状,胞浆仍可见有折光颗粒。10d后,细胞逐渐融合,增殖细胞形态较大,并呈局灶性生长。细胞生长成单层,铺满培养瓶后,用0.125%的Trypsin_0.02%EDTA消化并传代。传代后的贮脂细胞24h就可贴壁生长。
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图1原代培养至15d的大鼠肝贮脂细胞(相差显微镜， ×300)
3.2枯否细胞的分离与培养经本法分离的枯否细胞,其得率约为3～6×106/肝,台盼蓝染色,细胞活力90%以上。培养的枯否细胞在倒置显微镜下观察,细胞大小不一,形态多样,呈多角形,十字型等不规则形。培养48h大部分细胞伸展生长。从接种细胞至铺慢单层约需14d左右。
图2原代培养至14d的大鼠肝枯否细胞(×100)
4 讨论
肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础,肝纤维化形成的过程渐趋明朗。目前认为，贮脂细胞的激活在肝纤维化发生中起着非常重要的作用[3]。枯否细胞通过分泌细胞因子可调节贮脂细胞的激活[8]。因此,建立经济、简便、稳定的同时分离培养贮脂细胞及枯否细胞的方法,对深入研究肝纤维化发生的机理及药物的治疗作用都有重要意义。
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同时分离和培养大鼠贮脂细胞和枯否细胞，国内尚未见报道。本文应用蛋白酶和IV型胶原酶原位灌流，分离大鼠肝脏细胞，经密度梯度离心，使肝脏各种细胞得到很好的分离。界面细胞为贮脂细胞，界面下为枯否细胞和内皮细胞，管底为破碎的肝细胞和红细胞。枯否细胞能较快且易于附着在塑料、玻璃等固体表面。内皮细胞则不贴壁或贴壁较慢。因此，可通过6h贴壁与内皮细胞分离而纯化。结果表明，贮脂细胞的得率约为2×107/肝，枯否细胞的得率为2×106/肝，细胞活力均在90%以上。我们体会影响细胞得率及活力的因素主要有以下几点：(1)选用体重较大的大鼠，其贮脂细胞密度更低，有利于与其他非实质细胞的分离；(2)前灌流一定要冲净肝脏血液，尽可能不出现花斑，否则会影响下一步酶消化效果；(3)门静脉插管要合适，不能太深，以免伤及肝脏,结扎要迅速，以免凝血；(4)正确判断酶消化程度，一般以肝脏明显变软，胞膜内容物成胶冻状为佳；(5)取出肝脏，不要伤及肝脏及胃肠道，以免造成污染。
我们建立的肝脏原位消化，同时分离贮脂细胞和枯否细胞，分别精制、纯化，在细胞得率、纯度和活力三方面均能达到实验要求，具有经济、方便、稳定的特点。
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参 考 文 献
1，Mak K,Leo M,Lieber C.Alcoholic liver injury in ba_ boons transformation of lipocutes to transitional cells. Gasteroenterology,1984;87(1):188
2，Buhunche E, Wake K. Role of mesenchymal cell populations in porcine serium_induced rat liver fibro_sis.Hepatology,1992;16(6):1452
3，Friedman SL. Molecular mechanism of hepatic fibro_ sis and principles of therapy.J Gastroenterol,1997; 32:423
, http://www.100md.com
4，Friedman SL. Activation of cultured rat hepatic lipocytes by Kupffer cell conditioned medium.Direct enhancement of matrix synthesis and stimulatation of cell proliferation via induction of platelet_derived growth factor receptors.J Clin Invest,1989;84(6): 1780
5，Glanfranco A, Philips J, Benjamin,et al. Recent ad_ vances in the isolation of liver cells.Hepatology,1994; 20(2)： 494
6 陈原稼，王宝恩，马雪梅，等.大鼠贮脂细胞的分离肝脏病杂志，1993；1(1)：17
, 百拇医药
7，Knittel T, Fellmer P, Ramadori G. Gene expression and regulation of plasminogen activator inhibition type Iin hepatic stellatte cells of rat liver. Gasteroen_ terology,1996;111:745
8，Bachem MG,Sell KM,Melchior R,et al. Tumor necrosis factor alpha andtransforming growth factor_ betal stimulate fibronectin synthesis and the transdif_ ferentiation of fat_storing cells in the rat liver into myofibroblasts.Virchows Arch B Cell Pathol,1993; 63:12
2000-09-11收稿，2000-11-06修回, http://www.100md.com