HPLC法测定磁性微球及大鼠肝组织中的平阳霉素
作者：张毕奎 阎小华 刘新华 张胜 吴汉江
单位：阎小华(深圳市康宁医院)；刘新华(湖南省张家界市永定区药检所)；张毕奎 张胜 吴汉江(湖南医科大学附属第二医院口腔科 长沙 410011)
关键词：HPLC；磁性微球；鼠肝组织；平阳霉素
药物分析杂志000302 摘要 目的：建立磁性微球及鼠肝组织中平阳霉素的检测方法，评价磁性微球的靶向性。方法：采用RP-HPLC法，紫外检测，内标法定量，平阳霉素磁性微球采用pH=4的胃蛋白酶消化后过滤稀释测定，鼠肝组织匀浆后离心取上清液用三氯醋酸沉淀蛋白后直接进样分析。结果：测定样品在10～50 μg.mL-1范围内线性关系良好，回收率和精密度均较满意。结论：用本法测定磁性微球及鼠肝组织中平阳霉素，可用于研究磁性微球中平阳霉素的含量及组织中分布情况，考察磁性微球的靶向性。
, 百拇医药
Determination of Pingyangmycin in Magnetic-Microspheres
and Rat Liver by HPLC
Zhang Bikui，Yan Xiaohua，Liu Xinghua
(Clinic Pharmacy Research Laboratory,2nd Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011)
Zhang Sheng，Wu Hanjang
(Department of stomatology The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University)
, 百拇医药
Abstract Objective：A method to determine PYM in magnetic-microspheres and rat liver was established.The target ability of magnetic-microspheres was also evaluated.Method:Using RP-HPLC with UV detector and caffeine as internal standard.PYM-magnetic-microspheres was digested with pepsin at pH 4.0,followed by filtering and analysis.The homogenation of rat liver was centrifuged and the solution was analysed after deposition with THA.Results:Good linear relations was achieved when the sample concentration was at the range of 10～50 μg.mL-1(r=0.999 1).The recoveries were 96.2%～98.4%，RSD<6.8%.Conclusion:The RP-HPLC method to determine PYM in microspheres and rat liver is helpful for the study of PYM content in magnetic-microspheres and distribution inside the body and the evaluation of the target ability of magnetic-microspheres.
, 百拇医药
Key words HPLC,magnetic-microspheres,rat liver,PYM
平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)系博来霉素(Bleomycin)A5组分，对鳞状细胞癌有独特的疗效，但对细胞的作用选择性不强，易引起严重的系统性毒副作用。为了使药物达到特定的部位发挥治疗作用，减少不良反应的发生，我们把平阳霉素制成磁性微球，进行大鼠肝动脉灌注，用外加磁场，考察其靶向性。本文报道用HPLC法测定磁性微球及鼠肝组织中的平阳霉素。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪LC-6A系列，配SPD-6AV紫外检测器，CR4A数据处理器(均为日本岛津产)，GL-20A高速全自动离心机(湖南湘仪厂)。
平阳霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所，含量为99.5%)；三氯醋酸、依地酸二钠、四甲基乙二胺、冰醋酸为国产分析纯试剂；甲醇、乙腈为国产色谱纯试剂，戊烷磺酸钠为日本产分析纯试剂。
, 百拇医药
2 色谱条件
流动相：取依地酸二钠0.93 g，戊烷磺酸钠0.49 g，四甲基乙二胺2.2 mL，冰醋酸4.5 mL，加重蒸馏水至500 mL，再加入甲醇150 mL，乙腈60 mL，混合，过滤，超声脱气。流速：1 mL.min-1；固定相：C18柱(15 cm×4.6 mm，大连化物所)，柱温：40 ℃；检测波长：291 nm；灵敏度：0.04AUFS。以咖啡因为内标，采用内标法定量。
3 测定方法考察
3.1 样品处理及色谱行为
精密称取PYM标准品0.105 0 g，用重蒸馏水溶解并定容至100 mL，得1 000 μg.mL-1 PYM标准溶液。另精密称取咖啡因0.020 g，用重蒸馏水溶解并定容至100 mL，得200 μg.mL-1咖啡因溶液作为内标溶液。
, 百拇医药
取上述PYM标准溶液5 μL，内标溶液10 μL，加重蒸馏水定容至0.2 mL，取20 μL进样，得标准色谱图(图1-A)，PYM及内标的保留时间分别为2.91 min和4.14 min。取新鲜无药鼠肝组织，充分匀浆后离心取上清液0.1 mL，加入10%三氯醋酸0.1 mL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，得空白色谱图(图1-B)。取新鲜含药鼠肝组织，充分匀浆后离心取上清液0.1 mL，加入内标溶液10 μL及10%三氯醋酸90 μL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，得样品色谱图(图1-C)。比较图谱，发现鼠肝组织对测定无干扰。
图1 色谱图
A.标准品 B.空白 C.样品
, 百拇医药
1. PYM(2.91 min) 2.内标(4.14 min)
3.2 线性关系 精密吸取上述PYM标准溶液适量及内标溶液100 μL，加重蒸馏水定容至2 mL，配成含PYM 10，20，30，40，50 μg.mL-1的系列浓度溶液，各进样20 μL，以PYM浓度C(μg.mL-1)对PYM峰面积与内标峰面积之比A进行线性回归，线性关系良好，回归方程及相关系数分别为：
C=2.599+16.446A r=0.999 1
3.3 最低检测限 以信噪比(S/N)>3为准，PYM的最低检出限为0.5 μg.mL-1。
3.4 回收率实验 精密吸取上述PYM标准溶液适量，加入新鲜无药鼠肝组织经匀浆并离心后的上清液定容至0.1 mL，加入内标溶液10 μL及10%三氯醋酸90 μL，配成含PYM分别为10，20，40 μg.mL-1的3种浓度溶液各3份，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，用回归方程计算测定结果，并计算回收率，结果见表1。
, 百拇医药
表1 回收率测定结果(n=3) 浓度/μg.mL-1
回收率/%
RSD/%
10
97.7
4.5
20
98.4
3.0
40
96.2
6.8
, 百拇医药
4 磁性微球的含量测定
将PYM、四氧化三铁细粉、明胶等依法制备成PYM磁性微球[1]。精密称取磁性微球5.0 mg，加入pH=4的胃蛋白酶溶液1 mL混匀，置于37 ℃水浴中放置6 h，使明胶充分降解，过滤，取续滤液0.2 mL加入内标溶液100 μL，加重蒸馏水定容至2 mL，进样20 μL，用回归方程求出测定结果，计算磁性微球中PYM的含量。本实验所制备的磁性微球中PYM的含量为4.50%(n=5)。
5 大白鼠肝组织中的PYM浓度测定
选取雄性大白鼠18只，体重180～230 g，随机分成3组，每组6只。利多卡因麻醉后，分别用PYM磁性微球50 mg加入生理盐水1.5 mL制成的微球混悬液注入每只大鼠肝动脉，并用永久磁体照射大鼠右肝，将3组大白鼠分别在0.5，1.0，1.5 h处死，取出肝脏，分出左右肝，并分别匀浆，离心，取上清液50 μL，加入10%三氯醋酸50 μL，内标溶液10 μL及重蒸馏水定容至0.2 mL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，根据回归方程计算此混合液浓度，结果见表2。
, 百拇医药
表2 鼠肝组织中的PYM浓度比较 组号
处死时间
/h
部位
浓度/μg.mL-1
1
2
3
4
5
6
X±SD
, http://www.100md.com 1
0.5
左肝
13.40
11.50
11.90
9.85
13.55
14.00
12.37±1.59
右肝
20.53
18.84
, 百拇医药
20.10
17.78
22.78
20.57
20.05±1.69*
2
1.0
左肝
15.85
16.77
18.45
17.28
, 百拇医药 17.77
18.00
17.35±0.99
右肝
40.78
38.62
39.32
37.67
38.82
39.90
39.19±1.08*
3
, 百拇医药 1.5
左肝
16.26
15.45
15.88
16.00
14.98
14.23
15.47±0.76
右肝
28.68
26.64
24.84
, http://www.100md.com
20.22
21.12
22.28
23.96±3.32*
*P<0.01，与左肝部位对照组比较(n=6) 将表2中3组大鼠左、右肝的PYM浓度值分别用配对t检验[2]法进行统计学处理，结果右肝的PYM浓度均显著大于左肝(P<0.01)，本实验所制备的PYM磁性微球具有明显的靶向性。
6 讨论
6.1 选择本实验的色谱条件时，曾参考中国药典中测定PYM的流动相[3]，发现色谱峰拖尾比较严重，我们在此基础上加入适量的四甲基乙二胺和冰醋酸，结果拖尾得到明显改善，且灵敏度明显提高。但当样品中PYM浓度低于5 μg.mL-1时，回收率仍达不到要求，故本法测定样品浓度宜控制在5～50 μg.mL-1范围内。
, 百拇医药
6.2 实验中曾将本色谱条件下明胶等辅料消化后在本色谱条件下进样，均对测定无干扰。
6.3 本实验测定鼠肝的PYM浓度的目的是比较左右肝浓度的差异从而考察磁性微球的靶向性，因此未对鼠肝组织称重从而计算肝组织中PYM的绝对含量，而只是将其匀浆后定量取其离心后的上清液测定浓度。基于以上原因，方法的回收率实验也是将标准液加入空白肝组织匀浆处理后的上清液中进行。
参考文献
1，郑根建，周嘉秀，李德伦等.平阳霉素磁控释微球的制备.华西口腔医学杂志，1996，14(3)：220
2，胡良平主编.现代统计学与SAS应用.北京：军事医学科学出版社，1996.66
3，中国药典.1995.二部：431
(本文于1999年4月27日收到), 百拇医药
单位：阎小华(深圳市康宁医院)；刘新华(湖南省张家界市永定区药检所)；张毕奎 张胜 吴汉江(湖南医科大学附属第二医院口腔科 长沙 410011)
关键词：HPLC；磁性微球；鼠肝组织；平阳霉素
药物分析杂志000302 摘要 目的：建立磁性微球及鼠肝组织中平阳霉素的检测方法，评价磁性微球的靶向性。方法：采用RP-HPLC法，紫外检测，内标法定量，平阳霉素磁性微球采用pH=4的胃蛋白酶消化后过滤稀释测定，鼠肝组织匀浆后离心取上清液用三氯醋酸沉淀蛋白后直接进样分析。结果：测定样品在10～50 μg.mL-1范围内线性关系良好，回收率和精密度均较满意。结论：用本法测定磁性微球及鼠肝组织中平阳霉素，可用于研究磁性微球中平阳霉素的含量及组织中分布情况，考察磁性微球的靶向性。
, 百拇医药
Determination of Pingyangmycin in Magnetic-Microspheres
and Rat Liver by HPLC
Zhang Bikui，Yan Xiaohua，Liu Xinghua
(Clinic Pharmacy Research Laboratory,2nd Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011)
Zhang Sheng，Wu Hanjang
(Department of stomatology The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University)
, 百拇医药
Abstract Objective：A method to determine PYM in magnetic-microspheres and rat liver was established.The target ability of magnetic-microspheres was also evaluated.Method:Using RP-HPLC with UV detector and caffeine as internal standard.PYM-magnetic-microspheres was digested with pepsin at pH 4.0,followed by filtering and analysis.The homogenation of rat liver was centrifuged and the solution was analysed after deposition with THA.Results:Good linear relations was achieved when the sample concentration was at the range of 10～50 μg.mL-1(r=0.999 1).The recoveries were 96.2%～98.4%，RSD<6.8%.Conclusion:The RP-HPLC method to determine PYM in microspheres and rat liver is helpful for the study of PYM content in magnetic-microspheres and distribution inside the body and the evaluation of the target ability of magnetic-microspheres.
, 百拇医药
Key words HPLC,magnetic-microspheres,rat liver,PYM
平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)系博来霉素(Bleomycin)A5组分，对鳞状细胞癌有独特的疗效，但对细胞的作用选择性不强，易引起严重的系统性毒副作用。为了使药物达到特定的部位发挥治疗作用，减少不良反应的发生，我们把平阳霉素制成磁性微球，进行大鼠肝动脉灌注，用外加磁场，考察其靶向性。本文报道用HPLC法测定磁性微球及鼠肝组织中的平阳霉素。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪LC-6A系列，配SPD-6AV紫外检测器，CR4A数据处理器(均为日本岛津产)，GL-20A高速全自动离心机(湖南湘仪厂)。
平阳霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所，含量为99.5%)；三氯醋酸、依地酸二钠、四甲基乙二胺、冰醋酸为国产分析纯试剂；甲醇、乙腈为国产色谱纯试剂，戊烷磺酸钠为日本产分析纯试剂。
, 百拇医药
2 色谱条件
流动相：取依地酸二钠0.93 g，戊烷磺酸钠0.49 g，四甲基乙二胺2.2 mL，冰醋酸4.5 mL，加重蒸馏水至500 mL，再加入甲醇150 mL，乙腈60 mL，混合，过滤，超声脱气。流速：1 mL.min-1；固定相：C18柱(15 cm×4.6 mm，大连化物所)，柱温：40 ℃；检测波长：291 nm；灵敏度：0.04AUFS。以咖啡因为内标，采用内标法定量。
3 测定方法考察
3.1 样品处理及色谱行为
精密称取PYM标准品0.105 0 g，用重蒸馏水溶解并定容至100 mL，得1 000 μg.mL-1 PYM标准溶液。另精密称取咖啡因0.020 g，用重蒸馏水溶解并定容至100 mL，得200 μg.mL-1咖啡因溶液作为内标溶液。
, 百拇医药
取上述PYM标准溶液5 μL，内标溶液10 μL，加重蒸馏水定容至0.2 mL，取20 μL进样，得标准色谱图(图1-A)，PYM及内标的保留时间分别为2.91 min和4.14 min。取新鲜无药鼠肝组织，充分匀浆后离心取上清液0.1 mL，加入10%三氯醋酸0.1 mL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，得空白色谱图(图1-B)。取新鲜含药鼠肝组织，充分匀浆后离心取上清液0.1 mL，加入内标溶液10 μL及10%三氯醋酸90 μL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，得样品色谱图(图1-C)。比较图谱，发现鼠肝组织对测定无干扰。
图1 色谱图
A.标准品 B.空白 C.样品
, 百拇医药
1. PYM(2.91 min) 2.内标(4.14 min)
3.2 线性关系 精密吸取上述PYM标准溶液适量及内标溶液100 μL，加重蒸馏水定容至2 mL，配成含PYM 10，20，30，40，50 μg.mL-1的系列浓度溶液，各进样20 μL，以PYM浓度C(μg.mL-1)对PYM峰面积与内标峰面积之比A进行线性回归，线性关系良好，回归方程及相关系数分别为：
C=2.599+16.446A r=0.999 1
3.3 最低检测限 以信噪比(S/N)>3为准，PYM的最低检出限为0.5 μg.mL-1。
3.4 回收率实验 精密吸取上述PYM标准溶液适量，加入新鲜无药鼠肝组织经匀浆并离心后的上清液定容至0.1 mL，加入内标溶液10 μL及10%三氯醋酸90 μL，配成含PYM分别为10，20，40 μg.mL-1的3种浓度溶液各3份，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，用回归方程计算测定结果，并计算回收率，结果见表1。
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表1 回收率测定结果(n=3) 浓度/μg.mL-1
回收率/%
RSD/%
10
97.7
4.5
20
98.4
3.0
40
96.2
6.8
, 百拇医药
4 磁性微球的含量测定
将PYM、四氧化三铁细粉、明胶等依法制备成PYM磁性微球[1]。精密称取磁性微球5.0 mg，加入pH=4的胃蛋白酶溶液1 mL混匀，置于37 ℃水浴中放置6 h，使明胶充分降解，过滤，取续滤液0.2 mL加入内标溶液100 μL，加重蒸馏水定容至2 mL，进样20 μL，用回归方程求出测定结果，计算磁性微球中PYM的含量。本实验所制备的磁性微球中PYM的含量为4.50%(n=5)。
5 大白鼠肝组织中的PYM浓度测定
选取雄性大白鼠18只，体重180～230 g，随机分成3组，每组6只。利多卡因麻醉后，分别用PYM磁性微球50 mg加入生理盐水1.5 mL制成的微球混悬液注入每只大鼠肝动脉，并用永久磁体照射大鼠右肝，将3组大白鼠分别在0.5，1.0，1.5 h处死，取出肝脏，分出左右肝，并分别匀浆，离心，取上清液50 μL，加入10%三氯醋酸50 μL，内标溶液10 μL及重蒸馏水定容至0.2 mL，混匀，10 000 r.min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样，根据回归方程计算此混合液浓度，结果见表2。
, 百拇医药
表2 鼠肝组织中的PYM浓度比较 组号
处死时间
/h
部位
浓度/μg.mL-1
1
2
3
4
5
6
X±SD
, http://www.100md.com 1
0.5
左肝
13.40
11.50
11.90
9.85
13.55
14.00
12.37±1.59
右肝
20.53
18.84
, 百拇医药
20.10
17.78
22.78
20.57
20.05±1.69*
2
1.0
左肝
15.85
16.77
18.45
17.28
, 百拇医药 17.77
18.00
17.35±0.99
右肝
40.78
38.62
39.32
37.67
38.82
39.90
39.19±1.08*
3
, 百拇医药 1.5
左肝
16.26
15.45
15.88
16.00
14.98
14.23
15.47±0.76
右肝
28.68
26.64
24.84
, http://www.100md.com
20.22
21.12
22.28
23.96±3.32*
*P<0.01，与左肝部位对照组比较(n=6) 将表2中3组大鼠左、右肝的PYM浓度值分别用配对t检验[2]法进行统计学处理，结果右肝的PYM浓度均显著大于左肝(P<0.01)，本实验所制备的PYM磁性微球具有明显的靶向性。
6 讨论
6.1 选择本实验的色谱条件时，曾参考中国药典中测定PYM的流动相[3]，发现色谱峰拖尾比较严重，我们在此基础上加入适量的四甲基乙二胺和冰醋酸，结果拖尾得到明显改善，且灵敏度明显提高。但当样品中PYM浓度低于5 μg.mL-1时，回收率仍达不到要求，故本法测定样品浓度宜控制在5～50 μg.mL-1范围内。
, 百拇医药
6.2 实验中曾将本色谱条件下明胶等辅料消化后在本色谱条件下进样，均对测定无干扰。
6.3 本实验测定鼠肝的PYM浓度的目的是比较左右肝浓度的差异从而考察磁性微球的靶向性，因此未对鼠肝组织称重从而计算肝组织中PYM的绝对含量，而只是将其匀浆后定量取其离心后的上清液测定浓度。基于以上原因，方法的回收率实验也是将标准液加入空白肝组织匀浆处理后的上清液中进行。
参考文献
1，郑根建，周嘉秀，李德伦等.平阳霉素磁控释微球的制备.华西口腔医学杂志，1996，14(3)：220
2，胡良平主编.现代统计学与SAS应用.北京：军事医学科学出版社，1996.66
3，中国药典.1995.二部：431
(本文于1999年4月27日收到), 百拇医药