中药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别
作者：王义权* 周开亚1 徐珞珊 徐国钧
单位：(中国药科大学生药学研究室，南京 210009； 1南京师范大学生物系，南京 210097)
关键词：乌梢蛇药材；DNA序列；Cyt b基因；分子标记；鉴定
药学学报990116.htm DNA序列分析鉴别是中药材品种鉴定的新方法[1]，已应用于海马、龟甲、鳖甲等中药材的鉴定[2～7]。
目前商品流通中乌梢蛇(ZAOCYS)药材的混淆品种类较多，游蛇科(Colubridae)的常见种类都有可能被当作乌梢蛇制成药材，品种鉴定困难[8]。而蛇类药材的分子遗传标记鉴别仅有RAPD方法鉴别的报道[9]。为深入蛇类药材分子遗传标记鉴别研究，寻找更为理想的鉴别方法，本文用Cyt b基因片段序列测定的结果对乌梢蛇药材及其混淆品和原动物进行鉴别。
, 百拇医药
材料和方法
材料 中药材乌梢蛇及其混淆品7种共12件标本，购自各地药材市场，并常温保存3年以上。原动物标本10种各1件，样品取材后置-20℃冻存备用。DNA序列分析通常用新鲜的组织标本为提取模板DNA的材料，因为从新鲜组织中提取的DNA质量高，便于后续的实验研究。本文所用原动物新鲜组织样品还作为阳性对照。样品来源和种类见表1，其中7种蛇有2个以上样品(含药材和原动物)。
Tab 1 Samples used in the present study Species
Code
Sources of Tissue
Localities
Zaocys dhumnades
, 百拇医药
Zd
F(1)*
D(3)
Jiangsu， Hubei， Guangxi
Elaphe taeniura
Et
F(1)
D(2)
Anhui， Hunan， Jiangxi
E.mandarina
Ema
, 百拇医药 F(1)
Anhui
E.rufodorsata
Er
F(1)
D(2)
Jiangsu， Jiangxi
E.carinata
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F(1)
D(1)
Anhui， Hubei
, 百拇医药
E.bimaculata
Eb
F(1)
Jiangsu
E.schrenckii
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Jiangsu
Sinonatrix annularis
Sa
F(1)
D(2)
, 百拇医药
Jiangsu， Jiangxi
Dinodon rufozonatum
Dr
F(1)
D(1)
Jiangsu， Guangdong
Ptyas korros
Pk
F(1)
D(1)
Anhui， Fujian
*F: frozen muscle， D: dried muscle. Numbers in brackets indicate sample number.
, 百拇医药
DNA的提取和Cyt b基因片段的扩增 新鲜标本的DNA提取同王义权等[10]，药材标本DNA提取过程同前[9]。
引物为Kocher等设计[11]，分别为L14841(5'-AAAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAT GAAA-3')和H15149(5'-AAACTGCAGCCCCTCA GAATGATATTTGTCCTCA-3')，该对引物可扩增约308 bp的Cyt b基因片段。反应的体积为100 μl，内含模板DNA约(10～100) ng，10 mmol.L-1 Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol.L-1 KCl，2.5 mmol.L-1 MgCl2，4种dNTP(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)各150 μmol.L-1，0.01%明胶，3 U Taq DNA聚合酶，每一引物0.3 μmol.L-1。PCR反应在2400型基因扩增仪(PE公司)上进行，反应液先经95℃预变性4 min，然后95℃ 40 s变性，55℃ 1 min复性，72℃ 2 min延伸，完成35个循环后，72℃ 7 min补齐。以ddH2O代替模板DNA作空白对照。
, 百拇医药
PCR产物的纯化及银染测序 PCR产物用WizardTM PCR Preps DNA纯化试剂盒纯化，按试剂盒操作指南进行。Sanger终止法进行测序反应，DNA测序试剂盒、银染试剂盒均为Promega产品，操作过程按测序试剂盒手册进行。
数据分析 所得DNA序列输入计算机，经对位排列后，用分子系统发育分析软件MEGA统计各样品DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数。
结果
以上述22个样品中提得的DNA为模板，扩增得到约308 bp的Cyt b基因片段，测序结果经对位排列后得到246 bp的DNA序列(图1)，共有101个碱基变异位点，轻链中A，T，C和G的含量分别为(29.3～30.0)%，(27.2～32.1)%，(22.4～30.1)%和(11.4～13.7)%，平均为31.6%，29.5%，26.8%和12.2%。不同种间的碱基替代率(差异百分率)为(11.84～23.98)%，平均为16.85%(表2)，而乌梢蛇4个样品间的碱基替代率为(0.41～4.06)%，平均为2.52%，其余各种的种内样品间的碱基替代率为(0～2.03)%，平均为0.45%，在7个有2个以上样品的种中，种内碱基替代率总平均为1.14%，种间与种内相差15倍；不同种间的碱基颠换率为(1.63～11.38)%，平均为6.45%，种内的碱基颠换率为(0～0.81)%，平均颠换率为0.16%，二者相差40倍；转换率在种间为(6.91～13.82)%，平均为10.23%，种内为(0～3.66)%，平均为0.97%，两者相差11倍。
, 百拇医药
讨论
本研究包括的动物种类共有10种，在有2个以上样品的7种蛇中，该Cyt b基因片段在6个种中有种内的DNA序列变异。另一方面，Cyt b基因是动物线粒体上一个编码蛋白质的基因，有一定的保守性，在我们所得的蛇类这一基因片段中，种内个体间DNA序列差异的百分数仅为(0～4.06)%，总平均为1.14%。而种间DNA序列差异在(11.84～23.98)%之间，平均为16.85%。种内DNA序列差异百分数远远低于种间的差异百分数，两者之间有非常显著的差异(P<0.01)。可见Cyt b基因在这些种内高度保守。这种在种内个体间的序列差异很小，而种间的序列差异却较大的DNA片段，正是物种鉴别的理想标记。因此，Cyt b基因片段的DNA序列是鉴别蛇类药材原动物种类的一种良好分子标记。
Tab 2 Numbers of transitions / transversions (above diagonal) and substitution percentage (below diagonal) for Cyt b gene fragment sequences of 10 species of snakes Code*
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15.45
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17.07
0.41
*Codes are same to Tab 1.
, 百拇医药
Fig 1 Alignments of Cyt b gene fragment sequences (L-strand) of 10 species of snakes (Codes are the same as in Tab 1. For species with two or more samples, the first one is from original animal).
在药材分子标记鉴定过程中，通过对药材Cyt b基因片段的DNA序列分析，将检品的Cyt b基因与正品药材的Cyt b基因的同源DNA序列进行比较，即可正确地鉴别出待检样品是否为正品药材。一般异种间该DNA片段序列差异至少大于11.84%。而正品中药材乌梢蛇种内个体间的序列差异不会大于5%(本研究中的4个不同来源的乌梢蛇样品的序列差异最大者为4.06%)。如已建立了正品和常见伪、混品种同源DNA序列的数据库，检品DNA测序后，通过与数据库中的正品乌梢蛇药材的同源DNA序列比较，即可准确地鉴别出检品是否为正品药材。反之，还可与数据库中其它种蛇的同源DNA序列比较，便可确定检品的原动物的来源。本研究通过比较蛇的Cyt b基因246 bp的同源DNA序列，可以准确地区分出中药材乌梢蛇及其混淆品。
, http://www.100md.com
此外，用新鲜的原动物标本为材料提取、扩增DNA，并将扩增片段纯化和测序，结果可作为阳性对照。从图1的DNA序列中还可见，如原动物为同一种，无论DNA模板来自新鲜标本还是来自药材标本，所得DNA序列在种内个体间完全相同(见图1中Sa1，Sa2和Sa3之间，Er1和Er3之间)或仅少数碱基有差异。这种微小的差异反映了种内的遗传多样性，这一结果表明在DNA提取、扩增过程中，本实验采取的防止和去除药材被外源DNA污染的措施可行，得到的DNA片段确实来自药材标本，测序结果可靠。
用DNA序列分析的方法进行中药材DNA分子标记鉴别，只需一小块干药材，将其表面刮弃，从内部取极少量的样品即可提得足够用于PCR扩增的DNA模板，然后进行DNA序列分析研究。该方法准确性高，不同种间区别十分明显，重现性很好，不仅能鉴别药材的真伪，而且还随着某一类药材及其伪、混品DNA序列数据的积累，能准确鉴别出的伪、混品原动、植物的种类也将增多。但不足之处是该方法实验程序繁杂，技术难度较大，鉴定成本较高，在DNA提取和扩增过程中要严格防止外源DNA的污染，需要较好的实验条件。
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金(39570865)和中国博士后科学基金资助项目(No.1996[2])
*现址：南京师范大学生物系，南京 210097,Tel:(025)3729111-3328,Fax:(025)3738174,E-mail:yqw@pine.njnu.edu.cn
参考文献
1 王义权,徐珞珊,徐国钧,等.DNA分子标记鉴别在生药鉴定中的应用前景.中国中药杂志,1997,22∶583
2 王建云,王文,宿兵,等.DNA序列分析技术鉴定鸡内金的方法学研究.中国药科大学学报,1996,27∶471
3 王建云,何广新,付文,等.鹿鞭的微量DNA提取及序列鉴定.中国中药杂志,1997,22∶579
, http://www.100md.com
4 吴平,周开亚,张朝晖,等.海马类药材分子遗传标记鉴定研究.药学学报,1998,33∶226
5 吴平,周开亚,徐珞珊,等.中药材龟甲分子鉴定研究.药学学报,1998,33∶309
6 吴平,周开亚,徐珞珊,等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲.中国药科大学学报,1998,28∶28
7 Mizukami H. Amplification and sequence of a 5S-rRNA gene spacer region from the crude drug “Angelica Root”. Biol Pharm Bull, 1995,18∶1299
8 王义权,周开亚.蛇类药材的商品调查及鉴定.中药材,1996,19∶285
, http://www.100md.com 9 王义权,周开亚.蛇类药材的分子遗传标记鉴别的初步研究.药学学报,1997,32∶384
10 王义权,周开亚,秦树臻.用RAPD标记检测六种蛇基因组DNA多态性.动物学报,1996,42∶172
11 Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶6196
收稿日期: 1998-01-23, http://www.100md.com(王义权* 周开亚1 徐珞珊 徐国钧)
单位：(中国药科大学生药学研究室，南京 210009； 1南京师范大学生物系，南京 210097)
关键词：乌梢蛇药材；DNA序列；Cyt b基因；分子标记；鉴定
药学学报990116.htm DNA序列分析鉴别是中药材品种鉴定的新方法[1]，已应用于海马、龟甲、鳖甲等中药材的鉴定[2～7]。
目前商品流通中乌梢蛇(ZAOCYS)药材的混淆品种类较多，游蛇科(Colubridae)的常见种类都有可能被当作乌梢蛇制成药材，品种鉴定困难[8]。而蛇类药材的分子遗传标记鉴别仅有RAPD方法鉴别的报道[9]。为深入蛇类药材分子遗传标记鉴别研究，寻找更为理想的鉴别方法，本文用Cyt b基因片段序列测定的结果对乌梢蛇药材及其混淆品和原动物进行鉴别。
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材料和方法
材料 中药材乌梢蛇及其混淆品7种共12件标本，购自各地药材市场，并常温保存3年以上。原动物标本10种各1件，样品取材后置-20℃冻存备用。DNA序列分析通常用新鲜的组织标本为提取模板DNA的材料，因为从新鲜组织中提取的DNA质量高，便于后续的实验研究。本文所用原动物新鲜组织样品还作为阳性对照。样品来源和种类见表1，其中7种蛇有2个以上样品(含药材和原动物)。
Tab 1 Samples used in the present study Species
Code
Sources of Tissue
Localities
Zaocys dhumnades
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D(3)
Jiangsu， Hubei， Guangxi
Elaphe taeniura
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D(2)
Anhui， Hunan， Jiangxi
E.mandarina
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Anhui
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Jiangsu， Jiangxi
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Anhui， Hubei
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E.bimaculata
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Jiangsu
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Jiangsu
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Jiangsu， Jiangxi
Dinodon rufozonatum
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Jiangsu， Guangdong
Ptyas korros
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Anhui， Fujian
*F: frozen muscle， D: dried muscle. Numbers in brackets indicate sample number.
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DNA的提取和Cyt b基因片段的扩增 新鲜标本的DNA提取同王义权等[10]，药材标本DNA提取过程同前[9]。
引物为Kocher等设计[11]，分别为L14841(5'-AAAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAT GAAA-3')和H15149(5'-AAACTGCAGCCCCTCA GAATGATATTTGTCCTCA-3')，该对引物可扩增约308 bp的Cyt b基因片段。反应的体积为100 μl，内含模板DNA约(10～100) ng，10 mmol.L-1 Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol.L-1 KCl，2.5 mmol.L-1 MgCl2，4种dNTP(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)各150 μmol.L-1，0.01%明胶，3 U Taq DNA聚合酶，每一引物0.3 μmol.L-1。PCR反应在2400型基因扩增仪(PE公司)上进行，反应液先经95℃预变性4 min，然后95℃ 40 s变性，55℃ 1 min复性，72℃ 2 min延伸，完成35个循环后，72℃ 7 min补齐。以ddH2O代替模板DNA作空白对照。
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PCR产物的纯化及银染测序 PCR产物用WizardTM PCR Preps DNA纯化试剂盒纯化，按试剂盒操作指南进行。Sanger终止法进行测序反应，DNA测序试剂盒、银染试剂盒均为Promega产品，操作过程按测序试剂盒手册进行。
数据分析 所得DNA序列输入计算机，经对位排列后，用分子系统发育分析软件MEGA统计各样品DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数。
结果
以上述22个样品中提得的DNA为模板，扩增得到约308 bp的Cyt b基因片段，测序结果经对位排列后得到246 bp的DNA序列(图1)，共有101个碱基变异位点，轻链中A，T，C和G的含量分别为(29.3～30.0)%，(27.2～32.1)%，(22.4～30.1)%和(11.4～13.7)%，平均为31.6%，29.5%，26.8%和12.2%。不同种间的碱基替代率(差异百分率)为(11.84～23.98)%，平均为16.85%(表2)，而乌梢蛇4个样品间的碱基替代率为(0.41～4.06)%，平均为2.52%，其余各种的种内样品间的碱基替代率为(0～2.03)%，平均为0.45%，在7个有2个以上样品的种中，种内碱基替代率总平均为1.14%，种间与种内相差15倍；不同种间的碱基颠换率为(1.63～11.38)%，平均为6.45%，种内的碱基颠换率为(0～0.81)%，平均颠换率为0.16%，二者相差40倍；转换率在种间为(6.91～13.82)%，平均为10.23%，种内为(0～3.66)%，平均为0.97%，两者相差11倍。
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讨论
本研究包括的动物种类共有10种，在有2个以上样品的7种蛇中，该Cyt b基因片段在6个种中有种内的DNA序列变异。另一方面，Cyt b基因是动物线粒体上一个编码蛋白质的基因，有一定的保守性，在我们所得的蛇类这一基因片段中，种内个体间DNA序列差异的百分数仅为(0～4.06)%，总平均为1.14%。而种间DNA序列差异在(11.84～23.98)%之间，平均为16.85%。种内DNA序列差异百分数远远低于种间的差异百分数，两者之间有非常显著的差异(P<0.01)。可见Cyt b基因在这些种内高度保守。这种在种内个体间的序列差异很小，而种间的序列差异却较大的DNA片段，正是物种鉴别的理想标记。因此，Cyt b基因片段的DNA序列是鉴别蛇类药材原动物种类的一种良好分子标记。
Tab 2 Numbers of transitions / transversions (above diagonal) and substitution percentage (below diagonal) for Cyt b gene fragment sequences of 10 species of snakes Code*
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*Codes are same to Tab 1.
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Fig 1 Alignments of Cyt b gene fragment sequences (L-strand) of 10 species of snakes (Codes are the same as in Tab 1. For species with two or more samples, the first one is from original animal).
在药材分子标记鉴定过程中，通过对药材Cyt b基因片段的DNA序列分析，将检品的Cyt b基因与正品药材的Cyt b基因的同源DNA序列进行比较，即可正确地鉴别出待检样品是否为正品药材。一般异种间该DNA片段序列差异至少大于11.84%。而正品中药材乌梢蛇种内个体间的序列差异不会大于5%(本研究中的4个不同来源的乌梢蛇样品的序列差异最大者为4.06%)。如已建立了正品和常见伪、混品种同源DNA序列的数据库，检品DNA测序后，通过与数据库中的正品乌梢蛇药材的同源DNA序列比较，即可准确地鉴别出检品是否为正品药材。反之，还可与数据库中其它种蛇的同源DNA序列比较，便可确定检品的原动物的来源。本研究通过比较蛇的Cyt b基因246 bp的同源DNA序列，可以准确地区分出中药材乌梢蛇及其混淆品。
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此外，用新鲜的原动物标本为材料提取、扩增DNA，并将扩增片段纯化和测序，结果可作为阳性对照。从图1的DNA序列中还可见，如原动物为同一种，无论DNA模板来自新鲜标本还是来自药材标本，所得DNA序列在种内个体间完全相同(见图1中Sa1，Sa2和Sa3之间，Er1和Er3之间)或仅少数碱基有差异。这种微小的差异反映了种内的遗传多样性，这一结果表明在DNA提取、扩增过程中，本实验采取的防止和去除药材被外源DNA污染的措施可行，得到的DNA片段确实来自药材标本，测序结果可靠。
用DNA序列分析的方法进行中药材DNA分子标记鉴别，只需一小块干药材，将其表面刮弃，从内部取极少量的样品即可提得足够用于PCR扩增的DNA模板，然后进行DNA序列分析研究。该方法准确性高，不同种间区别十分明显，重现性很好，不仅能鉴别药材的真伪，而且还随着某一类药材及其伪、混品DNA序列数据的积累，能准确鉴别出的伪、混品原动、植物的种类也将增多。但不足之处是该方法实验程序繁杂，技术难度较大，鉴定成本较高，在DNA提取和扩增过程中要严格防止外源DNA的污染，需要较好的实验条件。
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基金项目:国家自然科学基金(39570865)和中国博士后科学基金资助项目(No.1996[2])
*现址：南京师范大学生物系，南京 210097,Tel:(025)3729111-3328,Fax:(025)3738174,E-mail:yqw@pine.njnu.edu.cn
参考文献
1 王义权,徐珞珊,徐国钧,等.DNA分子标记鉴别在生药鉴定中的应用前景.中国中药杂志,1997,22∶583
2 王建云,王文,宿兵,等.DNA序列分析技术鉴定鸡内金的方法学研究.中国药科大学学报,1996,27∶471
3 王建云,何广新,付文,等.鹿鞭的微量DNA提取及序列鉴定.中国中药杂志,1997,22∶579
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4 吴平,周开亚,张朝晖,等.海马类药材分子遗传标记鉴定研究.药学学报,1998,33∶226
5 吴平,周开亚,徐珞珊,等.中药材龟甲分子鉴定研究.药学学报,1998,33∶309
6 吴平,周开亚,徐珞珊,等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲.中国药科大学学报,1998,28∶28
7 Mizukami H. Amplification and sequence of a 5S-rRNA gene spacer region from the crude drug “Angelica Root”. Biol Pharm Bull, 1995,18∶1299
8 王义权,周开亚.蛇类药材的商品调查及鉴定.中药材,1996,19∶285
, http://www.100md.com 9 王义权,周开亚.蛇类药材的分子遗传标记鉴别的初步研究.药学学报,1997,32∶384
10 王义权,周开亚,秦树臻.用RAPD标记检测六种蛇基因组DNA多态性.动物学报,1996,42∶172
11 Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶6196
收稿日期: 1998-01-23, http://www.100md.com(王义权* 周开亚1 徐珞珊 徐国钧)