海洋硫酸多糖911抗艾滋病毒作用及其机理研究——体内对猴免疫缺陷病毒(SIV)增殖的影响
作者：辛现良 丁华 耿美玉 梁平方 李英霞 管华诗
单位：耿美玉(山东医科大学基础医学院药理学教研室，济南 250012)；辛现良 丁华 梁平方 李英霞 管华诗(青岛海洋大学，青岛 266003)
关键词：海洋硫酸多糖911，AIDS， HIV-1，SIV，MT4，H9
中国海洋药物000602
摘 要 采用体外细胞培养技术和病毒体内感染模型，通过Elisa、定量PCR、流式细胞术等方法，研究了海洋硫酸多糖911体外对HIV-1复制及体内对SIV增殖的影响，并初步探讨其作用机制。结果发现911可明显抑制HIV-1对MT4细胞的急性感染和H9细胞的慢性感染，其半数有效浓度(EC50)分别为4.44mg.L-1和0.32mg.L-1；并可明显降低猴血浆中病毒滴度及RNA拷贝数，对血液中CD4+细胞具有一定的保护作用，同时可升高血液中病毒抗体的含量；并可明显抑制病毒逆转录酶活性，对HIV-1无明显直接灭活作用，但可明显干扰HIV-1与细胞的吸附，半数有效浓度(IC50)为36.51μg.L-1。提示911体内外均可抑制艾滋病毒的增殖，为高效的艾滋病毒增殖抑制剂，其作用机制与干扰病毒与细胞吸附、抑制病毒逆转录酶活性有关。
, 百拇医药
STUDIES OF THE ANTI-AIDS EFFECTS OF MARINE POLYSACCHARIDE DRUG 911 AND ITS RELATED MECHANISMS OF ACTION
Geng Meiyu，Ding Hua，Xin Xianliang，Liang Pingfang
(Ocean University of Qingdao,Qingdao 266003)
ABSTRACT The anti-AIDS effects of marine polysaccharide drug 911 both in vitro and in vivo were studied in this paper. The results indicated that 911 inhibited both acute and chronic infection of HIV-1 to MT4 and H9 cells with its half effect concentration (EC50) at 4.44mg.L-1 and 0.32mg.L-1 respectively in vitro. While the half toxic concentration (TC50) of 911 to MT4 cells was 7.78 kg.L-1 and that to H9 cells 7.47g.L-1. And the in vivo study showed that oral administration 911 reduced the virus titer and decreased plasma RNA copies in the macaques at doses of 64mg.d-1 and 320mg.d-1. The protective effect on CD4+ cells and antibody-increasing activity of 911 were also found. Furthermore, 911 significantly interfered the adsorption of HIV to MT4 cells and suppressed activity of reverse transcriptase. These findings indicated that 911 inhibited the viral replication both in vitro and in vivo by blocking the adsorption of virus to host cells and counteracting the activity of reverse transcriptase and modulating immune function as well.
, 百拇医药
KEY WORDS Marine polysaccharide drug 911，AIDS，SIV，HIV-1，MT4，H9
硫酸多糖类药物抗病毒作用的研究始于60年代，它是有膜病毒强有力的抑制剂。1987年发现，多糖类药物具有抑制HIV增殖的作用，其作用机制与干扰病毒和细胞的吸附、阻止病毒进入细胞、抑制合胞体形成有关[1～3]。现有抗AIDS的药物主要有逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂，但其作用环节单一，易出现耐药性，毒副作用大，不能有效控制AIDS的迅速蔓延，理想的抗AIDS药物应该在有效抑制HIV复制的同时对机体免疫功能具有保护作用，且毒副作用低。体外研究发现该药可明显抑制HIV-1对MT4细胞感染和H9细胞的慢性感染，且毒副作用小，口服易吸收，为一低毒或近似无毒的HIV-1复制抑制剂，其作用机理与干扰病毒与细胞的吸附、抑制逐转录酶活性和增强机体免疫功能有关[4、5]。911是从海藻中提取分离并经分子修饰而成的硫酸多糖类化合物，其平均分子量为6000Da。本文旨在观察其体内对猴免疫缺陷病毒(SIV)在猴体内复制的抑制作用。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 药品与试剂
911：青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供，批号970601，用时以RPMI 1640营养液配成所需浓度，过滤除菌，4℃冰箱保存备用；RPMI 1640：GIBCO公司产品；胎牛血清(NBS)：天津市川页生物制品公司，批号 960606；P24核心抗原ELISA检测试剂盒(Vironostika HIV-1 Antigen Microelisa System)：美国Organon公司产品；AZT：叠氮脱氧胸苷，威-康公司，每粒100mg；MTT：四甲基偶氮唑蓝，Poly(A)-(dT)12，Sigma公司产品；[3H]TTP([Methyl-3H]-deoxythymi-
dine-5′-triphosphate，tetrasodium salt)，Dupont 公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，华美生物工程公司进口分装；二硫苏糖醇(DTT)，Boehringer公司；dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Promega公司；病毒裂解液：0.5%Triton X-100，0.8mol*L-1 NaCl，0.5mM苯甲璜酰氟，20%甘油，50mM Tris-HCl (pH7.8)。
, 百拇医药
1.2 实验仪器
酶标仪：Bio-Rad公司；CO2培养箱：Queue公司；流式细胞仪(FACS)：Vantage，美国BD公司；液闪计数仪：Beckman公司。
1.3 实验动物
中国恒河猴，健康，一级动物，体重范围4～6kg，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光(IFA)抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性Ⅰ型病毒(STLV-Ⅰ)的感染。合格证编号：98105。用商品化膨化饲料饲养。
1.4病毒及细胞株
SIVmac239病毒株，美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠赠，静脉途径感染恒河猴，感染剂量为3MID100。HIV-1，人免疫缺陷病毒I型，TCID50为10-6.5；MT4细胞，HIV-1急性感染人T淋巴细胞体外传代株；H9细胞，HIV-1慢性感染人T淋巴细胞体外传代株；均由中国预防医学科学院病毒所提供。
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 911体内对SIV感染猴的影响
取恒河猴16只，雌雄各半，随机分为模型组、911(每只64、320mg)实验组及阳性药AZT(每只100mg)组。每只静脉注射SIVmac239病毒1mL，除模型组外，其余各组均于感染病毒后30min口服相应药物进行治疗，连续给药60d，每日给药1次。观察实验前后各组动物体重、营养状况、饮食、大小便等的变化情况；并收集感染SIV前和感染后第1、2、3、4、6、7周实验猴血浆或全血标本，采用敏感细胞株CEM×174进行培养滴定，采用定量PCR(QC-PCR)法进行病毒载量的测定[6]，采用IFA法测定荧光抗体水平，采用流式细胞术测定外周血CD4+细胞百分率及绝对数。
3 实验结果
3.1 911体内对SIV感染恒河猴的影响
, 百拇医药
一般情况观察：除全身淋巴结肿大外，动物一般情况良好，各组体重变化无明显差别，见图1。
图1 911对SIV感染猴体重的影响
Fig1 Effect of 911 on body weight of SIV-infected macaques
3.2 911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
感染对照组从感染后7d开始，所有动物血浆中均分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍存在低水平的病毒血症，而AZT治疗组10d方有病毒出现，且滴度低于对照组；911的64mg及320mg两组动物的病毒血症水平与感染对照组相比均表现出了不同程度的抑制作用，主要表现在：(1)在病毒感染后7d病毒血症出现时，两组动物病毒分离阳性率较感染对照组动物低，分别为2/4、2/4 (2)在病毒感染后2周病毒血症达到高峰时，两组动物的病毒血症水平均明显低于病毒感染对照组(3)病毒感染后3、4、6周时，两组动物均有病毒分离阴性出现，病毒分离阳性率均低于病毒感染对照组动物相对应的时间点。表明911及AZT均可显著降低血浆病毒滴度，抑制病毒增殖。结果见图2、3。
, 百拇医药
图2 911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
Fig2. Effect of 911 on the virus titer of SIV-infected macaques’plasma
图3 911对SIV感染猴体内病毒增殖的抑制作用
Fig3. Inhibitory effect of 911 on siv Viral proliferation in macaques’plasm
3.3 911对血浆病毒RNA拷贝数影响
取不同时间制备的感染SIV猴血浆，采用QC-PCR方法测定血浆中病毒RNA拷贝数，结果发现911可明显降低感染SIV猴血浆中病毒RNA拷贝数，尤以320mg效果最为明显(图4)。
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图4 911对猴血浆病毒拷贝数的影响
Fig4. Effect of 911 on the plasma RNA copies of SIV-infected macaques
3.4 911对血清抗体水平的影响
14、28、42d血浆标本用IFA法测定荧光抗体水平，结果发现911可明显升高SIV感染猴血浆病毒抗体含量(图5)。
图5 911对SIV感染猴血浆病毒抗体的影响(1∶X)
3.5 911对SIV感染猴血液CD4+淋巴细胞数的影响
, 百拇医药 911对SIV感染猴CD4+淋巴细胞具有一定的保护作用，结果见图6。
图6 911对SIV感染猴血液CD4+细胞数的影响
Fig6. Effect of 911 on the counts of CD4+ cells in SIV-infected macaques
4 讨论
本文发现911体外能明显抑制HIV-1的复制，对猴体内SIV的增殖也具有明显抑制作用，提示911是一个较强的艾滋病毒增殖抑制剂。
HIV主要攻击机体的CD4+细胞，其体内过程大致分为10个环节，即吸附、融合、脱衣、逆转录、整合、DNA复制、转录、翻译、成熟、组装释放。在吸附阶段，HIV膜表面的gp120与细胞表面的CD4受体结合，在CCR5或CCR4的帮助下，HIV的膜与细胞膜发生融合，病毒RNA脱去外壳进入细胞，在病毒逆转录酶的作用下，病毒RNA逆转录成DNA，与宿主DNA发生整合，然后随宿主DNA复制而复制、转录、翻译、组装成成熟的病毒，以出芽的方式释放出来，使宿主CD4+细胞破裂[7]。因此，阻断HIV复制过程任一环节均可影响AIDS的发病过程。911体外对HIV无直接灭活作用，细胞毒性极低，但可明显干扰HIV与细胞的吸附，提示911可作用于HIV复制过程的吸附阶段。现已证明，HIV-1外壳糖蛋白gp120的V3环区域是由一些带正电荷的氨基酸组成，这些氨基酸恰是阴离子物质的结合位点。大量文献报道表明[8]，多糖进行硫酸化修饰后，成为阴离子聚合体，带负电荷的硫酸多糖可与带正电荷的V3环区域结合，使病毒颗粒不能与CD4+细胞结合。911是经定位硫酸化修饰的带多价负电荷的多糖类化合物，因此推测，911可能通过其硫酸多糖分子的聚阴离子特性发挥抑制吸附作用。有文献报道表明，硫酸多糖类物质不影响受体单克隆抗体与HIV受体细胞的结合，提示911干扰HIV与CD4+细胞吸附的作用主要是通过影响gp120与细胞受体的亲和力，而不是通过改变细胞受体表面的结构来发挥其抑制吸附的作用，确切机制有待于进一步探讨。
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在艾滋病的发生发展中，病毒逆转录酶发挥着重要作用，因此抑制逆转录酶活性是抗HIV病毒复制的关键环节。911与细胞和病毒共同培养，在不同时间内检测培养上清液中的逆转录酶活性发现911对逆转录酶活性有明显的抑制作用。关于硫酸多糖类化合物对逆转录酶活性的影响报道甚少。现有学者认为，硫酸多糖分子中硫酸化侧链与模板引物上的某些酶具有相同的结合位点，从而产生竞争性抑制作用。但911究竟是通过何种作用机制来影响病毒的逆转录过程还有待于在以后的研究中阐明。
由于艾滋病的病理特点是HIV选择性攻击患者的CD4+细胞，故具有一定的宿主特异性，致使目前缺乏合适的艾滋病动物模型，造成抗艾滋病药物动物体内筛选具有一定的困难性[8]。猴免疫缺陷病毒(SIV)具有与HIV相同的生活周期，可选择性攻击猴CD4+细胞，且恒河猴感染SIV后出现与人艾滋病相似的发病过程和病理特征，因此，艾滋病猴是当前用于筛选抗艾滋病药物较理想的动物模型[9]。本文选用SIVmac239静脉注射感染恒河猴，感染病毒7d后动物血浆中可分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，之后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍有一半动物存在低水平的病毒血症；血浆病毒RNA的测定结果与病毒滴度的结果相一致，以上指标符合SIVmac239的感染特征[10]，911于药后第2周始可明显降低感染SIV猴血浆病毒滴度和血浆病毒RNA拷贝数，表明911对猴体内SIV增殖具有明显的抑制作用。
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HIV感染机体后，可通过攻击CD4+细胞而使T、B细胞特别是T细胞功能受损，最终导致机体免疫功能低下或缺陷；但机体感染艾滋病毒之后血浆中病毒抗体可显著增加，这是机体自身免疫保护作用的体现。本文研究发现911对感染SIV猴血液病毒抗体量具有明显升高作用，提示911可能是通过增强猴机体免疫功能来对抗SIV的病毒感染。其实关于911的免疫调节作用本实验室早有报道。前期研究工作表明，911对正常小鼠的非特异性免疫系统和特异性免疫系统均有明显的调节作用，同时对免疫功能低下小鼠也具有较好的免疫增强作用[11]。提示911对艾滋病猴血液抗体的升高作用可能是通过保护CD4+细胞免受损伤、增强T、B淋巴细胞的反应能力、促进细胞因子的相互作用，进而调节机体免疫功能来实现的。
目前，CD4+细胞数的多少已作为判断艾滋病病程进展或诊断疾病好转的一个确切指标[12]。HIV-1选择性攻击和破坏机体的CD4+细胞，造成CD4+细胞数显著下降，且下降程度与病毒增殖的速度密切相关，同时CD4+细胞数在很大程度上能代表血液病毒RNA水平，因此，通过评价CD4+细胞数的多少基本上能反映疾病的进展情况。本实验研究发现恒河猴感染SIVmac239后，病毒mRNA拷贝数出现的谷值时间与CD4+细胞数目减少的峰值时间基本吻合。911能明显保护CD4+淋巴细胞免受SIV的破坏，且对CD4+淋巴细胞的保护程度与其降低病毒RNA拷贝数、缓解感染症状密切相关。911对CD4+淋巴细胞的保护机制可能与其抑制病毒增殖、增强机体免疫功能有关。
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总之，911体内外对艾滋病毒的增殖均具有明显抑制作用，其作用机理与干扰病毒与细胞的吸附、抑制病毒逆转录酶活性及提高机体免疫功能有关，有望成为一类作用于多环节的新型抗艾滋病海洋药物。
国家海洋“863”资助项目(编号 819-05-22)
参考文献：
1，Ito M， Baba M，Sato A，et al.Inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on the replication of human immunodeficiency virus(HIV) in vitro.Antiviral Res， 1987， 7：361
2，Moriya T， Kurita H， Matsumoto K，et al.Potent inhibitory effect of a series of modified cyclodextrin sulfates (mCDS) on the replication of HIV-1 in vitro.J Med Chem，1991，34：2301
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3，Otake T.Modified cyclodextrin sulfates(mCDS) have potent inhibitory activity against HIV and high oral bioavailability.Antiviral Chem & chemother,1994，5：155～161
4，辛现良，耿美玉，李桂玲，等.海洋硫酸多糖911体外对HIV-1作用的研究.中国海洋药物，2000，19(3)：8～11
5，辛现良，耿美玉，管华诗，等.海洋硫酸多糖911抗AIDS作用机制的初步探讨.中国海洋药物，2000，19(4)：15～18
6，Lillo FB，Ciuffreda D，Veglia F，et al，Viral load and burden modification following early antiretroviral therapy of primary HIV-1 infection. AIDS，1999，13：791
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7，De Clercq E. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections. Clin Microbiol Rev，1995，8：200～239
8，Mckeating JA,Willey RA. Structure and function of the HIV envelop. AIDS， 1989，3：35～41
9，Kimata JT，Kuller L，Anderson DB，et al.Emerging cytopathic and antigenic simian immunodeficiency virus variants influence AIDS progression. Nat Med， 1999， 5：535
10，Van Rompay KK，Cherrington JM，Marthas ML，et al.9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl] adenine (PMPA) therapy prolongs survival of infant macaques inoculated with simian immunodeficiency virus with reduced susceptibility to PMPA. Antimicrob Agents Chemother， 1999，43(4)： 802
11，Silvera P，Racz P，Racz K，et al. Effect of PMPA and PMEA on the kinetics of viral load in simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS Research and Human Retroviruses，2000，16(8)：791
12，王文涛，管华诗.海藻硫酸多糖“911”对小鼠淋巴细胞增殖反应及对细胞产生IL-2作用的影响. 青岛海洋大学学报(海洋药物专辑)，1992：16～18
(收稿日期：2000-08-16), 百拇医药
单位：耿美玉(山东医科大学基础医学院药理学教研室，济南 250012)；辛现良 丁华 梁平方 李英霞 管华诗(青岛海洋大学，青岛 266003)
关键词：海洋硫酸多糖911，AIDS， HIV-1，SIV，MT4，H9
中国海洋药物000602
摘 要 采用体外细胞培养技术和病毒体内感染模型，通过Elisa、定量PCR、流式细胞术等方法，研究了海洋硫酸多糖911体外对HIV-1复制及体内对SIV增殖的影响，并初步探讨其作用机制。结果发现911可明显抑制HIV-1对MT4细胞的急性感染和H9细胞的慢性感染，其半数有效浓度(EC50)分别为4.44mg.L-1和0.32mg.L-1；并可明显降低猴血浆中病毒滴度及RNA拷贝数，对血液中CD4+细胞具有一定的保护作用，同时可升高血液中病毒抗体的含量；并可明显抑制病毒逆转录酶活性，对HIV-1无明显直接灭活作用，但可明显干扰HIV-1与细胞的吸附，半数有效浓度(IC50)为36.51μg.L-1。提示911体内外均可抑制艾滋病毒的增殖，为高效的艾滋病毒增殖抑制剂，其作用机制与干扰病毒与细胞吸附、抑制病毒逆转录酶活性有关。
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STUDIES OF THE ANTI-AIDS EFFECTS OF MARINE POLYSACCHARIDE DRUG 911 AND ITS RELATED MECHANISMS OF ACTION
Geng Meiyu，Ding Hua，Xin Xianliang，Liang Pingfang
(Ocean University of Qingdao,Qingdao 266003)
ABSTRACT The anti-AIDS effects of marine polysaccharide drug 911 both in vitro and in vivo were studied in this paper. The results indicated that 911 inhibited both acute and chronic infection of HIV-1 to MT4 and H9 cells with its half effect concentration (EC50) at 4.44mg.L-1 and 0.32mg.L-1 respectively in vitro. While the half toxic concentration (TC50) of 911 to MT4 cells was 7.78 kg.L-1 and that to H9 cells 7.47g.L-1. And the in vivo study showed that oral administration 911 reduced the virus titer and decreased plasma RNA copies in the macaques at doses of 64mg.d-1 and 320mg.d-1. The protective effect on CD4+ cells and antibody-increasing activity of 911 were also found. Furthermore, 911 significantly interfered the adsorption of HIV to MT4 cells and suppressed activity of reverse transcriptase. These findings indicated that 911 inhibited the viral replication both in vitro and in vivo by blocking the adsorption of virus to host cells and counteracting the activity of reverse transcriptase and modulating immune function as well.
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KEY WORDS Marine polysaccharide drug 911，AIDS，SIV，HIV-1，MT4，H9
硫酸多糖类药物抗病毒作用的研究始于60年代，它是有膜病毒强有力的抑制剂。1987年发现，多糖类药物具有抑制HIV增殖的作用，其作用机制与干扰病毒和细胞的吸附、阻止病毒进入细胞、抑制合胞体形成有关[1～3]。现有抗AIDS的药物主要有逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂，但其作用环节单一，易出现耐药性，毒副作用大，不能有效控制AIDS的迅速蔓延，理想的抗AIDS药物应该在有效抑制HIV复制的同时对机体免疫功能具有保护作用，且毒副作用低。体外研究发现该药可明显抑制HIV-1对MT4细胞感染和H9细胞的慢性感染，且毒副作用小，口服易吸收，为一低毒或近似无毒的HIV-1复制抑制剂，其作用机理与干扰病毒与细胞的吸附、抑制逐转录酶活性和增强机体免疫功能有关[4、5]。911是从海藻中提取分离并经分子修饰而成的硫酸多糖类化合物，其平均分子量为6000Da。本文旨在观察其体内对猴免疫缺陷病毒(SIV)在猴体内复制的抑制作用。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 药品与试剂
911：青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供，批号970601，用时以RPMI 1640营养液配成所需浓度，过滤除菌，4℃冰箱保存备用；RPMI 1640：GIBCO公司产品；胎牛血清(NBS)：天津市川页生物制品公司，批号 960606；P24核心抗原ELISA检测试剂盒(Vironostika HIV-1 Antigen Microelisa System)：美国Organon公司产品；AZT：叠氮脱氧胸苷，威-康公司，每粒100mg；MTT：四甲基偶氮唑蓝，Poly(A)-(dT)12，Sigma公司产品；[3H]TTP([Methyl-3H]-deoxythymi-
dine-5′-triphosphate，tetrasodium salt)，Dupont 公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，华美生物工程公司进口分装；二硫苏糖醇(DTT)，Boehringer公司；dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Promega公司；病毒裂解液：0.5%Triton X-100，0.8mol*L-1 NaCl，0.5mM苯甲璜酰氟，20%甘油，50mM Tris-HCl (pH7.8)。
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1.2 实验仪器
酶标仪：Bio-Rad公司；CO2培养箱：Queue公司；流式细胞仪(FACS)：Vantage，美国BD公司；液闪计数仪：Beckman公司。
1.3 实验动物
中国恒河猴，健康，一级动物，体重范围4～6kg，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光(IFA)抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性Ⅰ型病毒(STLV-Ⅰ)的感染。合格证编号：98105。用商品化膨化饲料饲养。
1.4病毒及细胞株
SIVmac239病毒株，美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠赠，静脉途径感染恒河猴，感染剂量为3MID100。HIV-1，人免疫缺陷病毒I型，TCID50为10-6.5；MT4细胞，HIV-1急性感染人T淋巴细胞体外传代株；H9细胞，HIV-1慢性感染人T淋巴细胞体外传代株；均由中国预防医学科学院病毒所提供。
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2 实验方法
2.1 911体内对SIV感染猴的影响
取恒河猴16只，雌雄各半，随机分为模型组、911(每只64、320mg)实验组及阳性药AZT(每只100mg)组。每只静脉注射SIVmac239病毒1mL，除模型组外，其余各组均于感染病毒后30min口服相应药物进行治疗，连续给药60d，每日给药1次。观察实验前后各组动物体重、营养状况、饮食、大小便等的变化情况；并收集感染SIV前和感染后第1、2、3、4、6、7周实验猴血浆或全血标本，采用敏感细胞株CEM×174进行培养滴定，采用定量PCR(QC-PCR)法进行病毒载量的测定[6]，采用IFA法测定荧光抗体水平，采用流式细胞术测定外周血CD4+细胞百分率及绝对数。
3 实验结果
3.1 911体内对SIV感染恒河猴的影响
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一般情况观察：除全身淋巴结肿大外，动物一般情况良好，各组体重变化无明显差别，见图1。
图1 911对SIV感染猴体重的影响
Fig1 Effect of 911 on body weight of SIV-infected macaques
3.2 911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
感染对照组从感染后7d开始，所有动物血浆中均分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍存在低水平的病毒血症，而AZT治疗组10d方有病毒出现，且滴度低于对照组；911的64mg及320mg两组动物的病毒血症水平与感染对照组相比均表现出了不同程度的抑制作用，主要表现在：(1)在病毒感染后7d病毒血症出现时，两组动物病毒分离阳性率较感染对照组动物低，分别为2/4、2/4 (2)在病毒感染后2周病毒血症达到高峰时，两组动物的病毒血症水平均明显低于病毒感染对照组(3)病毒感染后3、4、6周时，两组动物均有病毒分离阴性出现，病毒分离阳性率均低于病毒感染对照组动物相对应的时间点。表明911及AZT均可显著降低血浆病毒滴度，抑制病毒增殖。结果见图2、3。
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图2 911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
Fig2. Effect of 911 on the virus titer of SIV-infected macaques’plasma
图3 911对SIV感染猴体内病毒增殖的抑制作用
Fig3. Inhibitory effect of 911 on siv Viral proliferation in macaques’plasm
3.3 911对血浆病毒RNA拷贝数影响
取不同时间制备的感染SIV猴血浆，采用QC-PCR方法测定血浆中病毒RNA拷贝数，结果发现911可明显降低感染SIV猴血浆中病毒RNA拷贝数，尤以320mg效果最为明显(图4)。
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图4 911对猴血浆病毒拷贝数的影响
Fig4. Effect of 911 on the plasma RNA copies of SIV-infected macaques
3.4 911对血清抗体水平的影响
14、28、42d血浆标本用IFA法测定荧光抗体水平，结果发现911可明显升高SIV感染猴血浆病毒抗体含量(图5)。
图5 911对SIV感染猴血浆病毒抗体的影响(1∶X)
3.5 911对SIV感染猴血液CD4+淋巴细胞数的影响
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图6 911对SIV感染猴血液CD4+细胞数的影响
Fig6. Effect of 911 on the counts of CD4+ cells in SIV-infected macaques
4 讨论
本文发现911体外能明显抑制HIV-1的复制，对猴体内SIV的增殖也具有明显抑制作用，提示911是一个较强的艾滋病毒增殖抑制剂。
HIV主要攻击机体的CD4+细胞，其体内过程大致分为10个环节，即吸附、融合、脱衣、逆转录、整合、DNA复制、转录、翻译、成熟、组装释放。在吸附阶段，HIV膜表面的gp120与细胞表面的CD4受体结合，在CCR5或CCR4的帮助下，HIV的膜与细胞膜发生融合，病毒RNA脱去外壳进入细胞，在病毒逆转录酶的作用下，病毒RNA逆转录成DNA，与宿主DNA发生整合，然后随宿主DNA复制而复制、转录、翻译、组装成成熟的病毒，以出芽的方式释放出来，使宿主CD4+细胞破裂[7]。因此，阻断HIV复制过程任一环节均可影响AIDS的发病过程。911体外对HIV无直接灭活作用，细胞毒性极低，但可明显干扰HIV与细胞的吸附，提示911可作用于HIV复制过程的吸附阶段。现已证明，HIV-1外壳糖蛋白gp120的V3环区域是由一些带正电荷的氨基酸组成，这些氨基酸恰是阴离子物质的结合位点。大量文献报道表明[8]，多糖进行硫酸化修饰后，成为阴离子聚合体，带负电荷的硫酸多糖可与带正电荷的V3环区域结合，使病毒颗粒不能与CD4+细胞结合。911是经定位硫酸化修饰的带多价负电荷的多糖类化合物，因此推测，911可能通过其硫酸多糖分子的聚阴离子特性发挥抑制吸附作用。有文献报道表明，硫酸多糖类物质不影响受体单克隆抗体与HIV受体细胞的结合，提示911干扰HIV与CD4+细胞吸附的作用主要是通过影响gp120与细胞受体的亲和力，而不是通过改变细胞受体表面的结构来发挥其抑制吸附的作用，确切机制有待于进一步探讨。
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在艾滋病的发生发展中，病毒逆转录酶发挥着重要作用，因此抑制逆转录酶活性是抗HIV病毒复制的关键环节。911与细胞和病毒共同培养，在不同时间内检测培养上清液中的逆转录酶活性发现911对逆转录酶活性有明显的抑制作用。关于硫酸多糖类化合物对逆转录酶活性的影响报道甚少。现有学者认为，硫酸多糖分子中硫酸化侧链与模板引物上的某些酶具有相同的结合位点，从而产生竞争性抑制作用。但911究竟是通过何种作用机制来影响病毒的逆转录过程还有待于在以后的研究中阐明。
由于艾滋病的病理特点是HIV选择性攻击患者的CD4+细胞，故具有一定的宿主特异性，致使目前缺乏合适的艾滋病动物模型，造成抗艾滋病药物动物体内筛选具有一定的困难性[8]。猴免疫缺陷病毒(SIV)具有与HIV相同的生活周期，可选择性攻击猴CD4+细胞，且恒河猴感染SIV后出现与人艾滋病相似的发病过程和病理特征，因此，艾滋病猴是当前用于筛选抗艾滋病药物较理想的动物模型[9]。本文选用SIVmac239静脉注射感染恒河猴，感染病毒7d后动物血浆中可分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，之后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍有一半动物存在低水平的病毒血症；血浆病毒RNA的测定结果与病毒滴度的结果相一致，以上指标符合SIVmac239的感染特征[10]，911于药后第2周始可明显降低感染SIV猴血浆病毒滴度和血浆病毒RNA拷贝数，表明911对猴体内SIV增殖具有明显的抑制作用。
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HIV感染机体后，可通过攻击CD4+细胞而使T、B细胞特别是T细胞功能受损，最终导致机体免疫功能低下或缺陷；但机体感染艾滋病毒之后血浆中病毒抗体可显著增加，这是机体自身免疫保护作用的体现。本文研究发现911对感染SIV猴血液病毒抗体量具有明显升高作用，提示911可能是通过增强猴机体免疫功能来对抗SIV的病毒感染。其实关于911的免疫调节作用本实验室早有报道。前期研究工作表明，911对正常小鼠的非特异性免疫系统和特异性免疫系统均有明显的调节作用，同时对免疫功能低下小鼠也具有较好的免疫增强作用[11]。提示911对艾滋病猴血液抗体的升高作用可能是通过保护CD4+细胞免受损伤、增强T、B淋巴细胞的反应能力、促进细胞因子的相互作用，进而调节机体免疫功能来实现的。
目前，CD4+细胞数的多少已作为判断艾滋病病程进展或诊断疾病好转的一个确切指标[12]。HIV-1选择性攻击和破坏机体的CD4+细胞，造成CD4+细胞数显著下降，且下降程度与病毒增殖的速度密切相关，同时CD4+细胞数在很大程度上能代表血液病毒RNA水平，因此，通过评价CD4+细胞数的多少基本上能反映疾病的进展情况。本实验研究发现恒河猴感染SIVmac239后，病毒mRNA拷贝数出现的谷值时间与CD4+细胞数目减少的峰值时间基本吻合。911能明显保护CD4+淋巴细胞免受SIV的破坏，且对CD4+淋巴细胞的保护程度与其降低病毒RNA拷贝数、缓解感染症状密切相关。911对CD4+淋巴细胞的保护机制可能与其抑制病毒增殖、增强机体免疫功能有关。
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总之，911体内外对艾滋病毒的增殖均具有明显抑制作用，其作用机理与干扰病毒与细胞的吸附、抑制病毒逆转录酶活性及提高机体免疫功能有关，有望成为一类作用于多环节的新型抗艾滋病海洋药物。
国家海洋“863”资助项目(编号 819-05-22)
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(收稿日期：2000-08-16), 百拇医药