RP-HPLC法测定三相避孕片含量和含量均匀度的研究
作者：王秀兰 肖娟 詹祥静 马鹏
单位：王秀兰 肖娟 詹祥静：华西医科大学制药厂；马鹏：药学院 成都 610041
关键词：三相避孕片；炔雌醇；左旋甲基炔诺酮；反相高效液相色谱测定法；二极管阵列检测
RP 提要 建立的三相避孕片的反相高效液相色谱测定法，能同时测定炔雌醇和左旋甲基炔诺酮的含量。用C18柱，检测波长220nm，流动相为甲醇-水(70∶30)。炔雌醇的回收率为99.53%，RSD为1.15%，左旋甲基炔诺酮的回收率为99.71%，RSD为1.87%。该方法准确、灵敏、简便、快速。
STUDIES ON THE QUANTITATION AND UNIFORMITY
OF DOSAGE UNITS OF TRIPHASE CONTRACEPTIVE
, 百拇医药
TABLETS BY RP-HPLC
Wang Xiulan Xiao Juan Zhan Xiangjing Ma Peng*
(Pharmaceutical Factory, School of Pharmacy*, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT An RP-HPLC method for the simultaneous determination of ethinyl estradiol and levonorgestrel in triphase contraceptive tablets was estalished, the method was also applied in its uniformity of dosage units study. Using Shimpack CLC ODS(4.6 mm×150 mm) column with methanol-water (70∶30) as mobile phase, detection UV 220 nm. The recovery was 99.53%(RSD was 1.15%) and 99.71(RSD was 1.87%) for ethinyl estradiol and levonorgestrel, respectively. The established method was proved to be rapid, sensitive and have a good reproducibility.
, 百拇医药
Key Words RP-HPLC Ethinyl estradiol Levonorgestrel Triphase contraceptive tablets Diode arrayed detection
三相避孕片是由炔雌醇(ethinyl estradiol, EE)和左旋甲基炔诺酮(levonorgestrel, LNG)组成的复方制剂。其中孕、雌激素的剂量是模拟正常人月经周期中内源性孕、雌激素变化峰值，把一个月应服药的21d分成三个时相，分别为棕色片、白色片和黄色片。而各时相药片剂量不相同，每片含LNG分别为125、75、50 μg，含EE分别为30、40、30 μg。该药配方合理，避孕效果可靠，主药含量低，副作用小，国内外使用已日臻广泛[1]。该类制剂常采用氯仿提取—比色法[2]分别测定EE和LNG含量，繁杂费时，提取过程中极易乳化，分离不好。特别是当含量较小时，干扰因素大，效果不理想，对逐片测定含量均匀度非常困难。为此，建立了RP-HPLC法，对三相避孕片的含量和含量均匀度测定进行了研究。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和试药
日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；SPD-M10A二极管阵列检测器；CQ-250超声振荡器；TGL-16G高速离心机。炔雌醇、左旋甲基炔诺酮对照品和内标物醋酸可的松(中国药品生物制品检定所)；三相避孕片和空白片(华西医科大学制药厂)；其它试剂均为A.R或色谱纯。
1.2 色谱系统研究
1.2.1 流动相和内标物选择 比较了乙腈-甲醇-水系统和甲醇-水系统，确定了简单经济的甲醇-水系统。试验考察了多种内标物，确定醋酸可的松为内标，该内标物与二组分既能达到完全分离，且在10 min即可完成测定(图1)。
, 百拇医药
Fig 1 Chromatograms of blank tablet (A),reference substance and internal standard solutions (B) and triphase tablets (C)
a Internal standard b EE c LNG
1.2.2 波长选择 为一次完成测定，使复方制剂三相避孕片中EE和LNG的灵敏度达到最佳，且使EE有更高的灵敏度，经DAD检测(图2)，确定检测波长为220 nm。
Fig 2 DAD chromatogram of EE(a),LNG(b) and internal standard (c)
, 百拇医药
1.2.3 色谱柱选择 为使测定方法有更好的适用性，分别采用了Shimpack C18柱、PE C18柱和Intertsil ODS柱，均分离良好。
1.2.4 色谱条件 分析柱为Shimpack ODS柱(4.6 mm×150 mm)；流动相为甲醇-水(70∶30)；检测波长为220 nm；流速1.0 ml/min；柱温30℃；灵敏度为0.08 AUFS。在此条件下对照品和样品按LNG峰计算，理论塔板数为4 900；峰对称因子为1.0；LNG与EE分离度R>1.5。
1.3 实验方法和结果
1.3.1 对照溶液和内标溶液的制备 取EE和LNG对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释成1.2 mg/ml和2.4mg/ml的混合溶液。取醋酸可的松适量，精密称定，用流动相溶解并稀释成1.0 mg/ml溶液。
1.3.2 供试品溶液的制备 取各时相片适量，精密加入内标溶液适量，超声振荡，离心，上清液即为供试品溶液。
, http://www.100md.com
1.3.3 线性试验 精密量取混合对照品溶液适量，并精密加入内标溶液，制成不同浓度的对照溶液系列，准确进样，分别以与内标的峰面积比为纵坐标(Y1，Y2)，以EE、LNG相应浓度为横坐标(X1，X2)，进行回归，结果表明，EE在0.004～4 μg，LNG在0.004～5 μg范围内，供试品与内标的峰面积比和浓度呈良好线性关系(n＝6)。回归方程为：
Y1=1.0552X1+5.7×10-4 r1=0.9999；
Y2=1.0401X2+3.5×10-3 r2=0.9999。
1.3.4 精密度 取供试溶液10 μl，重复进样6次，EE的RSD为1.17%，LNG的RSD为1.28%。
, 百拇医药
1.3.5 最低检出量 EE与LNG最低检出量均小于6 ng(S/N=3∶1)。
1.3.6 回收率试验 空白片中加入一定量的对照溶液和内标溶液，按“1.3.2”项下进行，结果见表1。
Table 1 The results of recovery test
Drug
No
Added
(μg)
Measured
(μg)
Recovery
, 百拇医药
(%)
Acverage recovery
(%)
RSD
(%)
EE
1
0.3560
0.3556
99.89
2
0.3560
0.3590
, http://www.100md.com
100.84
3
0.4500
0.4460
99.91
99.53
1.15
4
0.4500
0.4490
99.78
5
0.6155
, 百拇医药
0.6160
100.08
6
0.6155
0.6001
97.50
LNG
1
0.6428
0.6480
100.81
2
0.6428
, http://www.100md.com
0.6300
98.01
3
0.8572
0.8376
97.72
99.71
1.87
4
0.8572
0.8442
98.48
5
, 百拇医药
1.1328
1.1568
102.12
6
1.1328
1.1456
101.13
1.4 含量测定
取各时相供试品(5～8)片，按“1.3.2”项下进行，结果见表2。 Table 2 Sample assay results (labelled content%)
Batch
No.
, http://www.100md.com
Brown tablet
White tablet
Yellow tablet
EE
LNG
EE
LNG
EE
LNG
921001
100.42
101.36
, 百拇医药 101.64
96.77
100.37
99.74
921002
98.00
99.53
102.44
98.71
102.88
100.67
921003
102.27
, http://www.100md.com
101.76
98.24
96.90
101.00
100.46
950301-1
100.78
100.24
99.76
99.84
98.06
100.49
, 百拇医药 950301-2
101.94
99.33
100.10
97.17
98.12
98.30
1.5 含量均匀度测定
分别取各时相供试品1片，按“1.3.2”项下进行，结果见表3。结果表明两批供试品的含量均匀度符合中国药典1995年版中规定。 Table 3 Results of uniformity of dosage units tests (labelled content%,n=10)
, http://www.100md.com
Batch
No.
Yellow tablet
White tablet
Brown tablet
EE
LNG
EE
LNG
EE
LNG
950301-1
, 百拇医药
97.99
98.91
97.94
96.64
101.10
99.10
S
4.01
2.93
1.94
1.67
2.86
2.38
, 百拇医药
A+1.80S
9.22
6.37
5.55
6.37
6.25
4.29
950301-2
106.20
104.44
, 百拇医药
99.23
98.26
103.64
101.19
S
3.75
3.63
4.06
3.36
3.25
3.29
A+1.80S
12.95
, http://www.100md.com
10.97
8.07
7.78
9.48
7.10
2 讨论
2.1 三相避孕片中EE和LNG含量低，活性强，为保证用药的安全和有效，必须进行含量和含量均匀度测定。
2.2 所建立的方法，只需将30片药片分别置于30只试管中，超声20～30 min，离心后即可供进样分析，一天内能同时完成二个组分的测定。表明该法简便、快速、适用于常规分析，尤其有利于含量均匀度测定。
2.3 分离可行性考察结果表明，在EE、LNG出峰处，空白(辅料)均无干扰，分离度>1.5。
参考文献
1 李晓麟，袁如琴，万启智等.国产复方甲基炔诺酮三相片临床应用的初步研究.实用妇产科学杂志，1991，6∶304
2 中国药典.二部.1990.363, http://www.100md.com
单位：王秀兰 肖娟 詹祥静：华西医科大学制药厂；马鹏：药学院 成都 610041
关键词：三相避孕片；炔雌醇；左旋甲基炔诺酮；反相高效液相色谱测定法；二极管阵列检测
RP 提要 建立的三相避孕片的反相高效液相色谱测定法，能同时测定炔雌醇和左旋甲基炔诺酮的含量。用C18柱，检测波长220nm，流动相为甲醇-水(70∶30)。炔雌醇的回收率为99.53%，RSD为1.15%，左旋甲基炔诺酮的回收率为99.71%，RSD为1.87%。该方法准确、灵敏、简便、快速。
STUDIES ON THE QUANTITATION AND UNIFORMITY
OF DOSAGE UNITS OF TRIPHASE CONTRACEPTIVE
, 百拇医药
TABLETS BY RP-HPLC
Wang Xiulan Xiao Juan Zhan Xiangjing Ma Peng*
(Pharmaceutical Factory, School of Pharmacy*, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT An RP-HPLC method for the simultaneous determination of ethinyl estradiol and levonorgestrel in triphase contraceptive tablets was estalished, the method was also applied in its uniformity of dosage units study. Using Shimpack CLC ODS(4.6 mm×150 mm) column with methanol-water (70∶30) as mobile phase, detection UV 220 nm. The recovery was 99.53%(RSD was 1.15%) and 99.71(RSD was 1.87%) for ethinyl estradiol and levonorgestrel, respectively. The established method was proved to be rapid, sensitive and have a good reproducibility.
, 百拇医药
Key Words RP-HPLC Ethinyl estradiol Levonorgestrel Triphase contraceptive tablets Diode arrayed detection
三相避孕片是由炔雌醇(ethinyl estradiol, EE)和左旋甲基炔诺酮(levonorgestrel, LNG)组成的复方制剂。其中孕、雌激素的剂量是模拟正常人月经周期中内源性孕、雌激素变化峰值，把一个月应服药的21d分成三个时相，分别为棕色片、白色片和黄色片。而各时相药片剂量不相同，每片含LNG分别为125、75、50 μg，含EE分别为30、40、30 μg。该药配方合理，避孕效果可靠，主药含量低，副作用小，国内外使用已日臻广泛[1]。该类制剂常采用氯仿提取—比色法[2]分别测定EE和LNG含量，繁杂费时，提取过程中极易乳化，分离不好。特别是当含量较小时，干扰因素大，效果不理想，对逐片测定含量均匀度非常困难。为此，建立了RP-HPLC法，对三相避孕片的含量和含量均匀度测定进行了研究。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和试药
日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；SPD-M10A二极管阵列检测器；CQ-250超声振荡器；TGL-16G高速离心机。炔雌醇、左旋甲基炔诺酮对照品和内标物醋酸可的松(中国药品生物制品检定所)；三相避孕片和空白片(华西医科大学制药厂)；其它试剂均为A.R或色谱纯。
1.2 色谱系统研究
1.2.1 流动相和内标物选择 比较了乙腈-甲醇-水系统和甲醇-水系统，确定了简单经济的甲醇-水系统。试验考察了多种内标物，确定醋酸可的松为内标，该内标物与二组分既能达到完全分离，且在10 min即可完成测定(图1)。
, 百拇医药
Fig 1 Chromatograms of blank tablet (A),reference substance and internal standard solutions (B) and triphase tablets (C)
a Internal standard b EE c LNG
1.2.2 波长选择 为一次完成测定，使复方制剂三相避孕片中EE和LNG的灵敏度达到最佳，且使EE有更高的灵敏度，经DAD检测(图2)，确定检测波长为220 nm。
Fig 2 DAD chromatogram of EE(a),LNG(b) and internal standard (c)
, 百拇医药
1.2.3 色谱柱选择 为使测定方法有更好的适用性，分别采用了Shimpack C18柱、PE C18柱和Intertsil ODS柱，均分离良好。
1.2.4 色谱条件 分析柱为Shimpack ODS柱(4.6 mm×150 mm)；流动相为甲醇-水(70∶30)；检测波长为220 nm；流速1.0 ml/min；柱温30℃；灵敏度为0.08 AUFS。在此条件下对照品和样品按LNG峰计算，理论塔板数为4 900；峰对称因子为1.0；LNG与EE分离度R>1.5。
1.3 实验方法和结果
1.3.1 对照溶液和内标溶液的制备 取EE和LNG对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释成1.2 mg/ml和2.4mg/ml的混合溶液。取醋酸可的松适量，精密称定，用流动相溶解并稀释成1.0 mg/ml溶液。
1.3.2 供试品溶液的制备 取各时相片适量，精密加入内标溶液适量，超声振荡，离心，上清液即为供试品溶液。
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1.3.3 线性试验 精密量取混合对照品溶液适量，并精密加入内标溶液，制成不同浓度的对照溶液系列，准确进样，分别以与内标的峰面积比为纵坐标(Y1，Y2)，以EE、LNG相应浓度为横坐标(X1，X2)，进行回归，结果表明，EE在0.004～4 μg，LNG在0.004～5 μg范围内，供试品与内标的峰面积比和浓度呈良好线性关系(n＝6)。回归方程为：
Y1=1.0552X1+5.7×10-4 r1=0.9999；
Y2=1.0401X2+3.5×10-3 r2=0.9999。
1.3.4 精密度 取供试溶液10 μl，重复进样6次，EE的RSD为1.17%，LNG的RSD为1.28%。
, 百拇医药
1.3.5 最低检出量 EE与LNG最低检出量均小于6 ng(S/N=3∶1)。
1.3.6 回收率试验 空白片中加入一定量的对照溶液和内标溶液，按“1.3.2”项下进行，结果见表1。
Table 1 The results of recovery test
Drug
No
Added
(μg)
Measured
(μg)
Recovery
, 百拇医药
(%)
Acverage recovery
(%)
RSD
(%)
EE
1
0.3560
0.3556
99.89
2
0.3560
0.3590
, http://www.100md.com
100.84
3
0.4500
0.4460
99.91
99.53
1.15
4
0.4500
0.4490
99.78
5
0.6155
, 百拇医药
0.6160
100.08
6
0.6155
0.6001
97.50
LNG
1
0.6428
0.6480
100.81
2
0.6428
, http://www.100md.com
0.6300
98.01
3
0.8572
0.8376
97.72
99.71
1.87
4
0.8572
0.8442
98.48
5
, 百拇医药
1.1328
1.1568
102.12
6
1.1328
1.1456
101.13
1.4 含量测定
取各时相供试品(5～8)片，按“1.3.2”项下进行，结果见表2。 Table 2 Sample assay results (labelled content%)
Batch
No.
, http://www.100md.com
Brown tablet
White tablet
Yellow tablet
EE
LNG
EE
LNG
EE
LNG
921001
100.42
101.36
, 百拇医药 101.64
96.77
100.37
99.74
921002
98.00
99.53
102.44
98.71
102.88
100.67
921003
102.27
, http://www.100md.com
101.76
98.24
96.90
101.00
100.46
950301-1
100.78
100.24
99.76
99.84
98.06
100.49
, 百拇医药 950301-2
101.94
99.33
100.10
97.17
98.12
98.30
1.5 含量均匀度测定
分别取各时相供试品1片，按“1.3.2”项下进行，结果见表3。结果表明两批供试品的含量均匀度符合中国药典1995年版中规定。 Table 3 Results of uniformity of dosage units tests (labelled content%,n=10)
, http://www.100md.com
Batch
No.
Yellow tablet
White tablet
Brown tablet
EE
LNG
EE
LNG
EE
LNG
950301-1
, 百拇医药
97.99
98.91
97.94
96.64
101.10
99.10
S
4.01
2.93
1.94
1.67
2.86
2.38
, 百拇医药
A+1.80S
9.22
6.37
5.55
6.37
6.25
4.29
950301-2
106.20
104.44
, 百拇医药
99.23
98.26
103.64
101.19
S
3.75
3.63
4.06
3.36
3.25
3.29
A+1.80S
12.95
, http://www.100md.com
10.97
8.07
7.78
9.48
7.10
2 讨论
2.1 三相避孕片中EE和LNG含量低，活性强，为保证用药的安全和有效，必须进行含量和含量均匀度测定。
2.2 所建立的方法，只需将30片药片分别置于30只试管中，超声20～30 min，离心后即可供进样分析，一天内能同时完成二个组分的测定。表明该法简便、快速、适用于常规分析，尤其有利于含量均匀度测定。
2.3 分离可行性考察结果表明，在EE、LNG出峰处，空白(辅料)均无干扰，分离度>1.5。
参考文献
1 李晓麟，袁如琴，万启智等.国产复方甲基炔诺酮三相片临床应用的初步研究.实用妇产科学杂志，1991，6∶304
2 中国药典.二部.1990.363, http://www.100md.com