ELISA测定牛奶、猪血浆和猪尿中的磺胺二甲嘧啶
作者：杨红
单位：华西医科大学药学院 成都 610041
关键词：磺胺二甲嘧啶；酶联免疫吸附分析；磺胺类；牛奶；猪血浆；猪尿
ELISA测定牛奶 提要 用兔抗磺胺二甲嘧啶抗血清，建立了测定磺胺二甲嘧啶的ELISA法，测定线性范围为(0.05～5.0) μg/L，最低检出浓度为0.025 μg/L。方法回收率全牛奶与脱脂牛奶分别为(82.1%～128.8)%和(90.6%～124.0)%，猪血浆为(84.9%～103.8)%，猪尿为(89.7%～122.4)%。方法简便快速，重现性好，检出限低。
DETERMINATION OF SULPHADIMIDINE RESIDUES IN
MILK，SWINE PLASMA AND SWINE URINE BY ELISA
, http://www.100md.com
Yang Hong
(School of Pharmacy, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT A competitive enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA) was established with aid of self-made rabbit antibody against sulphadimidine(SM2) for determination of SM2 in milk,swine plasma and swine urine. The dynamic range of determination was 0.05～5.0 μg/L with a detection limit of 0.025 μg/L,much better than the limit obtained by the analogous literature(1～10 μg/L) and well below the European maximum permitted amount of SM2 in milk and pork (25 μg/kg). The recovery values obtained by standard addition to whole milk and skimmed milk were found to be in the range of 82.1%～128.8% and 90.6%～124.0%,respectively,to swine plasma to be 84.9%～103.8%,and to swine urine to be 89.7%～122.4%.No positive samples were found from 270 collected milk samples by the developed ELISA method.
, 百拇医药
Key Words Sulphadimidine Enzyme linked immuno-sorbent assay Sulphonamide Milk Swine plasma Swine urine
磺胺二甲嘧啶(sulphodimides, SM2)是应用广泛的抗菌药，也用作饲料添加剂，以提高奶牛、生猪的抗病能力和提高产奶量和产肉量。SM2在牛奶或猪肉中的残留量超过一定值将有害消费者健康，如可能引起甲状腺癌[1]。欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μg/kg，磺胺类药物总量不得超过100 μg/kg[2]，国内尚无具体规定。测定SM2的常用方法，有HPLC、GC、TLC法，但试样的预处理及测定操作繁琐，费用高，微生物法简便，但灵敏度和特异性低[3]。酶联免疫吸附分析(ELISA)简便、快速，虽有用于牛奶[2，4]、猪血浆和猪尿[5]等试样中测定SM2的报道，但该方法更为灵敏。
, http://www.100md.com
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
酶标测定仪(芬兰，Labsystem)；酶标板自动洗涤仪(奥地利，812 SW1)；96孔酶标板(丹麦，Nunc)。兔抗SM2抗血清自制(稀释度为1∶10 000，与16种磺胺类药物和8种抗菌药物的交叉反应都很小，如结构与SM2仅相差一个甲基的磺胺甲基嘧啶交叉反应率仅为5.2%，见表1。表明所用抗血清特异性强。酶标记物制备用的SM2-羧酸衍生物系捷克Dr.Biosfor馈赠，其余试剂为分析纯或Sigma或Serva产品。
Table 1 Cross-reactivity of rabbit antiserum to Sulph-adimides and antibiotics
Compounds
, 百拇医药
Cross-reactivity
(%)
Compounds
Cross-reactivity
(%)
Sulphadimidine(SM2)
100.0
Sulphafurazole
<0.1
Sulphamerazine
5.2
, http://www.100md.com
Sulphaphenazol
<0.1
Sulphachloropyrazine
1.0
Sulphanilamid
<0.1
Sulplhadiazine
0.7
Sulphaguanidine
<0.1
Sulphadimethoxine
, http://www.100md.com
0.6
Sulphaquinoxaline
0.3
Penicillin G
<0.1
Sulphachlorpyridazine
0.1
Benzylpenicillin
<0.1
Sulphamethoxydiazinium
0.1
, 百拇医药 Ampicillin
<0.1
Sulphamethoxypyridazine
<0.1
Amoxycillin
<0.1
Suphamethoxydin
<0.1
Gentamycin
<0.1
Sulphamethoxazole
<0.1
, 百拇医药
Dihydrostreptomycin
<0.1
Sulphadoxine
<0.1
Oxytetracycline
<0.1
Sulphathioazole
<0.1
Chlorotetracycline
<0.1
1.2 酶标记物的制备
, 百拇医药
用改进的活化酯法将SM2-羧酸衍生物与辣根过氧化物酶共价交联[6]，过Sephadex G-25柱除盐，用0.01 mol/L NaHCO3作洗脱液，收集第一峰，加等体积甘油，-20℃存放。
1.3 对照液的制备
将SM2对照品用甲醇配成100 mg/L，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释成1 000 μg/L的贮备液。将贮备液用PBS制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的对照溶液。
1.4 标准曲线及样品测定方法
1.4.1 采用竞争法 用包被液(pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲溶液)稀释抗血清，每孔200 μl包被酶标板，室温过夜，用PBST(含Tween 20的PBS)洗涤3次后，制备标准曲线时每孔加入100 μl对照液，样品测定时则每孔加入100 μl用PBS稀释至1∶100的牛奶试样，或稀释至1∶400的猪血浆试样，或稀释至1∶1 000的猪尿试样和100 μl用PBS稀释的酶标记物，水平振荡1 min，室温温育1 h。酶标板洗涤3次，加入200 μl显色液(10 g/L 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺100 μl、60 g/L H2O2 10 μl、pH 5.5的2.0 mol/L乙酸-柠檬酸混合缓冲溶液500 μl和重蒸水10 ml混合制得)，水平振荡15 min显色，加2 mol/L H2SO4 100 μl终止显色，于酶标测定仪上读取吸光度A450nm。将标准溶液浓度对吸光度作成标准曲线。
, 百拇医药
1.4.2 牛奶试样测定 采集捷克市售牛奶试样270个，每份约20 ml，盛于封口小塑料瓶中，-20℃存放。1周内用ELISA测定，室温自然解冻，混匀后取50 μl，用PBS稀释至1∶100，每个试样平行测定4孔，得到平均吸光度值后从标准曲线求得SM2浓度。
1.5 回收率实验
采集14个不含SM2的全奶试样，其中7个离心脱脂成脱脂牛奶，另7个仍为全奶；采集不含SM2的8个猪血浆和8个猪尿试样。均加入SM2对照液，制成含SM2浓度分别为10、50、250 μg/L的牛奶试样，含SM2浓度分别为80、200 μg/L的猪血浆试样和含SM2浓度分别为200、1 000 μg/L的猪尿试样。混匀后室温放置1 h，用PBS稀释成1∶100牛奶稀释液，1∶400猪血浆稀释液和1∶1 000猪尿稀释液。按“1.4”中方法测定。各试样中SM2浓度由同一酶标板得到的标准曲线求得，然后计算回收率(表2、3、4)。 Table 2 Recovery and precision of SM2 assay in fortified whole milk and skimmed milk (n=8)
, http://www.100md.com
Concn.added(μg/L)
Sample No.
Whole milk
Skimmed milk
10
50
250
10
50
250
A
B
A
, 百拇医药
B
A
B
A
B
A
B
A
B
1
128.8
12.3
91.2
15.9
, 百拇医药
121.1
13.9
99.5
13.1
110.4
18.0
92.4
11.8
2
102.4
18.2
104.6
16.0
, 百拇医药
107.5
10.6
86.8
12.4
96.4
10.9
98.8
12.6
3
113.6
9.2
107.6
8.8
, 百拇医药
103.1
4.8
114.3
14.1
103.4
15.7
90.6
12.6
4
110.3
13.1
104.2
17.5
, 百拇医药
85.8
11.3
124.0
7.4
108.8
12.3
107.6
10.7
5
106.5
14.2
102.0
7.6
, 百拇医药
82.1
8.6
115.6
8.4
106.7
10.1
113.3
6.9
6
99.4
6.8
87.2
11.4
, 百拇医药
108.2
9.7
122.5
10.7
111.6
18.3
108.5
8.9
7
94.2
13.3
99.6
11.2
, 百拇医药
115.3
11.7
118.7
9.8
109.2
11.3
112.4
10.1
A=recovery(%);B=RSD(%) Table 3 Recovery of SM2 in fortified swine plasma (n=8)
Sample No.
Concentration
, 百拇医药
(μg/L)
Recovery(%)
RSD%
added(μg/L)
measured(μg/L)
1
80
79.51
99.4
11.8
2
80
71.13
, http://www.100md.com
88.9
12.4
3
80
74.24
92.8
12.6
4
80
73.02
91.3
10.7
5
, 百拇医药
80
78.40
98.0
7.0
6
80
81.02
101.3
6.2
7
80
77.51
96.9
, 百拇医药
8.9
8
80
80.40
100.5
10.0
1
200
181.1
90.6
11.3
2
200
, http://www.100md.com
169.8
84.9
12.4
3
200
185.6
92.8
14.1
4
200
192.2
96.1
7.4
, 百拇医药
5
200
204.0
102
8.4
6
200
204.8
102
6.2
7
200
201.0
, 百拇医药
100.6
4.8
8
200
207.6
103.8
9.8
Table 4 Recovery of SM2 in fortified swine urine (n=8)
Sample No.
Concentration
(μg/L)
, 百拇医药
Recovery(%)
RSD%
added(μg/L)
measured(μg/L)
1
200
205.3
102.7
15.3
2
200
192.4
96.2
, 百拇医药
14.4
3
200
200.5
100.3
12.1
4
200
179.4
89.7
15.6
5
200
, 百拇医药
198.0
99.9
10.9
6
200
244.8
122.4
9.2
7
200
212.4
103.2
16.8
, http://www.100md.com
8
200
243.3
121.5
13.1
1
1000
1093
109.3
18.0
2
1000
1001
, 百拇医药
100.1
10.9
3
1000
1027
102.7
15.7
4
1000
953.0
95.3
12.3
5
, 百拇医药
1000
999.0
99.9
10.1
6
1000
1147
114.7
4.8
7
1000
993.0
99.3
, 百拇医药
18.3
8
1000
1137
113.7
13.1
2 结果与讨论
2.1 ELISA实验条件优化和分析特性
用方阵滴定法优选ELISA的实验条件，抗血清用包被液稀释至1∶10 000，酶标板每孔200 μl，室温包被过夜。酶标记物用PBST稀释至1∶200 000，每孔加100 μl。
图1为SM2加入PBS或加入用PBS稀释至1∶100的全奶或脱脂牛奶中分别求得的3条ELISA标准曲线。可见3条曲线靠近，表明全奶或脱脂奶经1∶100稀释后基本上不存在基质效应的影响，全奶与PBS的标准曲线基本重合，故全奶试样中的SM2浓度可以直接从PBS的标准曲线读出。1∶400稀释的猪血浆和1∶1 000稀释的猪尿均类似，SM2浓度也可以直接从PBS的标准曲线读出，基本上不存在基质效应影响。
, 百拇医药
Fig 1 Standard curves of ELISA for SM2 in PBS, whole milk and skimmed milk
免疫分析竞争法的灵敏度可由竞争抑制曲线(未绘出)中50%抑制率所对应的浓度求出[7]，该法灵敏度约为0.2 μg/L。最低检出浓
度可由标准曲线中零浓度点吸光度标准差的3倍求得对应的浓度，由图1可求得最低检出浓度约为0.025 μg/L，远低于欧盟允许浓度(25 μg/L)和其它文献[(1～10) μg/L][2，4，5]，该方法更为灵敏。由于灵敏度高故可通过较高倍数稀释排除试样基质的干扰，又能保证稀释后测定的浓度仍在标准曲线范围内。
2.2 牛奶试样测定结果
测定270个牛奶试样，没有SM2浓度超过25 μg/L的最高允许值者。最高值为20.8 μg/L，最低值为0，均值为4.82 μg/L。采集后立即测定同冷冻1月测定，结果无显著性差异(P>0.5)。
, 百拇医药
猪血浆、猪尿试样的测定结果及其与猪肉中SM2含量相关性研究将另文发表。
致谢 承捷克Veterinary Research Institute的Dr.Franek M.提供设备和技术指导。
参考文献
1 Haynes RC,Marsa F. Thyroid and antithyroid drugs. 7th ed, MacMillan, New York, 1985,1389
2 Hoffmeister BA, Suhem G, Heeschen W. Enzyme imnmunoassay for screening sulfadimidine and sulfanilamide residues in milk. Milchwissdenchaft,1991,46(11)∶712
, 百拇医药
3 Horwitz W. Analytical methods for sulfonamides in fodds and feeds. J Assoc off Anal Chem,1981,64(1)∶104
4 Ostermaier S, Schenider E, Usleber E, et al. Rapid enzyme immnoassay for the detection of three sulphonamides in milk. Food & Agric Immunol,1995,7∶253
5 Ram BP, Singh P, Mnartins, et al. High-volume enzyme immunoassay test system for sulfamethazine in swine. J Assoc Off Anal Chem,1991,74∶43
6 Schneider P, Hammock BD. Influence of ELISA format and the hapten enzyme conjugate on the sensitivity of an immunoassay for the s-trizine herbicides using monodonal aitibodies. J Agric Food Chem,1992,40∶525
7 邓安平，Franek M.酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津.分析化学，1998，26(1)∶29, http://www.100md.com
单位：华西医科大学药学院 成都 610041
关键词：磺胺二甲嘧啶；酶联免疫吸附分析；磺胺类；牛奶；猪血浆；猪尿
ELISA测定牛奶 提要 用兔抗磺胺二甲嘧啶抗血清，建立了测定磺胺二甲嘧啶的ELISA法，测定线性范围为(0.05～5.0) μg/L，最低检出浓度为0.025 μg/L。方法回收率全牛奶与脱脂牛奶分别为(82.1%～128.8)%和(90.6%～124.0)%，猪血浆为(84.9%～103.8)%，猪尿为(89.7%～122.4)%。方法简便快速，重现性好，检出限低。
DETERMINATION OF SULPHADIMIDINE RESIDUES IN
MILK，SWINE PLASMA AND SWINE URINE BY ELISA
, http://www.100md.com
Yang Hong
(School of Pharmacy, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT A competitive enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA) was established with aid of self-made rabbit antibody against sulphadimidine(SM2) for determination of SM2 in milk,swine plasma and swine urine. The dynamic range of determination was 0.05～5.0 μg/L with a detection limit of 0.025 μg/L,much better than the limit obtained by the analogous literature(1～10 μg/L) and well below the European maximum permitted amount of SM2 in milk and pork (25 μg/kg). The recovery values obtained by standard addition to whole milk and skimmed milk were found to be in the range of 82.1%～128.8% and 90.6%～124.0%,respectively,to swine plasma to be 84.9%～103.8%,and to swine urine to be 89.7%～122.4%.No positive samples were found from 270 collected milk samples by the developed ELISA method.
, 百拇医药
Key Words Sulphadimidine Enzyme linked immuno-sorbent assay Sulphonamide Milk Swine plasma Swine urine
磺胺二甲嘧啶(sulphodimides, SM2)是应用广泛的抗菌药，也用作饲料添加剂，以提高奶牛、生猪的抗病能力和提高产奶量和产肉量。SM2在牛奶或猪肉中的残留量超过一定值将有害消费者健康，如可能引起甲状腺癌[1]。欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μg/kg，磺胺类药物总量不得超过100 μg/kg[2]，国内尚无具体规定。测定SM2的常用方法，有HPLC、GC、TLC法，但试样的预处理及测定操作繁琐，费用高，微生物法简便，但灵敏度和特异性低[3]。酶联免疫吸附分析(ELISA)简便、快速，虽有用于牛奶[2，4]、猪血浆和猪尿[5]等试样中测定SM2的报道，但该方法更为灵敏。
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1 实验部分
1.1 仪器与试剂
酶标测定仪(芬兰，Labsystem)；酶标板自动洗涤仪(奥地利，812 SW1)；96孔酶标板(丹麦，Nunc)。兔抗SM2抗血清自制(稀释度为1∶10 000，与16种磺胺类药物和8种抗菌药物的交叉反应都很小，如结构与SM2仅相差一个甲基的磺胺甲基嘧啶交叉反应率仅为5.2%，见表1。表明所用抗血清特异性强。酶标记物制备用的SM2-羧酸衍生物系捷克Dr.Biosfor馈赠，其余试剂为分析纯或Sigma或Serva产品。
Table 1 Cross-reactivity of rabbit antiserum to Sulph-adimides and antibiotics
Compounds
, 百拇医药
Cross-reactivity
(%)
Compounds
Cross-reactivity
(%)
Sulphadimidine(SM2)
100.0
Sulphafurazole
<0.1
Sulphamerazine
5.2
, http://www.100md.com
Sulphaphenazol
<0.1
Sulphachloropyrazine
1.0
Sulphanilamid
<0.1
Sulplhadiazine
0.7
Sulphaguanidine
<0.1
Sulphadimethoxine
, http://www.100md.com
0.6
Sulphaquinoxaline
0.3
Penicillin G
<0.1
Sulphachlorpyridazine
0.1
Benzylpenicillin
<0.1
Sulphamethoxydiazinium
0.1
, 百拇医药 Ampicillin
<0.1
Sulphamethoxypyridazine
<0.1
Amoxycillin
<0.1
Suphamethoxydin
<0.1
Gentamycin
<0.1
Sulphamethoxazole
<0.1
, 百拇医药
Dihydrostreptomycin
<0.1
Sulphadoxine
<0.1
Oxytetracycline
<0.1
Sulphathioazole
<0.1
Chlorotetracycline
<0.1
1.2 酶标记物的制备
, 百拇医药
用改进的活化酯法将SM2-羧酸衍生物与辣根过氧化物酶共价交联[6]，过Sephadex G-25柱除盐，用0.01 mol/L NaHCO3作洗脱液，收集第一峰，加等体积甘油，-20℃存放。
1.3 对照液的制备
将SM2对照品用甲醇配成100 mg/L，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释成1 000 μg/L的贮备液。将贮备液用PBS制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的对照溶液。
1.4 标准曲线及样品测定方法
1.4.1 采用竞争法 用包被液(pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲溶液)稀释抗血清，每孔200 μl包被酶标板，室温过夜，用PBST(含Tween 20的PBS)洗涤3次后，制备标准曲线时每孔加入100 μl对照液，样品测定时则每孔加入100 μl用PBS稀释至1∶100的牛奶试样，或稀释至1∶400的猪血浆试样，或稀释至1∶1 000的猪尿试样和100 μl用PBS稀释的酶标记物，水平振荡1 min，室温温育1 h。酶标板洗涤3次，加入200 μl显色液(10 g/L 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺100 μl、60 g/L H2O2 10 μl、pH 5.5的2.0 mol/L乙酸-柠檬酸混合缓冲溶液500 μl和重蒸水10 ml混合制得)，水平振荡15 min显色，加2 mol/L H2SO4 100 μl终止显色，于酶标测定仪上读取吸光度A450nm。将标准溶液浓度对吸光度作成标准曲线。
, 百拇医药
1.4.2 牛奶试样测定 采集捷克市售牛奶试样270个，每份约20 ml，盛于封口小塑料瓶中，-20℃存放。1周内用ELISA测定，室温自然解冻，混匀后取50 μl，用PBS稀释至1∶100，每个试样平行测定4孔，得到平均吸光度值后从标准曲线求得SM2浓度。
1.5 回收率实验
采集14个不含SM2的全奶试样，其中7个离心脱脂成脱脂牛奶，另7个仍为全奶；采集不含SM2的8个猪血浆和8个猪尿试样。均加入SM2对照液，制成含SM2浓度分别为10、50、250 μg/L的牛奶试样，含SM2浓度分别为80、200 μg/L的猪血浆试样和含SM2浓度分别为200、1 000 μg/L的猪尿试样。混匀后室温放置1 h，用PBS稀释成1∶100牛奶稀释液，1∶400猪血浆稀释液和1∶1 000猪尿稀释液。按“1.4”中方法测定。各试样中SM2浓度由同一酶标板得到的标准曲线求得，然后计算回收率(表2、3、4)。 Table 2 Recovery and precision of SM2 assay in fortified whole milk and skimmed milk (n=8)
, http://www.100md.com
Concn.added(μg/L)
Sample No.
Whole milk
Skimmed milk
10
50
250
10
50
250
A
B
A
, 百拇医药
B
A
B
A
B
A
B
A
B
1
128.8
12.3
91.2
15.9
, 百拇医药
121.1
13.9
99.5
13.1
110.4
18.0
92.4
11.8
2
102.4
18.2
104.6
16.0
, 百拇医药
107.5
10.6
86.8
12.4
96.4
10.9
98.8
12.6
3
113.6
9.2
107.6
8.8
, 百拇医药
103.1
4.8
114.3
14.1
103.4
15.7
90.6
12.6
4
110.3
13.1
104.2
17.5
, 百拇医药
85.8
11.3
124.0
7.4
108.8
12.3
107.6
10.7
5
106.5
14.2
102.0
7.6
, 百拇医药
82.1
8.6
115.6
8.4
106.7
10.1
113.3
6.9
6
99.4
6.8
87.2
11.4
, 百拇医药
108.2
9.7
122.5
10.7
111.6
18.3
108.5
8.9
7
94.2
13.3
99.6
11.2
, 百拇医药
115.3
11.7
118.7
9.8
109.2
11.3
112.4
10.1
A=recovery(%);B=RSD(%) Table 3 Recovery of SM2 in fortified swine plasma (n=8)
Sample No.
Concentration
, 百拇医药
(μg/L)
Recovery(%)
RSD%
added(μg/L)
measured(μg/L)
1
80
79.51
99.4
11.8
2
80
71.13
, http://www.100md.com
88.9
12.4
3
80
74.24
92.8
12.6
4
80
73.02
91.3
10.7
5
, 百拇医药
80
78.40
98.0
7.0
6
80
81.02
101.3
6.2
7
80
77.51
96.9
, 百拇医药
8.9
8
80
80.40
100.5
10.0
1
200
181.1
90.6
11.3
2
200
, http://www.100md.com
169.8
84.9
12.4
3
200
185.6
92.8
14.1
4
200
192.2
96.1
7.4
, 百拇医药
5
200
204.0
102
8.4
6
200
204.8
102
6.2
7
200
201.0
, 百拇医药
100.6
4.8
8
200
207.6
103.8
9.8
Table 4 Recovery of SM2 in fortified swine urine (n=8)
Sample No.
Concentration
(μg/L)
, 百拇医药
Recovery(%)
RSD%
added(μg/L)
measured(μg/L)
1
200
205.3
102.7
15.3
2
200
192.4
96.2
, 百拇医药
14.4
3
200
200.5
100.3
12.1
4
200
179.4
89.7
15.6
5
200
, 百拇医药
198.0
99.9
10.9
6
200
244.8
122.4
9.2
7
200
212.4
103.2
16.8
, http://www.100md.com
8
200
243.3
121.5
13.1
1
1000
1093
109.3
18.0
2
1000
1001
, 百拇医药
100.1
10.9
3
1000
1027
102.7
15.7
4
1000
953.0
95.3
12.3
5
, 百拇医药
1000
999.0
99.9
10.1
6
1000
1147
114.7
4.8
7
1000
993.0
99.3
, 百拇医药
18.3
8
1000
1137
113.7
13.1
2 结果与讨论
2.1 ELISA实验条件优化和分析特性
用方阵滴定法优选ELISA的实验条件，抗血清用包被液稀释至1∶10 000，酶标板每孔200 μl，室温包被过夜。酶标记物用PBST稀释至1∶200 000，每孔加100 μl。
图1为SM2加入PBS或加入用PBS稀释至1∶100的全奶或脱脂牛奶中分别求得的3条ELISA标准曲线。可见3条曲线靠近，表明全奶或脱脂奶经1∶100稀释后基本上不存在基质效应的影响，全奶与PBS的标准曲线基本重合，故全奶试样中的SM2浓度可以直接从PBS的标准曲线读出。1∶400稀释的猪血浆和1∶1 000稀释的猪尿均类似，SM2浓度也可以直接从PBS的标准曲线读出，基本上不存在基质效应影响。
, 百拇医药
Fig 1 Standard curves of ELISA for SM2 in PBS, whole milk and skimmed milk
免疫分析竞争法的灵敏度可由竞争抑制曲线(未绘出)中50%抑制率所对应的浓度求出[7]，该法灵敏度约为0.2 μg/L。最低检出浓
度可由标准曲线中零浓度点吸光度标准差的3倍求得对应的浓度，由图1可求得最低检出浓度约为0.025 μg/L，远低于欧盟允许浓度(25 μg/L)和其它文献[(1～10) μg/L][2，4，5]，该方法更为灵敏。由于灵敏度高故可通过较高倍数稀释排除试样基质的干扰，又能保证稀释后测定的浓度仍在标准曲线范围内。
2.2 牛奶试样测定结果
测定270个牛奶试样，没有SM2浓度超过25 μg/L的最高允许值者。最高值为20.8 μg/L，最低值为0，均值为4.82 μg/L。采集后立即测定同冷冻1月测定，结果无显著性差异(P>0.5)。
, 百拇医药
猪血浆、猪尿试样的测定结果及其与猪肉中SM2含量相关性研究将另文发表。
致谢 承捷克Veterinary Research Institute的Dr.Franek M.提供设备和技术指导。
参考文献
1 Haynes RC,Marsa F. Thyroid and antithyroid drugs. 7th ed, MacMillan, New York, 1985,1389
2 Hoffmeister BA, Suhem G, Heeschen W. Enzyme imnmunoassay for screening sulfadimidine and sulfanilamide residues in milk. Milchwissdenchaft,1991,46(11)∶712
, 百拇医药
3 Horwitz W. Analytical methods for sulfonamides in fodds and feeds. J Assoc off Anal Chem,1981,64(1)∶104
4 Ostermaier S, Schenider E, Usleber E, et al. Rapid enzyme immnoassay for the detection of three sulphonamides in milk. Food & Agric Immunol,1995,7∶253
5 Ram BP, Singh P, Mnartins, et al. High-volume enzyme immunoassay test system for sulfamethazine in swine. J Assoc Off Anal Chem,1991,74∶43
6 Schneider P, Hammock BD. Influence of ELISA format and the hapten enzyme conjugate on the sensitivity of an immunoassay for the s-trizine herbicides using monodonal aitibodies. J Agric Food Chem,1992,40∶525
7 邓安平，Franek M.酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津.分析化学，1998，26(1)∶29, http://www.100md.com