HPLC法测定清经胶囊中小檗碱的含量
作者：喻 萍 胡 平* 赫 强**
单位：四川恩威中医药研究所 成都 610041
关键词：HPLC；清经胶囊；小檗碱
HPLC法测定清经胶囊中小檗碱的含量 提要 用HPLC方法对中药复方制剂清经胶囊中小檗碱进行含量测定，并进行了方法的广泛适应性试验，结果表明小檗碱在0.115～0.575 μg范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，方法回收率为98%。精密度与准确度均较满意。该法可有效地控制其内在质量。
DETERMINATION OF BERBERINE IN QINGJING
CAPSULES BY HPLC
Yu Ping Hu Ping He Qiang
, 百拇医药
(Sichuan Enwei Traditional Chinese Medicine Institute Chengdu 610041)
ABSTRACT This paper described the content determination on berberine within Qingjing capsules of traditional medicine compounds by HPLC method, which also carried out a adaptability test in a wide-ranging.The results showed that within 0.115～0.575 μg, berberine kept a fine line relationship between concentration and peak area. The average recovery rate in sample was about 98%. The precision and accuration were both satisfactory, and the method can control quality effectively.
, 百拇医药
Key Words HPLC Qingjing capsules Berberine
清经胶囊是由牡丹皮、黄柏等数味中药材研制而成的中药复方制剂。具有清热凉血、滋肾养阴、调经止痛等功效。为制定本品质量控制标准，对其中小檗碱的含量测定方法进行了研究。该法回收率高、分离度好、方法简便、适应性好，适于清经胶囊生产的质量控制。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
惠普HP1100高效液相色谱仪，G1315A二极管阵列检测器(DAD)，G1316柱温箱(Quatpump),G1322A在线真空脱气机(Degasser),G2170AA HP化学工作站(HP Chemstation);Waters高效液相色谱仪，486检测器，515 HPLC pump，temperature control module, PC800图谱及数据处理系统；波达1004超声清洗器；TGL-16G台式高速离心机。盐酸小檗碱(berberine)对照品(中国药品生物制品检定所)；供试品(自制)；乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯；流动相用水为高纯水(西南物理研究所)。
, 百拇医药
1.2 方法结果
1.2.1 色谱条件 ODS色谱柱，流动相用乙腈-水-磷酸二氢钾-十二烷基硫酸钠(500 ml∶500 ml∶3.4 g∶1.7 g)，检测波长346 nm。
1.2.2 方法可行性考察 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇溶解配制成0.02 mg/ml的对照品溶液，取空白样品(缺黄柏)和供试品分别制备成空白对照溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下测得三种溶液的HPLC图谱(图1)。由图谱可见，小檗碱最大吸收为346 nm，且小檗碱与巴马汀色谱峰能达到基线分离，空白样品在此波长无吸收。故选择346 nm作为清经胶囊中小檗碱含量的检测波长。
Fig 1 High performance liquid chromatogram of berberine
, http://www.100md.com
A Palmatine B Blank C Berberine D Sample
a peak of berberine b peak of palmatine
1.2.3 标准曲线的绘制 分别吸取对照溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μl注入色谱仪。以峰面积积分值对进样浓度进行回归，得回归方程C=0.0001944A+0.003827，r=0.9998(式中C为盐酸小檗碱的量μg，A为峰面积积分值)。可见，进样量在0.115～0.575 μg范围内线性关系良好，标准曲线基本过原点。故在实际含量测定中，可采取随行标准法(中国药典1995年版一部附录VID)计算供试品小檗碱的含量。
1.2.4 供试品提取条件的考察 取装量差异测定项下颗粒，研细，取细粉约0.1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加入提取液20 ml，超声提取30 min；取出放冷后用提取液稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液适量高速离心(12 000 r/min)5 min；取其上清液10 μl，注入色谱仪，按标准比较法计算其含量(表1)。
, http://www.100md.com
Table 1 Results for determination by different extracting solvents(n=3)
Solvent
Berberine content(mg/g)
MeOH
4.21
4.29
4.17
MeOH-HCl(100∶1)
7.28
7.41
, 百拇医药 7.39
Mobile phase
6.40
6.40
6.52
根据上述试验结果，选用酸性甲醇[甲醇-盐酸(100∶1)]作为溶剂制备供试品液，超声提取不同时间后依上法测定，结果见表2。 Table 2 Results for determination by different extracting time (n=3)
Time (min)
Berberine content(mg/g)
5
, 百拇医药
7.35
7.10
7.17
15
7.15
7.28
7.16
30
7.25
7.17
7.20
45
7.10
, http://www.100md.com
7.17
7.17
试验表明：超声提取5～45 min含量测定结果无明显差异。为确保小檗碱提取完全并缩短分析时间，供试品中其含量测定的提取条件以酸性甲醇作溶剂，超声提取15 min为佳。
1.2.5 进样精密度及方法精密度试验 以同一对照品溶液，重复进样5次，每次10 μl，测得小檗碱对照品峰面积，其RSD为0.79%。按“1.2.4”方法测定同一批供试品的含量，RSD为0.97%，试验结果表明精密度良好。
1.2.6 空白和供试品回收试验 分别称取5份空白样品约0.1 g，各加入盐酸小檗碱对照品适量，按“1.2.4”方法测定，结果见表3。 Table 3 Recovery of blank
No.
, 百拇医药
Weight(g)
Amount
Recovery
(%)
Average
recovery
(%)
RSD
(%)
content
(mg)
added
(mg)
, 百拇医药
measured
(mg)
1
0.0851
0
0.7350
0.7339
100
2
0.0971
0
0.7350
0.7197
, 百拇医药
98
3
0.1100
0
0.7350
0.7195
98
99
0.91
4
0.0928
0
0.7350
, http://www.100md.com
0.7299
99
5
0.1274
0
0.7350
0.7215
98
取供试品约0.1 g，加入盐酸小檗碱对照品适量，按“1.2.4”方法测定，结果见表4。 Table 4 Recovery of samples
No.
Weight
, http://www.100md.com
(g)
Amount
Recovery
(%)
RSD
(%)
content
(mg)
added
(mg)
, http://www.100md.com measured
(mg)
1
0.0931
0.6908
0.8000
1.4934
100
2
0.1015
0.7531
0.8000
1.5380
, http://www.100md.com
98
98
2.0
3
0.0975
0.7234
0.8000
1.4877
96
4
0.0900
0.6678
0.3200
, http://www.100md.com
0.9805
98
5
0.0923
0.6849
0.3200
0.9953
97
98
1.0
6
0.1102
0.8177
, http://www.100md.com
0.3200
1.1358
99
1.2.7 供试品的测定 取3批供试品，依“1.2.4”方法测定，结果见表5。 Table 5 The content of different samples
Batch
No.
Amounts
(mg/g)
Average
(mg/g)
RSD(%)
, 百拇医药
980101
3.22
3.17
3.24
3.21
1.12
980102
3.40
3.43
3.48
3.44
1.81
980103
, 百拇医药
3.40
3.44
3.42
3.42
1.18
1.3 方法适应性试验
1.3.1 色谱仪考察 两台不同高效液相色谱仪(HP1100型和Waster515型，其它色谱条件不变)按拟定方法测定同一供试品溶液中小檗碱的含量(n=6)，试验结果表明仪器与仪器之间无显著性差异。
1.3.2 色谱柱考察 其它色谱条件不变，对不同的ODS色谱柱按“1.2.4”方法进行色谱分析，均得到供试品主要成分基线分离的对称色谱峰形，保留时间9～18 min(依色谱柱不同而异)，空白对照品(缺黄柏)无干扰，小檗碱色谱峰与巴马汀能够达到基线分离。试验结果表明，该方法广泛适应性良好。
, 百拇医药
2 讨论
2.1 曾以乙腈-0.1 mol/L醋酸铵(35∶65，磷酸调pH6.0)；醋酸乙酯-乙醇-甲醇(75∶20∶5)作流动相，结果均不理想。盐酸小檗碱色谱峰与杂质峰不能达到很好的基线分离。
2.2 不同日期制备的小檗碱对照溶液，以最新配制的对照溶液为对照，在同一色谱条件下测定盐酸小檗碱的含量，结果表明该对照溶液在冰箱中保存一个月左右其浓度基本无变化。
*成都铁路中心医院 610083
**成都高新医药研究所 610041
参考文献
1 日本药局方.JPⅩⅡ.1991
2 王宝 .中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994.28, http://www.100md.com(喻 萍 胡 平* 赫 强**)
单位：四川恩威中医药研究所 成都 610041
关键词：HPLC；清经胶囊；小檗碱
HPLC法测定清经胶囊中小檗碱的含量 提要 用HPLC方法对中药复方制剂清经胶囊中小檗碱进行含量测定，并进行了方法的广泛适应性试验，结果表明小檗碱在0.115～0.575 μg范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，方法回收率为98%。精密度与准确度均较满意。该法可有效地控制其内在质量。
DETERMINATION OF BERBERINE IN QINGJING
CAPSULES BY HPLC
Yu Ping Hu Ping He Qiang
, 百拇医药
(Sichuan Enwei Traditional Chinese Medicine Institute Chengdu 610041)
ABSTRACT This paper described the content determination on berberine within Qingjing capsules of traditional medicine compounds by HPLC method, which also carried out a adaptability test in a wide-ranging.The results showed that within 0.115～0.575 μg, berberine kept a fine line relationship between concentration and peak area. The average recovery rate in sample was about 98%. The precision and accuration were both satisfactory, and the method can control quality effectively.
, 百拇医药
Key Words HPLC Qingjing capsules Berberine
清经胶囊是由牡丹皮、黄柏等数味中药材研制而成的中药复方制剂。具有清热凉血、滋肾养阴、调经止痛等功效。为制定本品质量控制标准，对其中小檗碱的含量测定方法进行了研究。该法回收率高、分离度好、方法简便、适应性好，适于清经胶囊生产的质量控制。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
惠普HP1100高效液相色谱仪，G1315A二极管阵列检测器(DAD)，G1316柱温箱(Quatpump),G1322A在线真空脱气机(Degasser),G2170AA HP化学工作站(HP Chemstation);Waters高效液相色谱仪，486检测器，515 HPLC pump，temperature control module, PC800图谱及数据处理系统；波达1004超声清洗器；TGL-16G台式高速离心机。盐酸小檗碱(berberine)对照品(中国药品生物制品检定所)；供试品(自制)；乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯；流动相用水为高纯水(西南物理研究所)。
, 百拇医药
1.2 方法结果
1.2.1 色谱条件 ODS色谱柱，流动相用乙腈-水-磷酸二氢钾-十二烷基硫酸钠(500 ml∶500 ml∶3.4 g∶1.7 g)，检测波长346 nm。
1.2.2 方法可行性考察 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇溶解配制成0.02 mg/ml的对照品溶液，取空白样品(缺黄柏)和供试品分别制备成空白对照溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下测得三种溶液的HPLC图谱(图1)。由图谱可见，小檗碱最大吸收为346 nm，且小檗碱与巴马汀色谱峰能达到基线分离，空白样品在此波长无吸收。故选择346 nm作为清经胶囊中小檗碱含量的检测波长。
Fig 1 High performance liquid chromatogram of berberine
, http://www.100md.com
A Palmatine B Blank C Berberine D Sample
a peak of berberine b peak of palmatine
1.2.3 标准曲线的绘制 分别吸取对照溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μl注入色谱仪。以峰面积积分值对进样浓度进行回归，得回归方程C=0.0001944A+0.003827，r=0.9998(式中C为盐酸小檗碱的量μg，A为峰面积积分值)。可见，进样量在0.115～0.575 μg范围内线性关系良好，标准曲线基本过原点。故在实际含量测定中，可采取随行标准法(中国药典1995年版一部附录VID)计算供试品小檗碱的含量。
1.2.4 供试品提取条件的考察 取装量差异测定项下颗粒，研细，取细粉约0.1 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加入提取液20 ml，超声提取30 min；取出放冷后用提取液稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液适量高速离心(12 000 r/min)5 min；取其上清液10 μl，注入色谱仪，按标准比较法计算其含量(表1)。
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Table 1 Results for determination by different extracting solvents(n=3)
Solvent
Berberine content(mg/g)
MeOH
4.21
4.29
4.17
MeOH-HCl(100∶1)
7.28
7.41
, 百拇医药 7.39
Mobile phase
6.40
6.40
6.52
根据上述试验结果，选用酸性甲醇[甲醇-盐酸(100∶1)]作为溶剂制备供试品液，超声提取不同时间后依上法测定，结果见表2。 Table 2 Results for determination by different extracting time (n=3)
Time (min)
Berberine content(mg/g)
5
, 百拇医药
7.35
7.10
7.17
15
7.15
7.28
7.16
30
7.25
7.17
7.20
45
7.10
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7.17
7.17
试验表明：超声提取5～45 min含量测定结果无明显差异。为确保小檗碱提取完全并缩短分析时间，供试品中其含量测定的提取条件以酸性甲醇作溶剂，超声提取15 min为佳。
1.2.5 进样精密度及方法精密度试验 以同一对照品溶液，重复进样5次，每次10 μl，测得小檗碱对照品峰面积，其RSD为0.79%。按“1.2.4”方法测定同一批供试品的含量，RSD为0.97%，试验结果表明精密度良好。
1.2.6 空白和供试品回收试验 分别称取5份空白样品约0.1 g，各加入盐酸小檗碱对照品适量，按“1.2.4”方法测定，结果见表3。 Table 3 Recovery of blank
No.
, 百拇医药
Weight(g)
Amount
Recovery
(%)
Average
recovery
(%)
RSD
(%)
content
(mg)
added
(mg)
, 百拇医药
measured
(mg)
1
0.0851
0
0.7350
0.7339
100
2
0.0971
0
0.7350
0.7197
, 百拇医药
98
3
0.1100
0
0.7350
0.7195
98
99
0.91
4
0.0928
0
0.7350
, http://www.100md.com
0.7299
99
5
0.1274
0
0.7350
0.7215
98
取供试品约0.1 g，加入盐酸小檗碱对照品适量，按“1.2.4”方法测定，结果见表4。 Table 4 Recovery of samples
No.
Weight
, http://www.100md.com
(g)
Amount
Recovery
(%)
RSD
(%)
content
(mg)
added
(mg)
, http://www.100md.com measured
(mg)
1
0.0931
0.6908
0.8000
1.4934
100
2
0.1015
0.7531
0.8000
1.5380
, http://www.100md.com
98
98
2.0
3
0.0975
0.7234
0.8000
1.4877
96
4
0.0900
0.6678
0.3200
, http://www.100md.com
0.9805
98
5
0.0923
0.6849
0.3200
0.9953
97
98
1.0
6
0.1102
0.8177
, http://www.100md.com
0.3200
1.1358
99
1.2.7 供试品的测定 取3批供试品，依“1.2.4”方法测定，结果见表5。 Table 5 The content of different samples
Batch
No.
Amounts
(mg/g)
Average
(mg/g)
RSD(%)
, 百拇医药
980101
3.22
3.17
3.24
3.21
1.12
980102
3.40
3.43
3.48
3.44
1.81
980103
, 百拇医药
3.40
3.44
3.42
3.42
1.18
1.3 方法适应性试验
1.3.1 色谱仪考察 两台不同高效液相色谱仪(HP1100型和Waster515型，其它色谱条件不变)按拟定方法测定同一供试品溶液中小檗碱的含量(n=6)，试验结果表明仪器与仪器之间无显著性差异。
1.3.2 色谱柱考察 其它色谱条件不变，对不同的ODS色谱柱按“1.2.4”方法进行色谱分析，均得到供试品主要成分基线分离的对称色谱峰形，保留时间9～18 min(依色谱柱不同而异)，空白对照品(缺黄柏)无干扰，小檗碱色谱峰与巴马汀能够达到基线分离。试验结果表明，该方法广泛适应性良好。
, 百拇医药
2 讨论
2.1 曾以乙腈-0.1 mol/L醋酸铵(35∶65，磷酸调pH6.0)；醋酸乙酯-乙醇-甲醇(75∶20∶5)作流动相，结果均不理想。盐酸小檗碱色谱峰与杂质峰不能达到很好的基线分离。
2.2 不同日期制备的小檗碱对照溶液，以最新配制的对照溶液为对照，在同一色谱条件下测定盐酸小檗碱的含量，结果表明该对照溶液在冰箱中保存一个月左右其浓度基本无变化。
*成都铁路中心医院 610083
**成都高新医药研究所 610041
参考文献
1 日本药局方.JPⅩⅡ.1991
2 王宝 .中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994.28, http://www.100md.com(喻 萍 胡 平* 赫 强**)