MEA治疗难治性白血病及其核基质的变化研究*
作者：李 娟 罗绍凯 彭爱华 原耀光
单位：中山医科大学附属第一医院血液科 广州 510080
关键词：白血病；化学治疗；核基质蛋白
华西药学杂志990520 提要 探索了用米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病及其前后细胞核基质蛋白的变化。结果三药联用的有效率为66.7%，明显高于对照组。说明米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗对治疗难治性急性淋巴细胞白血病有效，核基质是某些抗癌药物的作用点，分子量为180KD的核基质蛋白缺失可能与细胞耐药性有关。
TREATMENT FOR REFRACTORY ACUTE LYMPHOCYTE
LEUKEMIA WITH MITOXANTRONE，VP-16，Ara-C AND CHANGES
, http://www.100md.com
OF THE NUCLEAR MATRIX PROTEIN
Li Juan Luo Shaokai Peng Aihua Yuan Yaoguang
(The first Affiliated Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences Guangzhou 510080)
ABSTRACT We treated eighteen patients with refractory acute lymphocyte leukemia with mitoxantrone, VP-16, Ara-C (MEA) and extracted and analysed the nuclear matrix proteins by high salt and SDS-PAGE before and after chemotherapty. The efficient rate was higher than the control.It was 66.7% in MEA group. Some nuclear matrix proteins in the patients responding to the protocol decreased or disappeared. But there were few changes in those of nonresponding to the protocol. The protein of 180kD had disappeared in the latter before chemotherapy. The results showed that MEA is an efficient protocol for the treatment of refractory acute lymphocyte leukemia, especially for relapsing acute lymphocyte leukemia. Nuclear matrix is the acting site of some anticancer drugs. the disappearance of the protein of 180kD may relate to cells resistance.
, 百拇医药
Key Words Leukemia Chemotherapy Nuclear matrix protein
有关难治性急性淋巴细胞白血病的治疗方法已有报道，但疗效有差异。我院采用米托蒽酯、VP-16、阿糖胞苷(简称MEA方案)联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病18例，取得较好疗效。核基质是许多抗癌药物的作用点[1]，并与某些药物的耐药性有关[2]。化疗中比较了用MEA联合化疗方案前后取得的完全缓解和未缓解的难治性白血病患者白血病细胞核基质蛋白的变化，通过核基质蛋白的变化探讨其化疗药物作用位点及白血病细胞的耐药机制。
1 资料和治疗方法
1.1 临床资料 18例难治性急性淋巴细胞白血病患者均系我院1997年3月～1999年3月的住院者，按FAB分类均为急性淋巴细胞白血病，其中L16例，L211例，L31例，全部病例符合1998年全国血液病诊断标准。患者中男性11例，女性7例，年龄14岁～42岁，病程3.5月～48月。18例中14例为复发、4例为原发耐药的患者，在应用MEA方案前均采用过VDCP方案(V：长春新碱，D：柔红霉素，C：左旋门冬酰胺酶，P：强的松)二次以上。以1996年以来本院采用VM26、阿糖胞苷(简称EMA方案)方案化疗的12例难治性淋巴细胞白血病患者作历史对照。
, 百拇医药
1.2 方法 MEA联合疗法以第1～5天静脉滴注米托蒽醌10 mg/(m2.d)，VP-16 100 mg/(m2.d)，阿糖胞苷200 mg/(m2.d)。EMA疗法以第1～5天静脉滴注VM26 100 mg/(m2.d)，阿糖胞苷2 00 mg/(m2.d)，两法均每12小时重复一次。所有患者化疗前应用康泉以预防呕吐反应，化疗出现严重骨髓抑制时使用粒细胞刺激因子，每28天为一周期，30例患者接受1～2个周期MEA或EMA方案化疗。
1.3 疗效判断 30例患者化疗前后均进行全身体检，腹部B超、骨髓穿刺涂片和血象检查，将疗效分为三个标准。完全缓解(CR)：临床上无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润的表现，血红蛋白>100 g/L，白细胞总数<10×109/L，分类无幼稚细胞，血小板100×109/L，骨髓象正常；部分缓解(PR)：临床表现、血象、骨髓象三系中有一或二项未达完全缓解的标准；未缓解(NR)：临床表现、血象骨髓象三系中均未达完全缓解的标准及无效者。
, 百拇医药
1.4 细胞核基质蛋白的提取 分别取其中对MEA方案有效和无效的难治性淋巴细胞白血病患者的骨髓9例和6例，化疗前后各取骨髓20 ml，用淋巴细胞分离液分离出白血病细胞，参照Fey等[3]的方法提取核基质蛋白。细胞骨架(CSK)缓冲液(100 mmol/L Sucrose,0.5% Tritionx-100)15 min 4℃，离心后沉淀置含有100 μg/ml DNase Ⅰ和RNase A的消化液中，室温下作用20 min，加入终浓度为0.25 mol/L的冷硫酸铵，离心，沉淀溶于disassembly缓冲液(8 mol/L Urea,20 mmol/L Mes pH6.6,1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L PMSF,0.1 mmol/L MgCl, 1%2-ME)中，于4℃ 1∶1 000体积的透析液(0.15 mmol/L KCl,25 mmol/L Imida-zole pH7.1，5 mmol/L MgCl,2 mmol/L DTT,0.125 mmol/L EGTA,0.2 mmol/L PMSF)中透析16 h，超速离心，上清液用2.5倍的纯酒精使核基质蛋白沉淀，氮气吹干，溶解于尿素缓冲液中，-70℃保存。
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1.5 SDS-PAGE电泳 每个样品用10 μg进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为12%，分离胶浓度为4%，胶用银染色。
1.6 统计学方法 CR+PR为有效率，二个率的比较用χ2检验。
2 结果
2.1 临床疗效 MEA方案与EMA方案近期疗效的比较见表1，两率比较有显著性差异(P<0.05)。
表1 MEA方案与EMA方案疗效的比较 治疗方案
例数
CR
PR
, 百拇医药 NR
总有效率(%)
MEA
18
9
3
6
66.7
EMA
12
4
1
7
, http://www.100md.com 41.7
MEA方案对原发耐药和复发的急性淋巴细胞白血病患者的疗效比较为14例复发的患者CR 8例，PR 2例，有效率71.4%，4例原发耐药患者CR 1例，PR 1例，有效率50.0%，两率比较P<0.001。
2.2 MEA方案的毒副反应 MEA方案的毒性反应是骨髓抑制，18例患者均出现严重的骨髓抑制，时间在化疗停止后的第3～27天，高峰时间在第7～10天，其中外周血白细胞从化疗前4.5×109/L～11.7×109/L下降到0.1×109/L～0.7×109/L，血小板从化疗前10.5×109/L～31.3×109/L下降到2.1×109/L～7×109/L，红细胞从化疗前2.3×1012/L～3.3×1012/L下降到2.0×1012/L～2.7×1012/L，血红蛋白从化疗前78 g/L～108 g/L下降到75 g/L～100 g/L。
, 百拇医药
2.3 化疗前后白血病细胞核基质蛋白的变化 MEA组9例CR及6例NR患者白血病细胞核基质蛋白在化疗前后的变化均分别相同，从SDS-PAGE电泳结果可知，CR患者化疗后核基质蛋白的分子量为48、55、57、70、80 kD的蛋白消失，分子量为50、58、180 kD的蛋白量明显减少；而NR患者白血病细胞核基质蛋白化疗前后无明显变化，化疗前分子量为180 kD的蛋白即消失(图1)。
3 讨论
难治性白血病是指连续正规化疗二次以上不缓解，或缓解后半年内复发，或复发二次以上的白血病患者。DNA拓朴酶Ⅱ阻断剂VP-16或VM26对细胞G2、S期有细胞毒作用；阿糖胞苷对肿瘤细胞的作用是先经脱氧胞苷激酶的催化，成为三磷酸阿糖胞苷，抑制DNA多聚酶，阻止DNA的合成。以往认为VP-16或VM26与阿糖胞苷合用治疗难治性白血病取得较好效果，但在临床上我们用VM26与阿糖胞苷联合化疗治疗难治性淋巴细胞白血病有效率仅有41.7%。米托蒽醌是带有氨基的蒽醌类化合物，属细胞周期非特异性药物，其抗肿瘤活性主要是干扰DNA异构酶Ⅱ，与阿糖胞苷合用，其抗癌效果明显增强，我们用MEA方案治疗难治性急性淋巴细胞白血病，有效率达66.7%，明显高于EmA方案的疗效，而且主要的毒副作用是骨髓抑制，在成分输血和刺激因子的保护下，患者无一例死于骨髓抑制。因此，MEA方案治疗难治性淋巴细胞白血病值得推广。该方案还应是急性淋巴细胞白血病复发患者的首选方案。
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核基质(nuclear matrix)或称核骨架(nuclear skeleton)是指细胞核内除核膜、Lamina、染色质与核仁以外存在的精细网络结构，核基质的成分较复杂，已测定核基质的蛋白成分占98%以上，主要是非组蛋白的不溶性纤维蛋白。其功能复杂，不仅是维持细胞核形态的支架，而且参与了细胞的许多生命活动过程，核基质在DNA复制染色体功能构建、基因表达等过程及细胞癌变方面起着主要的作用[4]，并与白血病细胞的耐药产生有关。从对MEA方案敏感患者的核基质蛋白分子量的变化分析，说明该方案与核基质蛋白密切相关，其中核基质上分子量为180 kD的蛋白是拓朴异构酶Ⅱ[5]，VP-16抑制拓扑异构酶Ⅱ从而参与影响核基质成分，核基质是MEA方案的作用位点。NR患者白血病细胞核基质蛋白化疗前后无明显变化，化疗前分子量为180 kD的蛋白即消失，这一变化可能与白血病细胞耐药性发生有关，由于失去主要化疗药物的作用位点，使白血病细胞逃脱化疗药物的毒性作用。
* 国家自然科学基金资助课题(资助号：39870327)
, 百拇医药
参考文献
1 李娟，任显辉，黄兆伟等.白血病细胞核基质蛋白的初步研究.中华肿瘤杂志，1998，20(6)∶425.
2 李娟，罗绍凯，洪文德等.难治性白血病细胞核基质蛋白变化的研究.肿瘤研究与临床，1998，10(2)∶76
3 Fey EG, Wan KM. Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold:three-dimensional organization and protein composition. J Cell Biol, 1984, 98∶1974
4 Davie JR. Histone modifications, chromatin structure, and the nuclear matrix. J cell Biochem, 1996, 62(2)∶149157
5 Nicoleta Z, Spartaco S, Andrea O, et al. Discrete localization of different DNA topoisomerases in Hela and K562 cell nuclei and subnuclear fractions. Exp Cell res, 1994, 210∶336, http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属第一医院血液科 广州 510080
关键词：白血病；化学治疗；核基质蛋白
华西药学杂志990520 提要 探索了用米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病及其前后细胞核基质蛋白的变化。结果三药联用的有效率为66.7%，明显高于对照组。说明米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗对治疗难治性急性淋巴细胞白血病有效，核基质是某些抗癌药物的作用点，分子量为180KD的核基质蛋白缺失可能与细胞耐药性有关。
TREATMENT FOR REFRACTORY ACUTE LYMPHOCYTE
LEUKEMIA WITH MITOXANTRONE，VP-16，Ara-C AND CHANGES
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OF THE NUCLEAR MATRIX PROTEIN
Li Juan Luo Shaokai Peng Aihua Yuan Yaoguang
(The first Affiliated Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences Guangzhou 510080)
ABSTRACT We treated eighteen patients with refractory acute lymphocyte leukemia with mitoxantrone, VP-16, Ara-C (MEA) and extracted and analysed the nuclear matrix proteins by high salt and SDS-PAGE before and after chemotherapty. The efficient rate was higher than the control.It was 66.7% in MEA group. Some nuclear matrix proteins in the patients responding to the protocol decreased or disappeared. But there were few changes in those of nonresponding to the protocol. The protein of 180kD had disappeared in the latter before chemotherapy. The results showed that MEA is an efficient protocol for the treatment of refractory acute lymphocyte leukemia, especially for relapsing acute lymphocyte leukemia. Nuclear matrix is the acting site of some anticancer drugs. the disappearance of the protein of 180kD may relate to cells resistance.
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Key Words Leukemia Chemotherapy Nuclear matrix protein
有关难治性急性淋巴细胞白血病的治疗方法已有报道，但疗效有差异。我院采用米托蒽酯、VP-16、阿糖胞苷(简称MEA方案)联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病18例，取得较好疗效。核基质是许多抗癌药物的作用点[1]，并与某些药物的耐药性有关[2]。化疗中比较了用MEA联合化疗方案前后取得的完全缓解和未缓解的难治性白血病患者白血病细胞核基质蛋白的变化，通过核基质蛋白的变化探讨其化疗药物作用位点及白血病细胞的耐药机制。
1 资料和治疗方法
1.1 临床资料 18例难治性急性淋巴细胞白血病患者均系我院1997年3月～1999年3月的住院者，按FAB分类均为急性淋巴细胞白血病，其中L16例，L211例，L31例，全部病例符合1998年全国血液病诊断标准。患者中男性11例，女性7例，年龄14岁～42岁，病程3.5月～48月。18例中14例为复发、4例为原发耐药的患者，在应用MEA方案前均采用过VDCP方案(V：长春新碱，D：柔红霉素，C：左旋门冬酰胺酶，P：强的松)二次以上。以1996年以来本院采用VM26、阿糖胞苷(简称EMA方案)方案化疗的12例难治性淋巴细胞白血病患者作历史对照。
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1.2 方法 MEA联合疗法以第1～5天静脉滴注米托蒽醌10 mg/(m2.d)，VP-16 100 mg/(m2.d)，阿糖胞苷200 mg/(m2.d)。EMA疗法以第1～5天静脉滴注VM26 100 mg/(m2.d)，阿糖胞苷2 00 mg/(m2.d)，两法均每12小时重复一次。所有患者化疗前应用康泉以预防呕吐反应，化疗出现严重骨髓抑制时使用粒细胞刺激因子，每28天为一周期，30例患者接受1～2个周期MEA或EMA方案化疗。
1.3 疗效判断 30例患者化疗前后均进行全身体检，腹部B超、骨髓穿刺涂片和血象检查，将疗效分为三个标准。完全缓解(CR)：临床上无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润的表现，血红蛋白>100 g/L，白细胞总数<10×109/L，分类无幼稚细胞，血小板100×109/L，骨髓象正常；部分缓解(PR)：临床表现、血象、骨髓象三系中有一或二项未达完全缓解的标准；未缓解(NR)：临床表现、血象骨髓象三系中均未达完全缓解的标准及无效者。
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1.4 细胞核基质蛋白的提取 分别取其中对MEA方案有效和无效的难治性淋巴细胞白血病患者的骨髓9例和6例，化疗前后各取骨髓20 ml，用淋巴细胞分离液分离出白血病细胞，参照Fey等[3]的方法提取核基质蛋白。细胞骨架(CSK)缓冲液(100 mmol/L Sucrose,0.5% Tritionx-100)15 min 4℃，离心后沉淀置含有100 μg/ml DNase Ⅰ和RNase A的消化液中，室温下作用20 min，加入终浓度为0.25 mol/L的冷硫酸铵，离心，沉淀溶于disassembly缓冲液(8 mol/L Urea,20 mmol/L Mes pH6.6,1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L PMSF,0.1 mmol/L MgCl, 1%2-ME)中，于4℃ 1∶1 000体积的透析液(0.15 mmol/L KCl,25 mmol/L Imida-zole pH7.1，5 mmol/L MgCl,2 mmol/L DTT,0.125 mmol/L EGTA,0.2 mmol/L PMSF)中透析16 h，超速离心，上清液用2.5倍的纯酒精使核基质蛋白沉淀，氮气吹干，溶解于尿素缓冲液中，-70℃保存。
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1.5 SDS-PAGE电泳 每个样品用10 μg进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为12%，分离胶浓度为4%，胶用银染色。
1.6 统计学方法 CR+PR为有效率，二个率的比较用χ2检验。
2 结果
2.1 临床疗效 MEA方案与EMA方案近期疗效的比较见表1，两率比较有显著性差异(P<0.05)。
表1 MEA方案与EMA方案疗效的比较 治疗方案
例数
CR
PR
, 百拇医药 NR
总有效率(%)
MEA
18
9
3
6
66.7
EMA
12
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MEA方案对原发耐药和复发的急性淋巴细胞白血病患者的疗效比较为14例复发的患者CR 8例，PR 2例，有效率71.4%，4例原发耐药患者CR 1例，PR 1例，有效率50.0%，两率比较P<0.001。
2.2 MEA方案的毒副反应 MEA方案的毒性反应是骨髓抑制，18例患者均出现严重的骨髓抑制，时间在化疗停止后的第3～27天，高峰时间在第7～10天，其中外周血白细胞从化疗前4.5×109/L～11.7×109/L下降到0.1×109/L～0.7×109/L，血小板从化疗前10.5×109/L～31.3×109/L下降到2.1×109/L～7×109/L，红细胞从化疗前2.3×1012/L～3.3×1012/L下降到2.0×1012/L～2.7×1012/L，血红蛋白从化疗前78 g/L～108 g/L下降到75 g/L～100 g/L。
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2.3 化疗前后白血病细胞核基质蛋白的变化 MEA组9例CR及6例NR患者白血病细胞核基质蛋白在化疗前后的变化均分别相同，从SDS-PAGE电泳结果可知，CR患者化疗后核基质蛋白的分子量为48、55、57、70、80 kD的蛋白消失，分子量为50、58、180 kD的蛋白量明显减少；而NR患者白血病细胞核基质蛋白化疗前后无明显变化，化疗前分子量为180 kD的蛋白即消失(图1)。
3 讨论
难治性白血病是指连续正规化疗二次以上不缓解，或缓解后半年内复发，或复发二次以上的白血病患者。DNA拓朴酶Ⅱ阻断剂VP-16或VM26对细胞G2、S期有细胞毒作用；阿糖胞苷对肿瘤细胞的作用是先经脱氧胞苷激酶的催化，成为三磷酸阿糖胞苷，抑制DNA多聚酶，阻止DNA的合成。以往认为VP-16或VM26与阿糖胞苷合用治疗难治性白血病取得较好效果，但在临床上我们用VM26与阿糖胞苷联合化疗治疗难治性淋巴细胞白血病有效率仅有41.7%。米托蒽醌是带有氨基的蒽醌类化合物，属细胞周期非特异性药物，其抗肿瘤活性主要是干扰DNA异构酶Ⅱ，与阿糖胞苷合用，其抗癌效果明显增强，我们用MEA方案治疗难治性急性淋巴细胞白血病，有效率达66.7%，明显高于EmA方案的疗效，而且主要的毒副作用是骨髓抑制，在成分输血和刺激因子的保护下，患者无一例死于骨髓抑制。因此，MEA方案治疗难治性淋巴细胞白血病值得推广。该方案还应是急性淋巴细胞白血病复发患者的首选方案。
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核基质(nuclear matrix)或称核骨架(nuclear skeleton)是指细胞核内除核膜、Lamina、染色质与核仁以外存在的精细网络结构，核基质的成分较复杂，已测定核基质的蛋白成分占98%以上，主要是非组蛋白的不溶性纤维蛋白。其功能复杂，不仅是维持细胞核形态的支架，而且参与了细胞的许多生命活动过程，核基质在DNA复制染色体功能构建、基因表达等过程及细胞癌变方面起着主要的作用[4]，并与白血病细胞的耐药产生有关。从对MEA方案敏感患者的核基质蛋白分子量的变化分析，说明该方案与核基质蛋白密切相关，其中核基质上分子量为180 kD的蛋白是拓朴异构酶Ⅱ[5]，VP-16抑制拓扑异构酶Ⅱ从而参与影响核基质成分，核基质是MEA方案的作用位点。NR患者白血病细胞核基质蛋白化疗前后无明显变化，化疗前分子量为180 kD的蛋白即消失，这一变化可能与白血病细胞耐药性发生有关，由于失去主要化疗药物的作用位点，使白血病细胞逃脱化疗药物的毒性作用。
* 国家自然科学基金资助课题(资助号：39870327)
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参考文献
1 李娟，任显辉，黄兆伟等.白血病细胞核基质蛋白的初步研究.中华肿瘤杂志，1998，20(6)∶425.
2 李娟，罗绍凯，洪文德等.难治性白血病细胞核基质蛋白变化的研究.肿瘤研究与临床，1998，10(2)∶76
3 Fey EG, Wan KM. Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold:three-dimensional organization and protein composition. J Cell Biol, 1984, 98∶1974
4 Davie JR. Histone modifications, chromatin structure, and the nuclear matrix. J cell Biochem, 1996, 62(2)∶149157
5 Nicoleta Z, Spartaco S, Andrea O, et al. Discrete localization of different DNA topoisomerases in Hela and K562 cell nuclei and subnuclear fractions. Exp Cell res, 1994, 210∶336, http://www.100md.com