MTX-右旋糖酐偶联物的合成及其对K562细胞的敏感性初探
作者：严忠勤 钟裕国 魏于全
单位：严忠勤 钟裕国(华西医科大学药学院 成都 610041)；魏于全(华西医科大学附一院生物治疗中心 成都 610041)
关键词：MTX-右旋糖酐偶联物；合成；K562细胞；细胞凋亡；生长周期
华西药学杂志990502 提要 用溴化氰活化右旋糖酐(T-77)后，通过6-氨基己酸间隔桥，用水溶性碳二亚胺(EDC)法将抗癌药甲胺喋呤(MTX)与糖基相偶联，合成MTX-右旋糖酐偶联物(MTX-D)。应用细胞凋亡荧光染色(AFS)法检测该偶联物MTX-D对人白血癌K562细胞的敏感性，结果该偶联物对K562细胞凋亡有诱导作用和影响其生长周期的作用。
STUDY ON SYNTHESIS MTX-D CONJUGATE AND
, 百拇医药 ITS SENSITIVITY TO K562 CELLS
Yan Zhongqin Zhong Yuguo
(School of Pharmacy, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
Wei Yuquan
(Biotherapy Center, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT This article reported the synthesis of MTX-D conjugate. The method involved three stages:the formation of a reactive intermediate by treating Dextran(T-77) with cyanogen bromide; the intermediate reacted with ε-aminocaproic acid as a spacer; MTX was conjugated to the spacer-introduced Dextran by a carbodiimide (EDC) catalyzed reaction. The results of sensitivity test by apoptosis fluorescance staining (AFS) assay showed that MTX-D had obviously sensitivity to K562 cells, and it could induce the apoptosis of tumor cells,and affect the growth period of the cells.
, http://www.100md.com
Key Words MTX-Dextran conjugate Synthesis K562 cell Sensitivity Apoptosis Growth period
甲胺喋呤(methotrexate,MTX)是用于临床的抗叶酸制剂，对白血病和实体瘤都有效，为临床基本抗肿瘤药物之一。70年代Sezaki等首先合成丝裂霉素C-右旋糖酐偶联物(MMC-D)，并发现其具有明显的趋淋巴性[1]。后又将其用于胃癌淋巴转移的实验性治疗和预防中，取得显著效果[2]。作者在合成和研究MMC-D对头颈癌的转移的实验性治疗和预防的基础上，合成了MTX-D；并采用细胞凋亡荧光染色法(AFS)检测了MTX-D对人白血癌细胞K562的敏感性。合成路线设计如下。
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1 实验部分
1.1 仪器、药品和细胞
岛津UV-2201紫外检测仪；LKB-2023型、85-2型磁力恒温搅拌器(上海司乐仪器厂)；LG-3型多用冰冻干燥机；PHB-4型酸度计(上海雷磁仪器厂)；2F-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；P-E983G IR红外测定仪；Coulter epics elite ESP流式细胞仪。右旋糖酐(Dextran,T-77,Sigma chemical Co.)；溴化氰(Merck公司)；6-氨基己酸(上海试剂三厂)；EDC*HCl[1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐](上海丽珠东风生物技术有限公司)；MTX(上海华联制药公司)。人白血癌细胞K562。RPMI1640培养基。
1.2 方法
1.2.1 MTX-D的合成 称取0.5 g右旋糖酐于烧瓶中，加入50 ml水，搅拌溶解，于16℃加入0.28 g溴化氰，溶解，滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为11.0，反应16～20 min，然后加入0.5 g 6-氨基己酸，用1 mol/L的盐酸调pH值为9.0，反应24 h后，再用pH值9.0的碳酸氢钠溶液透析3 d，至透析外液用硝酸酸化后与硝酸银反应无沉淀生成，共66 ml。取少许透析内液减压室温干燥，做红外分析，IR(KBr)cm-1：3433(OH)，2927(CH2)，1631(C=N)，1564、1487(COO)，1018(C-N)。
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量取右旋糖酐活化物15.0 ml，加入15 mg MTX，搅拌溶解成黄色溶液，加入0.22 g EDC.HCl，用1 mol/L的盐酸调pH值5～5.5，于16℃反应24 h。在4℃条件下用水透析3 d，至游离的MTX小分子完全透出，用苯酚-硫酸法定性糖基的存在[3]，共16.5 ml。将上述黄色的透析内液用微孔滤膜(0.65 μm)过滤，紫外分光光度法分析溶质含量0.819 mg/ml(以MTX计，370 nm，ε＝7100)。冰冻干燥，得黄色疏松状物143 mg，4℃避光保存。收率90.1%(以MTX计)。
1.2.2 MTX-D中MTX的含量测定 对结合型和游离型的MTX进行紫外吸收扫描，在370 nm波长处都有最大吸收峰(ε＝7100)。取冻干样品，用0.5 mol/L氯化钠的水溶液溶解，用Sephadex G-50柱(2 cm×70 cm)层析，0.5 mol/L氯化钠洗脱，所收集组份用重蒸水透析(4℃)，至无氯化钠透出为止，再冰冻干燥24 h，真空干燥24 h，取11.6 mg，用水定容至50.0 ml，紫外测定其含量。偶联物中MTX的含量为6.78%(w/w)。
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1.2.3 MTX-D的差式扫描量热法(DSC)分析 取4.55 mg右旋糖酐(T-77)、2.69 mg MTX、4.12 mg右旋糖酐和MTX(10∶1)机械混合物、2.28 mg MTX-D，以空气为气氛，升温速度10℃/min，纸速2 μm/min，用DSC-2C差式分析仪进行差式扫描量热法分析。
1.2.4 AFS法检测MTX-D对白血癌细胞K562的敏感性 取对数生长的白血癌细胞K562每孔200 000个于24孔板，每孔体积1.0 ml，共20孔。分别编号加入20、60、100(μl)浓度为1.0 mg/ml MTX-D和MTX，于37℃ 5%二氧化碳的孵箱中孵育48 h。
将细胞培养板取出，在显微镜下观察细胞生长情况，然后用滴管吹打数次，使细胞最大程度游离，将每孔的细胞悬液尽可能全部的转移到流式细胞仪专用试管中，以1 800 r/min离心5 min，倾去上清液，试管底部留下细胞，每管加入0.8 ml的PI染液，染色30 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡和生长周期变化情况。
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1.3 结果
1.3.1 四个样品在320～680 K范围内的吸热、放热峰型和峰位均不相同。Dextran(T-77)的放热峰范围为541～562 K，peak为550 K；MTX的放热峰范围为598～645 K，peak为625 K；Dextran(T-77)和MTX的机械混合物的放热峰范围为573～595 K，peak为583 K；MTX-D的吸热峰范围为547～585 K，peak为569 K。
由此可见，MTX-D的DSC图谱与其他三者有很大差别，只有MTX-D有吸热峰，说明MTX-D不是右旋糖酐和MTX的简单包裹或吸附，初步推测为共价结合，且稳定性增加。
1.3.2 在敏感性实验中，显微镜下观察细胞生长情况，有成团或浮起的细胞，有的细胞核固缩，碎裂，细胞边缘不清。空白组细胞呈圆形，透光性好，结构清晰，说明MTX-D和MTX都能使癌细胞形态改变，细胞对其敏感。
, 百拇医药
1.3.3 从图1可看出，MTX-D和MTX对癌细胞K562作用后，在DNA荧光强度图谱中，与阴性对照相比，凋亡峰面积有明显增加，各生长周期(G1期，G2期，S期)的峰型变化较大；从表1中可以看出凋亡细胞增加至少一倍，结果显示MTX-D和MTX对癌细胞K562有明显的凋亡诱导作用，且MTX-D稍强于MTX。又从表2可看出MTX-D和MTX对K562细胞作用后，各生长周期峰面积变化也较大，其中S期变化最大，这与MTX主要作用于癌细胞的S期相一致，且MTX-D的影响更大，说明MTX-D对K562细胞具有明显的敏感性，MTX-D仍具有强的抗癌活性。
Fig 1 DNA fluorescence intensity of K562 cells treating by different concentrations (20、60、100μg/ml) of MTX,MTX-D for 72 h
, 百拇医药
Table 1 The percentage of apoptosis cells in total K562 cells treated by different concentration MTX and MTX-D for 72 h Control
MTX(μg/ml)
MTX-D(μg/ml)
20
60
100
20
60
100
4.4
, 百拇医药
8.1
9.1
8.7
10.7
10.3
9.9
Table 2 The effect of different concentration MTX and MTX-D on the growth period of K562 for 72 h Sample
Conc.
(μg/ml)
Percentage of every growth periods(%)
, 百拇医药
G1
G2
S
Control
50.9
14.6
34.4
MTX
20
38.0
3.0
59.0
60
, 百拇医药
43.2
5.3
51.5
100
45.7
4.7
49.6
MTX-D
20
26.0
2.8
71.2
60
, 百拇医药
23.8
2.3
73.9
100
24.0
4.3
71.7
2 讨论
2.1 MTX-右旋糖酐偶联物未见文献报道。将右旋糖酐与小分子药物偶联的化学方法很多[4，5]。文中用溴化氰活化糖的羟基，再与6-氨基己酸结合形成一个“臂”，该“臂”末端一COOH与甲胺喋呤上的-NH2在水溶性碳二亚胺(EDC)的缩合下，生成酰胺偶联物，而体内广泛存在水解酰胺键的酶，在生理条件下，较易水解释放出小分子药物，发挥药效。由于右旋糖酐的平均分子量为七万七千道尔顿，因此，对于偶联物MTX-D的偶联方式难以确证。作者用DSC分析间接证明MTX-D不是MTX和右旋糖酐的吸附或包裹物，而是一种结构更稳定的新化合物。
, http://www.100md.com
2.2 测定肿瘤化疗药物敏感性的方法有多种[6]，研究表明许多化疗药物均能诱导敏感细胞发生凋亡，影响细胞生长周期[7]。实验采用细胞凋亡荧光染色法观察了MTX-D对K562细胞的凋亡诱导和生长周期的影响，研究中还可观察到药物作用后肿瘤细胞的功能和形态学变化，因此该方法较之传统的MTT法客观、敏感，且重复性好。
以上研究表明，MTX-右旋糖酐偶联物具有抗肿瘤活性，可进一步进行抗肿瘤淋巴转移的研究。
参考文献
1 Hasnida M, Takakura Y, Matsumo D, et al. Regeneration characteristics in relation to its activity. Chem Pharm Bull,1983,31(6)∶2055
, http://www.100md.com 2 Takakura Yo, Matsumoto Sa, Hashida Mi. Enhanced lymphatic delivery of Mitomycin C conjugated with Dextran. Cancer Res,1984,44∶2505
3 Michel Dubois KA, Gilles JK, Hamiction PA.Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analytical Chemisty,1956,28(3)∶350
4 Takakura, Kaneko, Fuji TA. Control of pharmaceutical properties of soybean trypsin inhibitor by conjugation with dextran:synthesis and characterization. J Phar Sci,1989,78(2)∶117
5 Shih, Sharkey, Primus, et al. Site spacific linkage of Methotrexate to monoclonal antibodies using an intermediate carrier. Int Cancer,1988,41∶832
6 韩锐主编.肿瘤化学预防和药物治疗.北京：北医大协和医大联合出版社，1991.417
7 Craig B, Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science,1995,267∶1456, http://www.100md.com
单位：严忠勤 钟裕国(华西医科大学药学院 成都 610041)；魏于全(华西医科大学附一院生物治疗中心 成都 610041)
关键词：MTX-右旋糖酐偶联物；合成；K562细胞；细胞凋亡；生长周期
华西药学杂志990502 提要 用溴化氰活化右旋糖酐(T-77)后，通过6-氨基己酸间隔桥，用水溶性碳二亚胺(EDC)法将抗癌药甲胺喋呤(MTX)与糖基相偶联，合成MTX-右旋糖酐偶联物(MTX-D)。应用细胞凋亡荧光染色(AFS)法检测该偶联物MTX-D对人白血癌K562细胞的敏感性，结果该偶联物对K562细胞凋亡有诱导作用和影响其生长周期的作用。
STUDY ON SYNTHESIS MTX-D CONJUGATE AND
, 百拇医药 ITS SENSITIVITY TO K562 CELLS
Yan Zhongqin Zhong Yuguo
(School of Pharmacy, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
Wei Yuquan
(Biotherapy Center, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT This article reported the synthesis of MTX-D conjugate. The method involved three stages:the formation of a reactive intermediate by treating Dextran(T-77) with cyanogen bromide; the intermediate reacted with ε-aminocaproic acid as a spacer; MTX was conjugated to the spacer-introduced Dextran by a carbodiimide (EDC) catalyzed reaction. The results of sensitivity test by apoptosis fluorescance staining (AFS) assay showed that MTX-D had obviously sensitivity to K562 cells, and it could induce the apoptosis of tumor cells,and affect the growth period of the cells.
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Key Words MTX-Dextran conjugate Synthesis K562 cell Sensitivity Apoptosis Growth period
甲胺喋呤(methotrexate,MTX)是用于临床的抗叶酸制剂，对白血病和实体瘤都有效，为临床基本抗肿瘤药物之一。70年代Sezaki等首先合成丝裂霉素C-右旋糖酐偶联物(MMC-D)，并发现其具有明显的趋淋巴性[1]。后又将其用于胃癌淋巴转移的实验性治疗和预防中，取得显著效果[2]。作者在合成和研究MMC-D对头颈癌的转移的实验性治疗和预防的基础上，合成了MTX-D；并采用细胞凋亡荧光染色法(AFS)检测了MTX-D对人白血癌细胞K562的敏感性。合成路线设计如下。
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1 实验部分
1.1 仪器、药品和细胞
岛津UV-2201紫外检测仪；LKB-2023型、85-2型磁力恒温搅拌器(上海司乐仪器厂)；LG-3型多用冰冻干燥机；PHB-4型酸度计(上海雷磁仪器厂)；2F-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；P-E983G IR红外测定仪；Coulter epics elite ESP流式细胞仪。右旋糖酐(Dextran,T-77,Sigma chemical Co.)；溴化氰(Merck公司)；6-氨基己酸(上海试剂三厂)；EDC*HCl[1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐](上海丽珠东风生物技术有限公司)；MTX(上海华联制药公司)。人白血癌细胞K562。RPMI1640培养基。
1.2 方法
1.2.1 MTX-D的合成 称取0.5 g右旋糖酐于烧瓶中，加入50 ml水，搅拌溶解，于16℃加入0.28 g溴化氰，溶解，滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为11.0，反应16～20 min，然后加入0.5 g 6-氨基己酸，用1 mol/L的盐酸调pH值为9.0，反应24 h后，再用pH值9.0的碳酸氢钠溶液透析3 d，至透析外液用硝酸酸化后与硝酸银反应无沉淀生成，共66 ml。取少许透析内液减压室温干燥，做红外分析，IR(KBr)cm-1：3433(OH)，2927(CH2)，1631(C=N)，1564、1487(COO)，1018(C-N)。
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量取右旋糖酐活化物15.0 ml，加入15 mg MTX，搅拌溶解成黄色溶液，加入0.22 g EDC.HCl，用1 mol/L的盐酸调pH值5～5.5，于16℃反应24 h。在4℃条件下用水透析3 d，至游离的MTX小分子完全透出，用苯酚-硫酸法定性糖基的存在[3]，共16.5 ml。将上述黄色的透析内液用微孔滤膜(0.65 μm)过滤，紫外分光光度法分析溶质含量0.819 mg/ml(以MTX计，370 nm，ε＝7100)。冰冻干燥，得黄色疏松状物143 mg，4℃避光保存。收率90.1%(以MTX计)。
1.2.2 MTX-D中MTX的含量测定 对结合型和游离型的MTX进行紫外吸收扫描，在370 nm波长处都有最大吸收峰(ε＝7100)。取冻干样品，用0.5 mol/L氯化钠的水溶液溶解，用Sephadex G-50柱(2 cm×70 cm)层析，0.5 mol/L氯化钠洗脱，所收集组份用重蒸水透析(4℃)，至无氯化钠透出为止，再冰冻干燥24 h，真空干燥24 h，取11.6 mg，用水定容至50.0 ml，紫外测定其含量。偶联物中MTX的含量为6.78%(w/w)。
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1.2.3 MTX-D的差式扫描量热法(DSC)分析 取4.55 mg右旋糖酐(T-77)、2.69 mg MTX、4.12 mg右旋糖酐和MTX(10∶1)机械混合物、2.28 mg MTX-D，以空气为气氛，升温速度10℃/min，纸速2 μm/min，用DSC-2C差式分析仪进行差式扫描量热法分析。
1.2.4 AFS法检测MTX-D对白血癌细胞K562的敏感性 取对数生长的白血癌细胞K562每孔200 000个于24孔板，每孔体积1.0 ml，共20孔。分别编号加入20、60、100(μl)浓度为1.0 mg/ml MTX-D和MTX，于37℃ 5%二氧化碳的孵箱中孵育48 h。
将细胞培养板取出，在显微镜下观察细胞生长情况，然后用滴管吹打数次，使细胞最大程度游离，将每孔的细胞悬液尽可能全部的转移到流式细胞仪专用试管中，以1 800 r/min离心5 min，倾去上清液，试管底部留下细胞，每管加入0.8 ml的PI染液，染色30 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡和生长周期变化情况。
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1.3 结果
1.3.1 四个样品在320～680 K范围内的吸热、放热峰型和峰位均不相同。Dextran(T-77)的放热峰范围为541～562 K，peak为550 K；MTX的放热峰范围为598～645 K，peak为625 K；Dextran(T-77)和MTX的机械混合物的放热峰范围为573～595 K，peak为583 K；MTX-D的吸热峰范围为547～585 K，peak为569 K。
由此可见，MTX-D的DSC图谱与其他三者有很大差别，只有MTX-D有吸热峰，说明MTX-D不是右旋糖酐和MTX的简单包裹或吸附，初步推测为共价结合，且稳定性增加。
1.3.2 在敏感性实验中，显微镜下观察细胞生长情况，有成团或浮起的细胞，有的细胞核固缩，碎裂，细胞边缘不清。空白组细胞呈圆形，透光性好，结构清晰，说明MTX-D和MTX都能使癌细胞形态改变，细胞对其敏感。
, 百拇医药
1.3.3 从图1可看出，MTX-D和MTX对癌细胞K562作用后，在DNA荧光强度图谱中，与阴性对照相比，凋亡峰面积有明显增加，各生长周期(G1期，G2期，S期)的峰型变化较大；从表1中可以看出凋亡细胞增加至少一倍，结果显示MTX-D和MTX对癌细胞K562有明显的凋亡诱导作用，且MTX-D稍强于MTX。又从表2可看出MTX-D和MTX对K562细胞作用后，各生长周期峰面积变化也较大，其中S期变化最大，这与MTX主要作用于癌细胞的S期相一致，且MTX-D的影响更大，说明MTX-D对K562细胞具有明显的敏感性，MTX-D仍具有强的抗癌活性。
Fig 1 DNA fluorescence intensity of K562 cells treating by different concentrations (20、60、100μg/ml) of MTX,MTX-D for 72 h
, 百拇医药
Table 1 The percentage of apoptosis cells in total K562 cells treated by different concentration MTX and MTX-D for 72 h Control
MTX(μg/ml)
MTX-D(μg/ml)
20
60
100
20
60
100
4.4
, 百拇医药
8.1
9.1
8.7
10.7
10.3
9.9
Table 2 The effect of different concentration MTX and MTX-D on the growth period of K562 for 72 h Sample
Conc.
(μg/ml)
Percentage of every growth periods(%)
, 百拇医药
G1
G2
S
Control
50.9
14.6
34.4
MTX
20
38.0
3.0
59.0
60
, 百拇医药
43.2
5.3
51.5
100
45.7
4.7
49.6
MTX-D
20
26.0
2.8
71.2
60
, 百拇医药
23.8
2.3
73.9
100
24.0
4.3
71.7
2 讨论
2.1 MTX-右旋糖酐偶联物未见文献报道。将右旋糖酐与小分子药物偶联的化学方法很多[4，5]。文中用溴化氰活化糖的羟基，再与6-氨基己酸结合形成一个“臂”，该“臂”末端一COOH与甲胺喋呤上的-NH2在水溶性碳二亚胺(EDC)的缩合下，生成酰胺偶联物，而体内广泛存在水解酰胺键的酶，在生理条件下，较易水解释放出小分子药物，发挥药效。由于右旋糖酐的平均分子量为七万七千道尔顿，因此，对于偶联物MTX-D的偶联方式难以确证。作者用DSC分析间接证明MTX-D不是MTX和右旋糖酐的吸附或包裹物，而是一种结构更稳定的新化合物。
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2.2 测定肿瘤化疗药物敏感性的方法有多种[6]，研究表明许多化疗药物均能诱导敏感细胞发生凋亡，影响细胞生长周期[7]。实验采用细胞凋亡荧光染色法观察了MTX-D对K562细胞的凋亡诱导和生长周期的影响，研究中还可观察到药物作用后肿瘤细胞的功能和形态学变化，因此该方法较之传统的MTT法客观、敏感，且重复性好。
以上研究表明，MTX-右旋糖酐偶联物具有抗肿瘤活性，可进一步进行抗肿瘤淋巴转移的研究。
参考文献
1 Hasnida M, Takakura Y, Matsumo D, et al. Regeneration characteristics in relation to its activity. Chem Pharm Bull,1983,31(6)∶2055
, http://www.100md.com 2 Takakura Yo, Matsumoto Sa, Hashida Mi. Enhanced lymphatic delivery of Mitomycin C conjugated with Dextran. Cancer Res,1984,44∶2505
3 Michel Dubois KA, Gilles JK, Hamiction PA.Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analytical Chemisty,1956,28(3)∶350
4 Takakura, Kaneko, Fuji TA. Control of pharmaceutical properties of soybean trypsin inhibitor by conjugation with dextran:synthesis and characterization. J Phar Sci,1989,78(2)∶117
5 Shih, Sharkey, Primus, et al. Site spacific linkage of Methotrexate to monoclonal antibodies using an intermediate carrier. Int Cancer,1988,41∶832
6 韩锐主编.肿瘤化学预防和药物治疗.北京：北医大协和医大联合出版社，1991.417
7 Craig B, Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science,1995,267∶1456, http://www.100md.com