自由基对豚鼠胆色素结石形成的影响
作者：王俊田 陈允清 牛树凯
单位：山西省肿瘤医院(030013) 王俊田 陈允清；山西医科大学第一医院 牛树凯
关键词：自由基；粘蛋白；β-葡萄糖醛酸酶；胆红素；维生素E；胆色素结石
自由基对豚鼠胆色素结石形成的影响
摘要 复制林可霉素致豚鼠胆囊胆色素结石的模型(B组)；用维生素E(VE)抗氧化预防结石形成(C组)。在结石形成的早期， 测定其胆囊胆汁中的丙二醛(MDA)、粘蛋白(MP)、 β-葡萄糖醛酸酶(β-G)和总胆红素(TB)的含量。结果表明：B、C两组胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB的含量比正常对照组(A组)均显著增高。B、C两组间各成分无差异。B、C组MDA含量的对数与MP或β-G含量的对数分别呈显著正相关。说明炎症等病理过程产生的自由基通过对胆道粘膜上皮的损伤，扰乱其功能， 在林可霉素致豚鼠胆色素结石的过程中起一定的作用。
, 百拇医药
胆色素结石的形成常与炎症有关〔1〕。炎症过程中活化的炎症细胞可产生大量的自由基〔2，3〕。可以设想，作为炎症介质的自由基在结石形成过程中可能起一定的作用。 本实验通过对胆色素结石模型组和维生素E(VE)抗氧化组豚鼠结石形成早期胆囊胆汁中脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)和胆囊胆汁中粘蛋白(MP)、β-葡萄糖醛酸酶(β-G)和总胆红素(TB)含量的测定以及MDA含量与其它成石组分相关性的分析，旨在了解豚鼠胆色素结石形成的早期，其胆道自由基反应对结石形成的影响以及VE可能的预防作用。
1 材料与方法
1.1 动物实验和样本的收集
25只豚鼠，体重450g～600g，雌雄不拘，随机分成三组：正常对照组(A组)7只，皮下注射相当量的生理盐水；胆囊胆色素结石模型组(B组)9只，皮下注射林可霉素70mg·kg-1·d-1，连续7d；抗氧化预防结石形成(C组)9只，在给林可霉素处理的同时，提前3d皮下注射VE6mg·kg-1·d-1，共10天。三组动物饲以同样的普通青饲料和胡萝卜，自由饮水。林可霉素处理后的第8天(即最后一剂林可霉素后24h)，在超量戊巴比妥麻醉下剖腹手术。术前动物禁食12h。完整切下胆囊和一小部分胆囊管，拭净血迹，轻轻挤出胆囊胆汁于5ml离心管中，记录胆汁量。随后1000r/min离心10min，倒出上清胆汁，避光保存。所有标本在2h内做有关生化分析。
, 百拇医药
1.2 生化分析
1.2.1 胆汁MDA的测定：对改良八木国夫法〔4〕略加改进测定胆汁中MDA含量。通过测定胆汁中MDA含量，从而间接反应胆道自由基水平。
1.2.2 胆汁MP的测定：根据Oricin法〔5〕和Lowry法〔6〕测定。 预实验用Oricin法测定，比色时发现A值读数太小，误差大，重复性不好。磷钨酸沉淀出粘蛋白后，改用Lowry法显色分析，A值读数变大，灵敏性提高。标准蛋白用牛血清蛋白。
1.2.3 胆汁β-G测定：根据Fishman法〔7〕，以酚酞葡萄糖醛酸苷(Sigma)为基质，酚酞为标准，测定38℃下pH为52时释放的酚酞量。每小时释放1μg酚酞为1个活性单位。24h作为反应终点。
1.2.4 胆汁总胆红素的测定：根据重氮试剂法。
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1.3 统计学处理
胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB含量的实测值均经对数转换，资料符合正态分布， 方差齐同，各组间指标的比较采用方差分析。
2 结果
2.1 豚鼠皮下注射林可霉素后，食欲减退、消瘦、毛色无光。部分豚鼠出现腹泻。B组死亡1只，C组死亡2只。对照组胆汁清亮浅黄。实验B、C组，除C组1只外， 其余胆囊都有充血性炎症，胆囊胆汁浑浊，内有数量不等的黄白色絮状物，同时有明显的黄绿色到黑褐色的胆泥形成。多数动物结肠积气膨胀，内含半液状腐臭内容。少数动物结肠有出血性炎症。
2.2 胆囊胆汁生化分析结果见表1。三组之间胆囊胆汁量无差异。B、C组胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB的含量比A组均显著增高。B、C两组间各值的比较无显著差异(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 各组间胆囊胆汁量及MDA、MP、β-G和TB含量的比较(x±s) 组别(n)
胆汁量
ml
MDAμ
mol/ml
MP
mg/L
β-G
U/L
TB
μmol/L
A(7)
, 百拇医药
1.5±0.7
4.4±2.9
770±212
22036±17508
20.5±4.5
B(8)
1.6±0.5
11.7±7.62)
1743±5892)
46041±255701)
32.6±13.61)
, 百拇医药
C(7)
1.2±0.2
13.1±5.42)
1574±3582)
46154±263071)
35.6±13.41)
注：1)与A组比较P<0.05；2)与A组比较P<0.01。
2.3 各组胆囊胆汁中MDA含量与MP和β-G含量的相关性分析： 除A组外，B、C组胆囊胆汁中MDA含量的对数与MP或β-G含量的对数均呈显著正相关； 且B、C两组间回归系数相差无显著性。三组的MDA含量与TB的含量均无相关关系(rA＝0.28，P>0.25；rB＝0.48，P>0.10；rC＝0.46，P>0.10)。
, 百拇医药
3 讨论
自由基的产生可源于机体的代谢过程，也可由炎症等病理过程产生〔2，3〕。炎症细胞生成的O-2·和OH·是杀死微生物的重要机制，同时也造成组织的损伤。实验B、C组豚鼠胆囊组织有炎症反应，类似的现象还见于别的胆结石模型动物〔8〕。胆汁中的MDA水平是自由基对胆道细胞和亚细胞结构脂质过氧化损伤程度的反应。
正常的胆囊粘膜可分泌少量的粘液，对胆囊粘膜起保护作用。但过多分泌的粘液就可构成结石的网状支架，胆汁中的胆固醇结晶和胆色素颗粒就可聚集其网眼中形成沉淀。Lee〔8〕对多种胆结石动物模型对比观察后发现各种胆结石的模型动物在其结石形成的早期阶段都有MP的高分泌现象。我们对实验豚鼠结石形成早期胆囊胆汁中MP含量的测定以及对胆囊组织学的观察证明林可霉素致豚鼠胆色素结石形成的早期确实存在着胆囊粘膜MP的高合成分泌现象。这和Lee等人〔9〕对本模型的观察结果是一致的。
, 百拇医药
引起胆囊粘膜合成分泌MP的因素和确切机制仍不十分清楚，多种因素都可使胆囊粘膜合成分泌MP增多。 我们对实验动物胆囊胆汁中MDA含量与MP含量的测定以及相关性的分析提示自由基也是引起胆囊粘膜高分泌MP的一个原因。 Hale等〔10〕用体外组织培养的方法证明羟基自由基和由激活的粒细胞产生的氧自由基都能引起豚鼠胆囊粘膜上皮细胞快速分泌糖蛋白。推测自由基引起粘膜合成分泌MP的机制有三个方面：①自由基的直接作用。Lee等〔8〕认为作为一种保护性机制，胆囊粘膜上皮细胞对各种损伤性刺激的早期反应就是粘液的分泌和上皮的增生。②自由基可通过激活磷脂酶促进花生四烯酸生成前列腺素的代谢过程。前列腺素和花生四烯酸都被证明是胆囊粘膜合成分泌MP的促泌素〔11〕。③ 自由基可与细胞膜磷脂中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损害细胞磷脂膜的结构，使其通透性增加，造成细胞外Ca2+进入细胞内，激活细胞内合成分泌MP的过程。Malet等〔12〕证明细胞内的Ca2+有增强胆囊粘膜分泌MP的作用。
, 百拇医药
β-G可将水溶性的结合胆红素水解为非水溶性的未结合胆红素，在胆色素结石的形成中起重要作用。胆汁中的β-G可源于胆道感染的大肠杆菌所产生，也可由胆道组织细胞溶酶体的损伤、破坏释放入胆汁。 本模型胆汁细菌培养为阳性〔13〕，说明其胆汁中的β-G含量显著增高， 且β-G含量与MDA含量呈相关性，说明自由基对胆道细胞溶酶体的损伤是造成β-G增高的一个原因。Kalra等〔14〕证明由黄嘌呤氧化酶+次黄嘌呤体系产生的超氧游离基可造成细胞溶酶体β-G的外逸。
胆汁中胆红素的增多受多种因素的影响。实验B、C组胆囊胆汁中TB含量增高的原因可能与实验动物溶血，红细胞破坏过多有关〔9〕。胆汁胆红素的增高对胆色素结石的形成固然重要， 但胆红素沉淀的形成以及最终固化成结石的过程更为重要。 体外的研究证明O2-2·和OH·均可诱发胆红素聚合和聚集，并使胆红素转变成稳定的自由基。经自由基处理后的胆红素溶解度降低，颗粒增大，易于沉淀〔15〕。实验B、C组豚鼠胆囊胆汁中MDA的含量显著增高，但MDA的含量与TB的含量无相关性， 表明自由基不是通过胆红素的产生而是可能通过别的环节影响胆色素结石形成的。
, http://www.100md.com
VE在体内外都具有强大的抗氧化作用。VE的抗氧化作用不仅有剂量依存关系，而且与不饱和脂肪酸的量和促化因子(如活性氧、铁等)的量有关〔16〕。我们所采用VE的剂量没有起到抗氧化的作用，看来在选择VE剂量和给药途径上还需进一步研究。
可以认为炎症等病理过程产生的自由基，通过对胆道粘膜上皮细胞和亚细胞结构的破坏和功能的扰乱，造成胆囊粘膜MP分泌增多和溶酶体酶(β-G)释放入胆汁，同时自由基还可直接诱发胆红素的聚合和聚集，形成胆红素多聚物，促其沉淀。最后在多因素的共同作用下形成胆色素结石。不过，和其它任何一种致石因素一样，自由基对胆色素结石形成的影响只是复杂的成石机制的部分解释。
参考文献
1 SolowayRDGastroenterol,1977,72:167
2 BabiorBM.NEngJMed,1978,298:659
, 百拇医药
3 LaurentB,ArdaillouR.AmJPhysiol,1986,251:F765～F776
4 齐凤菊第一军医大学学报，1986，2：152
5 中村一良最新医学，1960，15：358
6 LowryOH.JBiolChem,1951,193:265～275
7 FishmanWH.ClinChimActa,1967,15:435
8 LeeSP.AmJPathol,1982,108:1～8
9 LeeSP,ScottAJ.JPath,1980,131:117
10 HaleWB.AmJPhysiol,1987,253:G627～G630
, 百拇医药
11 LamorteWW.AmJPhysiol,1986,251:G701～G709
12 MaletPF.ClinRes,1981,29:668A
13 LeeSP,ThomsenLL.Pathology,1982,14:317
14 KalraJ.MolCellBioth,1988,84:233
15 刘湘陶生化物学杂志，1990，6(5)：437
16 LieblerDC.JBiolChem,1986,261:121、154
(收稿日期：1998-11-18)
作者简介：王俊田，男，1964年5月生，主治医师，山西省肿瘤医院，030013, 百拇医药
单位：山西省肿瘤医院(030013) 王俊田 陈允清；山西医科大学第一医院 牛树凯
关键词：自由基；粘蛋白；β-葡萄糖醛酸酶；胆红素；维生素E；胆色素结石
自由基对豚鼠胆色素结石形成的影响
摘要 复制林可霉素致豚鼠胆囊胆色素结石的模型(B组)；用维生素E(VE)抗氧化预防结石形成(C组)。在结石形成的早期， 测定其胆囊胆汁中的丙二醛(MDA)、粘蛋白(MP)、 β-葡萄糖醛酸酶(β-G)和总胆红素(TB)的含量。结果表明：B、C两组胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB的含量比正常对照组(A组)均显著增高。B、C两组间各成分无差异。B、C组MDA含量的对数与MP或β-G含量的对数分别呈显著正相关。说明炎症等病理过程产生的自由基通过对胆道粘膜上皮的损伤，扰乱其功能， 在林可霉素致豚鼠胆色素结石的过程中起一定的作用。
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胆色素结石的形成常与炎症有关〔1〕。炎症过程中活化的炎症细胞可产生大量的自由基〔2，3〕。可以设想，作为炎症介质的自由基在结石形成过程中可能起一定的作用。 本实验通过对胆色素结石模型组和维生素E(VE)抗氧化组豚鼠结石形成早期胆囊胆汁中脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)和胆囊胆汁中粘蛋白(MP)、β-葡萄糖醛酸酶(β-G)和总胆红素(TB)含量的测定以及MDA含量与其它成石组分相关性的分析，旨在了解豚鼠胆色素结石形成的早期，其胆道自由基反应对结石形成的影响以及VE可能的预防作用。
1 材料与方法
1.1 动物实验和样本的收集
25只豚鼠，体重450g～600g，雌雄不拘，随机分成三组：正常对照组(A组)7只，皮下注射相当量的生理盐水；胆囊胆色素结石模型组(B组)9只，皮下注射林可霉素70mg·kg-1·d-1，连续7d；抗氧化预防结石形成(C组)9只，在给林可霉素处理的同时，提前3d皮下注射VE6mg·kg-1·d-1，共10天。三组动物饲以同样的普通青饲料和胡萝卜，自由饮水。林可霉素处理后的第8天(即最后一剂林可霉素后24h)，在超量戊巴比妥麻醉下剖腹手术。术前动物禁食12h。完整切下胆囊和一小部分胆囊管，拭净血迹，轻轻挤出胆囊胆汁于5ml离心管中，记录胆汁量。随后1000r/min离心10min，倒出上清胆汁，避光保存。所有标本在2h内做有关生化分析。
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1.2 生化分析
1.2.1 胆汁MDA的测定：对改良八木国夫法〔4〕略加改进测定胆汁中MDA含量。通过测定胆汁中MDA含量，从而间接反应胆道自由基水平。
1.2.2 胆汁MP的测定：根据Oricin法〔5〕和Lowry法〔6〕测定。 预实验用Oricin法测定，比色时发现A值读数太小，误差大，重复性不好。磷钨酸沉淀出粘蛋白后，改用Lowry法显色分析，A值读数变大，灵敏性提高。标准蛋白用牛血清蛋白。
1.2.3 胆汁β-G测定：根据Fishman法〔7〕，以酚酞葡萄糖醛酸苷(Sigma)为基质，酚酞为标准，测定38℃下pH为52时释放的酚酞量。每小时释放1μg酚酞为1个活性单位。24h作为反应终点。
1.2.4 胆汁总胆红素的测定：根据重氮试剂法。
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1.3 统计学处理
胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB含量的实测值均经对数转换，资料符合正态分布， 方差齐同，各组间指标的比较采用方差分析。
2 结果
2.1 豚鼠皮下注射林可霉素后，食欲减退、消瘦、毛色无光。部分豚鼠出现腹泻。B组死亡1只，C组死亡2只。对照组胆汁清亮浅黄。实验B、C组，除C组1只外， 其余胆囊都有充血性炎症，胆囊胆汁浑浊，内有数量不等的黄白色絮状物，同时有明显的黄绿色到黑褐色的胆泥形成。多数动物结肠积气膨胀，内含半液状腐臭内容。少数动物结肠有出血性炎症。
2.2 胆囊胆汁生化分析结果见表1。三组之间胆囊胆汁量无差异。B、C组胆囊胆汁中MDA、MP、β-G和TB的含量比A组均显著增高。B、C两组间各值的比较无显著差异(P<0.05)。
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表1 各组间胆囊胆汁量及MDA、MP、β-G和TB含量的比较(x±s) 组别(n)
胆汁量
ml
MDAμ
mol/ml
MP
mg/L
β-G
U/L
TB
μmol/L
A(7)
, 百拇医药
1.5±0.7
4.4±2.9
770±212
22036±17508
20.5±4.5
B(8)
1.6±0.5
11.7±7.62)
1743±5892)
46041±255701)
32.6±13.61)
, 百拇医药
C(7)
1.2±0.2
13.1±5.42)
1574±3582)
46154±263071)
35.6±13.41)
注：1)与A组比较P<0.05；2)与A组比较P<0.01。
2.3 各组胆囊胆汁中MDA含量与MP和β-G含量的相关性分析： 除A组外，B、C组胆囊胆汁中MDA含量的对数与MP或β-G含量的对数均呈显著正相关； 且B、C两组间回归系数相差无显著性。三组的MDA含量与TB的含量均无相关关系(rA＝0.28，P>0.25；rB＝0.48，P>0.10；rC＝0.46，P>0.10)。
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3 讨论
自由基的产生可源于机体的代谢过程，也可由炎症等病理过程产生〔2，3〕。炎症细胞生成的O-2·和OH·是杀死微生物的重要机制，同时也造成组织的损伤。实验B、C组豚鼠胆囊组织有炎症反应，类似的现象还见于别的胆结石模型动物〔8〕。胆汁中的MDA水平是自由基对胆道细胞和亚细胞结构脂质过氧化损伤程度的反应。
正常的胆囊粘膜可分泌少量的粘液，对胆囊粘膜起保护作用。但过多分泌的粘液就可构成结石的网状支架，胆汁中的胆固醇结晶和胆色素颗粒就可聚集其网眼中形成沉淀。Lee〔8〕对多种胆结石动物模型对比观察后发现各种胆结石的模型动物在其结石形成的早期阶段都有MP的高分泌现象。我们对实验豚鼠结石形成早期胆囊胆汁中MP含量的测定以及对胆囊组织学的观察证明林可霉素致豚鼠胆色素结石形成的早期确实存在着胆囊粘膜MP的高合成分泌现象。这和Lee等人〔9〕对本模型的观察结果是一致的。
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引起胆囊粘膜合成分泌MP的因素和确切机制仍不十分清楚，多种因素都可使胆囊粘膜合成分泌MP增多。 我们对实验动物胆囊胆汁中MDA含量与MP含量的测定以及相关性的分析提示自由基也是引起胆囊粘膜高分泌MP的一个原因。 Hale等〔10〕用体外组织培养的方法证明羟基自由基和由激活的粒细胞产生的氧自由基都能引起豚鼠胆囊粘膜上皮细胞快速分泌糖蛋白。推测自由基引起粘膜合成分泌MP的机制有三个方面：①自由基的直接作用。Lee等〔8〕认为作为一种保护性机制，胆囊粘膜上皮细胞对各种损伤性刺激的早期反应就是粘液的分泌和上皮的增生。②自由基可通过激活磷脂酶促进花生四烯酸生成前列腺素的代谢过程。前列腺素和花生四烯酸都被证明是胆囊粘膜合成分泌MP的促泌素〔11〕。③ 自由基可与细胞膜磷脂中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损害细胞磷脂膜的结构，使其通透性增加，造成细胞外Ca2+进入细胞内，激活细胞内合成分泌MP的过程。Malet等〔12〕证明细胞内的Ca2+有增强胆囊粘膜分泌MP的作用。
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β-G可将水溶性的结合胆红素水解为非水溶性的未结合胆红素，在胆色素结石的形成中起重要作用。胆汁中的β-G可源于胆道感染的大肠杆菌所产生，也可由胆道组织细胞溶酶体的损伤、破坏释放入胆汁。 本模型胆汁细菌培养为阳性〔13〕，说明其胆汁中的β-G含量显著增高， 且β-G含量与MDA含量呈相关性，说明自由基对胆道细胞溶酶体的损伤是造成β-G增高的一个原因。Kalra等〔14〕证明由黄嘌呤氧化酶+次黄嘌呤体系产生的超氧游离基可造成细胞溶酶体β-G的外逸。
胆汁中胆红素的增多受多种因素的影响。实验B、C组胆囊胆汁中TB含量增高的原因可能与实验动物溶血，红细胞破坏过多有关〔9〕。胆汁胆红素的增高对胆色素结石的形成固然重要， 但胆红素沉淀的形成以及最终固化成结石的过程更为重要。 体外的研究证明O2-2·和OH·均可诱发胆红素聚合和聚集，并使胆红素转变成稳定的自由基。经自由基处理后的胆红素溶解度降低，颗粒增大，易于沉淀〔15〕。实验B、C组豚鼠胆囊胆汁中MDA的含量显著增高，但MDA的含量与TB的含量无相关性， 表明自由基不是通过胆红素的产生而是可能通过别的环节影响胆色素结石形成的。
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VE在体内外都具有强大的抗氧化作用。VE的抗氧化作用不仅有剂量依存关系，而且与不饱和脂肪酸的量和促化因子(如活性氧、铁等)的量有关〔16〕。我们所采用VE的剂量没有起到抗氧化的作用，看来在选择VE剂量和给药途径上还需进一步研究。
可以认为炎症等病理过程产生的自由基，通过对胆道粘膜上皮细胞和亚细胞结构的破坏和功能的扰乱，造成胆囊粘膜MP分泌增多和溶酶体酶(β-G)释放入胆汁，同时自由基还可直接诱发胆红素的聚合和聚集，形成胆红素多聚物，促其沉淀。最后在多因素的共同作用下形成胆色素结石。不过，和其它任何一种致石因素一样，自由基对胆色素结石形成的影响只是复杂的成石机制的部分解释。
参考文献
1 SolowayRDGastroenterol,1977,72:167
2 BabiorBM.NEngJMed,1978,298:659
, 百拇医药
3 LaurentB,ArdaillouR.AmJPhysiol,1986,251:F765～F776
4 齐凤菊第一军医大学学报，1986，2：152
5 中村一良最新医学，1960，15：358
6 LowryOH.JBiolChem,1951,193:265～275
7 FishmanWH.ClinChimActa,1967,15:435
8 LeeSP.AmJPathol,1982,108:1～8
9 LeeSP,ScottAJ.JPath,1980,131:117
10 HaleWB.AmJPhysiol,1987,253:G627～G630
, 百拇医药
11 LamorteWW.AmJPhysiol,1986,251:G701～G709
12 MaletPF.ClinRes,1981,29:668A
13 LeeSP,ThomsenLL.Pathology,1982,14:317
14 KalraJ.MolCellBioth,1988,84:233
15 刘湘陶生化物学杂志，1990，6(5)：437
16 LieblerDC.JBiolChem,1986,261:121、154
(收稿日期：1998-11-18)
作者简介：王俊田，男，1964年5月生，主治医师，山西省肿瘤医院，030013, 百拇医药