SRY基因序列分析8例
作者：化爱玲 郑梅玲 杜梅君 丁琰
单位：山西医科大学第一医院(030001) 化爱玲 郑梅玲 杜梅君 丁琰
关键词：PCR扩增；SRY基因；序列分析；突变
SRY基因序列分析8例
摘要 为寻找性反转及生殖器发育不良患者的病因，对8例患者在染色体核型分析的基础上，利用PCR扩增技术对患者的SRY基因进行检测和序列分析。结果：8例患者的SRY基因全部存在；DNA序列分析发现1例46，XX女性伴SRY基因存在的患者在HMG盒内有点突变，即codon112G→C。1例46，XY女性性反转综合征患者有移码突变和点突变并存。 为患者从分子基础上找到了病因，并为研究性反转及生殖器发育不良提供了科学的有价值的资料。
SRY基因是性别决定中最重要的基因，在1990年首先由Sinclair等〔1〕从人类Y染色体上分离出来， 并经Koopman等〔2〕转基因小鼠实验证实。当其有突变、缺失、易位时均可导致性反转及生殖器发育不良，我们对8例患者的SRY基因序列进行了分析，并对46，XY女性性反转及46，XX伴有SRY基因存在的原发闭经患者的发病机制进行了讨论， 从而也为患者从分子基础上寻找了病因。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例来源
8例患者全部由本科遗传咨询门诊来，其中3例因原发闭经而就诊， 5例因外生殖器发育不良而就诊。8例患者均经细胞遗传学检查，其中6例染色体核型为46，XY； 1例为46，XX；1例为46，XX/46,XY。8例患者的SRY基因检查全部存在。临床资料、染色体核型及SRY基因结果见第101页表1。
表1 8例患者的临床资料、染色体核型及SRY基因结果
例号
年龄(岁)
社会性别
临床资料
临床诊断
, 百拇医药
染色体核型
SRY基因
1
20
女
身高1.55m，乳房发育，外阴女性，阴毛正常，大小阴唇发育，前庭仅一孔，盆腔空虚，无周期性腹痛，无喉结，病人不同意开腹探查。
①原发闭经②先天性子宫缺如③先天性外生殖器畸形
46，XX
存在
2
26
, 百拇医药
女
身高1.69m，乳房未发育，外阴幼女型，阴道光畅，宫颈小，宫体3cm×3cm,两侧未触及包块，无喉结。
①原发闭经②子宫发育不良③XY女性性反转
46，XY
存在
3
24
女
身高1.67m,女性外貌，乳房发育很差，外阴幼女型，阴毛(-)，前庭正常，阴道口正常，盆内偏左触及小包块(2cm×1cm)
原发闭经
, 百拇医药
46，XY
存在
4
24
女
女性外表，乳房发育正常，女性外阴，阴道深8cm，宫体4cm×3cm，阴蒂肥大，未触及睾丸，开腹探查，切除的组织经病检证实右侧为卵睾组织，左侧为卵巢组织，病人术后还足月生育一正常女孩。
真两性畸形
46，XX/46,XY
存在
5
15
, http://www.100md.com
女
无喉结，乳房未发育，女性外阴，阴道深6cm，阴蒂肥大，右腹股沟触及包块。
假两性畸形
46，XY
存在
6
8
女
外生殖器发育异常，阴蒂肥大，两侧大阴唇内可触及包块。
假两性畸形
46，XY
存在
, 百拇医药
7
21
男
身高1.7m，无胡须及腋毛，阴茎小，右侧睾丸小，已下降，左侧睾丸未下降。
生殖器发育不良
46，XY
存在
8
15
男
阴茎小
生殖器发育不良
, 百拇医药 46，XY
存在
1.2 引物
由中国科学院微生物所合成，DNA序列为：P1∶5′-CTAAGTATCAGTGTGAAACGG-3′；P2∶5′-ACAGTCATCCCTGTACAACCTG-3′。
1.3 方法
1.3.1 按本室常规法抽提基因组DNA，按文献〔3〕进行PCR扩增， 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。
1.3.2 SRY基因序列分析：我们将PCR扩增产物及SRY引物对一同送北京朝阳医院基础医学研究中心，用美国产的DNA自动测序仪进行DNA序列分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 PCR扩增：8例患者的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示均有一条特异扩增带，表明SRY基因存在。
2.2 DNA序列分析：PCR扩增产物经DNA自动测序仪测序，结果为： 例1，46，XX女性而SRY基因存在的患者，其SRY基因在HMG盒内存在有点突变，使得第112位密码子编码的GAG(谷氨酸)→GAC(天冬氨酸)。例2为46，XY女性性反转患者，在其SRY基因序列中发现存在有移码突变，即在SRY基因第79和80位密码子之间插入了碱基A， 在157位密码子中缺失了碱基T，同时在157位密码子中还有一个点突变。例3～例8基因序列正常。
3 讨论
SRY基因位于Y染色体短臂1区1带3亚带上，它是睾丸决定因子(testisdetermining factor, TDF)的最佳候选基因，已被许多实验证实。SRY蛋白含有204个氨基酸，其中部约80个氨基酸区域即HMG盒是SRY基因编码蛋白质的唯一功能区。若HMG盒内的基因发生突变，可使SRY蛋白与核心序列为AACAAAG的DNA片段结合能力降低或丧失，从而影响SRY基因编码的蛋白质的功能。目前，HMG盒内的基因突变报道的有20余种〔4～6〕，且被认为是46，XY女性性反转综合征的病因之一。而我们做的例1为46，XX女性伴有SRY基因存在的个体，患者因原发闭经而就诊， 染色体核型分析及SRY基因检测结果：染色体核型46，XX；SRY基因存在。 进一步行序列分析发现SRY基因序列在HMG盒内也存在有点突变，即codon112GAG→GAC。此位点突变尚未见前人报道。分析该患者病因可能是因其父在减数分裂时，XP-YP进行了同源交换，使含有SRY基因的DNA片段易位到X染色体短臂上，且其SRY基因又发生了点突变。是否46，XX女性伴有SRY基因存在的个体，都存在有SRY基因的点突变，有待更多的病例证实之。例2、例3为46，XY女性性反转综合征患者， SRY基因序列分析发现例2存在有大片段的移码突变和HMG盒之外的点突变。 即在SRY基因第79位和80位密码子之间插入了碱基A，在157位密码(GTG)中缺失了碱基T。同时，在157位密码相应于881位核苷酸由G→C。分析该患者是由于存在有大片段的移码突变， 而使SRY基因编码的蛋白质功能异常，从而不能使不同部位的调控蛋白相互作用，而影响了启动46，XY细胞向男性方向分化，导致女性表现。 例3的SRY的基因序列正常也支持了SRY基因在性别决定中不是唯一基因的说法〔7〕。此外，我们的例4～例8患者，SRY基因序列均正常， 也说明他们的病因不是因SRY基因突变引起的，而是其它因素的影响。
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我们的结果表明SRY基因突变不仅与46，XY女性性反转综合征有关，而且与一些46，XX女性伴SRY基因存在的个体也有关。也为进一步探讨性反转及XX女性伴SRY基因存在的个体的发病机制提供了有价值的资料。
参考文献
1 Sinclair AH, Berta P, Palmer MS etal. JNature,1990，346:240
2 Koopman P, Gubbay J, Nigel V et al. Nature,1991,351:117
3 化爱玲，郑梅玲，丁琰.山西医药杂志，1998，27(4)：297
4 曾溢涛，任兆瑞，张美兰等科学通报，1992，22：2097
5 刘智，熊正刚，肖广惠等.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：258
6 鄢波，张思仲.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：262
7 张思仲.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：257
(收稿日期：1999-01-04)
作者简介：化爱玲，女，1961年12月生，主管技师，山西医科大学第一医院，030001, 百拇医药
单位：山西医科大学第一医院(030001) 化爱玲 郑梅玲 杜梅君 丁琰
关键词：PCR扩增；SRY基因；序列分析；突变
SRY基因序列分析8例
摘要 为寻找性反转及生殖器发育不良患者的病因，对8例患者在染色体核型分析的基础上，利用PCR扩增技术对患者的SRY基因进行检测和序列分析。结果：8例患者的SRY基因全部存在；DNA序列分析发现1例46，XX女性伴SRY基因存在的患者在HMG盒内有点突变，即codon112G→C。1例46，XY女性性反转综合征患者有移码突变和点突变并存。 为患者从分子基础上找到了病因，并为研究性反转及生殖器发育不良提供了科学的有价值的资料。
SRY基因是性别决定中最重要的基因，在1990年首先由Sinclair等〔1〕从人类Y染色体上分离出来， 并经Koopman等〔2〕转基因小鼠实验证实。当其有突变、缺失、易位时均可导致性反转及生殖器发育不良，我们对8例患者的SRY基因序列进行了分析，并对46，XY女性性反转及46，XX伴有SRY基因存在的原发闭经患者的发病机制进行了讨论， 从而也为患者从分子基础上寻找了病因。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例来源
8例患者全部由本科遗传咨询门诊来，其中3例因原发闭经而就诊， 5例因外生殖器发育不良而就诊。8例患者均经细胞遗传学检查，其中6例染色体核型为46，XY； 1例为46，XX；1例为46，XX/46,XY。8例患者的SRY基因检查全部存在。临床资料、染色体核型及SRY基因结果见第101页表1。
表1 8例患者的临床资料、染色体核型及SRY基因结果
例号
年龄(岁)
社会性别
临床资料
临床诊断
, 百拇医药
染色体核型
SRY基因
1
20
女
身高1.55m，乳房发育，外阴女性，阴毛正常，大小阴唇发育，前庭仅一孔，盆腔空虚，无周期性腹痛，无喉结，病人不同意开腹探查。
①原发闭经②先天性子宫缺如③先天性外生殖器畸形
46，XX
存在
2
26
, 百拇医药
女
身高1.69m，乳房未发育，外阴幼女型，阴道光畅，宫颈小，宫体3cm×3cm,两侧未触及包块，无喉结。
①原发闭经②子宫发育不良③XY女性性反转
46，XY
存在
3
24
女
身高1.67m,女性外貌，乳房发育很差，外阴幼女型，阴毛(-)，前庭正常，阴道口正常，盆内偏左触及小包块(2cm×1cm)
原发闭经
, 百拇医药
46，XY
存在
4
24
女
女性外表，乳房发育正常，女性外阴，阴道深8cm，宫体4cm×3cm，阴蒂肥大，未触及睾丸，开腹探查，切除的组织经病检证实右侧为卵睾组织，左侧为卵巢组织，病人术后还足月生育一正常女孩。
真两性畸形
46，XX/46,XY
存在
5
15
, http://www.100md.com
女
无喉结，乳房未发育，女性外阴，阴道深6cm，阴蒂肥大，右腹股沟触及包块。
假两性畸形
46，XY
存在
6
8
女
外生殖器发育异常，阴蒂肥大，两侧大阴唇内可触及包块。
假两性畸形
46，XY
存在
, 百拇医药
7
21
男
身高1.7m，无胡须及腋毛，阴茎小，右侧睾丸小，已下降，左侧睾丸未下降。
生殖器发育不良
46，XY
存在
8
15
男
阴茎小
生殖器发育不良
, 百拇医药 46，XY
存在
1.2 引物
由中国科学院微生物所合成，DNA序列为：P1∶5′-CTAAGTATCAGTGTGAAACGG-3′；P2∶5′-ACAGTCATCCCTGTACAACCTG-3′。
1.3 方法
1.3.1 按本室常规法抽提基因组DNA，按文献〔3〕进行PCR扩增， 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。
1.3.2 SRY基因序列分析：我们将PCR扩增产物及SRY引物对一同送北京朝阳医院基础医学研究中心，用美国产的DNA自动测序仪进行DNA序列分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 PCR扩增：8例患者的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示均有一条特异扩增带，表明SRY基因存在。
2.2 DNA序列分析：PCR扩增产物经DNA自动测序仪测序，结果为： 例1，46，XX女性而SRY基因存在的患者，其SRY基因在HMG盒内存在有点突变，使得第112位密码子编码的GAG(谷氨酸)→GAC(天冬氨酸)。例2为46，XY女性性反转患者，在其SRY基因序列中发现存在有移码突变，即在SRY基因第79和80位密码子之间插入了碱基A， 在157位密码子中缺失了碱基T，同时在157位密码子中还有一个点突变。例3～例8基因序列正常。
3 讨论
SRY基因位于Y染色体短臂1区1带3亚带上，它是睾丸决定因子(testisdetermining factor, TDF)的最佳候选基因，已被许多实验证实。SRY蛋白含有204个氨基酸，其中部约80个氨基酸区域即HMG盒是SRY基因编码蛋白质的唯一功能区。若HMG盒内的基因发生突变，可使SRY蛋白与核心序列为AACAAAG的DNA片段结合能力降低或丧失，从而影响SRY基因编码的蛋白质的功能。目前，HMG盒内的基因突变报道的有20余种〔4～6〕，且被认为是46，XY女性性反转综合征的病因之一。而我们做的例1为46，XX女性伴有SRY基因存在的个体，患者因原发闭经而就诊， 染色体核型分析及SRY基因检测结果：染色体核型46，XX；SRY基因存在。 进一步行序列分析发现SRY基因序列在HMG盒内也存在有点突变，即codon112GAG→GAC。此位点突变尚未见前人报道。分析该患者病因可能是因其父在减数分裂时，XP-YP进行了同源交换，使含有SRY基因的DNA片段易位到X染色体短臂上，且其SRY基因又发生了点突变。是否46，XX女性伴有SRY基因存在的个体，都存在有SRY基因的点突变，有待更多的病例证实之。例2、例3为46，XY女性性反转综合征患者， SRY基因序列分析发现例2存在有大片段的移码突变和HMG盒之外的点突变。 即在SRY基因第79位和80位密码子之间插入了碱基A，在157位密码(GTG)中缺失了碱基T。同时，在157位密码相应于881位核苷酸由G→C。分析该患者是由于存在有大片段的移码突变， 而使SRY基因编码的蛋白质功能异常，从而不能使不同部位的调控蛋白相互作用，而影响了启动46，XY细胞向男性方向分化，导致女性表现。 例3的SRY的基因序列正常也支持了SRY基因在性别决定中不是唯一基因的说法〔7〕。此外，我们的例4～例8患者，SRY基因序列均正常， 也说明他们的病因不是因SRY基因突变引起的，而是其它因素的影响。
, http://www.100md.com
我们的结果表明SRY基因突变不仅与46，XY女性性反转综合征有关，而且与一些46，XX女性伴SRY基因存在的个体也有关。也为进一步探讨性反转及XX女性伴SRY基因存在的个体的发病机制提供了有价值的资料。
参考文献
1 Sinclair AH, Berta P, Palmer MS etal. JNature,1990，346:240
2 Koopman P, Gubbay J, Nigel V et al. Nature,1991,351:117
3 化爱玲，郑梅玲，丁琰.山西医药杂志，1998，27(4)：297
4 曾溢涛，任兆瑞，张美兰等科学通报，1992，22：2097
5 刘智，熊正刚，肖广惠等.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：258
6 鄢波，张思仲.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：262
7 张思仲.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)：257
(收稿日期：1999-01-04)
作者简介：化爱玲，女，1961年12月生，主管技师，山西医科大学第一医院，030001, 百拇医药