丙戊酸钠对沙土鼠单侧脑缺血再灌注的保护作用
作者：张社卿 郑惠民 谢惠君
单位：中国人民解放军第二军医大学 附属长海医院 神经科，上海 200433
关键词：丙戊酸钠；脑缺血；免疫组织化学
中国新药与临床杂志000611 [摘要] 目的：观察丙戊酸钠对沙土鼠单侧脑缺血再灌注的保护作用。方法：40只雄性蒙古沙土鼠随机分为2组。左颈内动脉钳夹30 min后使血流再通，缺血开始后即以微量灌注泵自颈外静脉分别注入丙戊酸钠60 mg.kg-1(治疗组)和0.9%氯化钠注射液(对照组)，流速0.5 mL.h-1，历时2 h。术后15 h，每组随机取10只测血浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)，术后7 d，2组脑组织冠状切片以免疫组织化学染色观察海马神经元形态。结果：治疗组神经缺损记分1.5分±0.6分，对照组3.2分±0.8分；治疗组血浆NSE含量64 μg±12 μg，对照组128 μg±20 μg；海马神经元损害程度治疗组1.4分±0.8分，对照组2.9分±0.8分。t检验均有显著差异(P<0.05)。结论：静注丙戊酸钠对沙土鼠脑缺血再灌注有保护作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R971.6；R965
[文献标识码] B
[文章编号] 1007-7669(2000)06-0464-03
Protective effect of sodium valproate on unilateral cerebral ischemic reperfusion in gerbils
ZHANG She-Qing ZHENG Hui-Min XIE Hui-Jun
(Department of Neurology, Changhai Hospital, Second Military Medical University of PLA, SHANGHAI 200433, China)
, 百拇医药
[ABSTRACT] AIM: to observe the protective effect of sodium valproate on unilateral cerebral ischemia reperfusion in gerbils. METHODS: Forty male Mongolian gerbils were randomly divided into 2 groups. Left internal carotid was clipped for 30 min and then removed to recirculate. At the very beginning, sodium valproate 60 mg.kg-1 (treatment group) or 0.9% sodium chloride injection (control group) was perfused through external jugular vein for 2 h by a microperfusion pump, flow rate, 0.5 mL.h-1. Fifteen hours after operation, blood NSE was determined in 10 gerbils randomly chosen for each group. Seven days after operation, coronal brain slices of the remainder was made and hippocampal neurons examined by immunohystochemistry. RESULTS: Neurofunction deficits for treatment group were 1.5±0.6 and 3.2±0.8 for control group. Blood NSE concentrations were 64 μg±12 μg and 128 μg±20 μg for treatment group and control group, respectively. Neuronal deficits in hippocampus were 1.4±0.8 and 2.9±0.8 for treatment group and control group. T tests showed statistically significant difference (P<0.05). CONCLUSION: Intravenous injection of sodium valproate has protective effect against cerebral ischemic reperfusion in gerbils.
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[KEY WORDS] sodium valproate; cerebral ischemia； immunohystochemistry
脑缺血后迟发性神经元坏死与缺血区细胞外兴奋性毒性指数(谷氨酸浓度×甘氨酸浓度÷γ氨基丁酸浓度)有关。毒性指数高的区域，神经元坏死严重，毒性指数低的区域，神经元坏死较轻[1]。在受到反复脑缺血的沙土鼠的第三脑室内持续注入γ氨基丁酸转化酶抑制剂[γ乙酰基氨基丁酸(γ-vinyl GABA)]，可使沙土鼠很好耐受反复脑缺血的损害[2]。丙戊酸钠属GABA转化酶抑制剂[3]，能提高脑细胞外GABA浓度而被广泛用于癫痫的治疗[4]。但它对缺血性脑损害的作用，作者尚未见报道。本实验旨在观察脑缺血和再灌注期丙戊酸钠干预对神经元功能和形态的影响。
材料和方法
1 实验动物和药品 雄性蒙古沙土鼠40只，体重60～75 g,由上海生物制品研究所提供，合格证号：医动字02-21-8。丙戊酸钠(商品名德巴金，Depakine)由法国赛诺菲温萨(中国)集团出品，剂量， 每瓶400 mg，进口批准文号：X940373。
, 百拇医药
2 操作步骤 40只沙土鼠被随机分为2组：治疗组和对照组，每组20只。以2%戊巴比妥钠麻醉，左侧颈内动脉钳夹30 min后放开使血流再通。缺血开始后即以微量灌注泵自颈外静脉分别注入丙戊酸钠溶液60 mg.kg-1(治疗组)和0.9%氯化钠注射液(对照组)，流速0.5 mL.h-1，历时2 h。实验结束缝合沙土鼠颈部皮肤，置鼠于鼠笼使其自然苏醒，正常饮饲。麻醉前、脑缺血期，再灌注期测定沙土鼠呼吸、心率，并控制2组直肠温度均在37°C±0.2°C。动物苏醒后请一位不了解分组情况的医师按预先设计的方法记分：4分(偏瘫软弱，饮饲能力差)，3分(偏瘫，行为尚活泼，接近正常饮饲)，2分(轻偏瘫，反应较灵敏)，1分(单肢瘫，饮饲正常)，0分(无明显瘫痪)。
3 沙土鼠血浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量测定 术后15 h，每组随机抽取10只沙土鼠，断头取血，离心15 min，分离血浆，采用放射免疫法测定血浆NSE含量，操作步骤按药盒说明进行。
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4 脑组织NSE含量和神经元形态观察 术后7 d，将每组所剩沙土鼠心腔注射Karnofsky固定液(2%甲醛，2.5%戊二醛，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，取出脑组织浸泡于同一固定液过夜。以立体定向法在前囟前3.6 mm处行冠状脑切片，片厚7 μm，以免疫金银法染色(NSE抗体由华美公司提供)，观察海马部神经元形态。并按以下方法记分：0(无明显神经元损害)，1(神经元损害≤30%)，2(神经元损害≤50%)，3(神经元损害≤70%)，4(神经元损害>70%)[5].
5 统计学处理 2组间各相关指标比较用t检验，P<0.05被认为差异有显著意义。
结果
1 对心率与呼吸影响 实验过程中2组各项生理指标监测结果见表1，t检验无显著差异，2组间具有可比性。
2 对神经缺损记分影响 治疗组神经缺损记分为1.5分±0.6分，对照组为3.2分±0.8分,t检验差异有显著意义(P<0.05)。
, 百拇医药
3 对血浆NSE含量影响 血浆NSE含量治疗组为64 μg±12 μg，对照组为128 μg±20 μg(均n=10)，2组差异有非常显著意义(P<0.01)。
4 对海马部神经元损害程度记分影响 海马部神经元损害程度记分，治疗组1.4分±0.8分，对照组为2.9分±0.8分。t检验差异有显著意义(P<0.05)。
5 病理组织化学染色 病理切片显示：对照组海马部神经元染色呈弱阳性(图1)，治疗组则为强阳性(图2)。
表1 2组沙土鼠脑缺血前后心率、呼吸监测(n=10) 指标
对照组
治疗组
心率/次.min-1
, http://www.100md.com
麻醉前
176±12a
180±10
脑缺血期
158±14a
156±12
再灌注期
147±14a
145±16
呼吸/次.min-1
麻醉前
, http://www.100md.com 72±12a
74±10
脑缺血期
60±7a
58±6
再灌注期
62±11a
60±10
2组生理指标比较经t检验：aP>0.05。
图1 对照组脑缺血海马部神经元
, 百拇医药
NSE染色呈弱阳性(3.3×40)
讨论 从我们实验结果来看，脑缺血和再灌注期以丙戊酸钠干预可明显改善沙土鼠单侧脑缺血引起的神经功能和神经病理学损害。丙戊酸钠是γ-氨基丁酸转化酶抑制剂，可提高脑内神经细胞外GABA的含量[3]，相应降低神经细胞的兴奋性毒性指数，这可能是丙戊酸钠保护脑缺血后迟发性神经元损害的重要原因。
图2 治疗组脑缺血侧海马部神经元
NSE染色是强阳性(3.3×40)
神经元烯醇化酶(NSE)，特异定位于神经元和神经内分泌细胞，是胞浆内可溶性蛋白质，其功能与糖代谢有关。脑缺血后神经细胞膜通透性增加，血脑屏障破坏，使血清NSE增高[6，7]。从本实验来看，脑缺血和再灌注期丙戊酸钠干预可使治疗组血浆NSE含量显著低于对照组，说明神经元受到保护，这也从生化方面证实丙戊酸钠的神经保护作用。
, http://www.100md.com
最近有报道表明：联合应用谷氨酸拮抗剂和GABA拟似剂，其神经保护作用明显优于单用两者之一的，并且联合用药时，各药剂量减少，副作用明显减轻[8]。这也为γ氨基丁酸转化酶抑制剂治疗脑缺血提供了实验依据。总之，本实验在沙土鼠脑缺血模型上初步证实了丙戊酸钠对脑缺血再灌注损伤的保护作用，但未能显示剂量和疗效的关系，对此尚须进一步观察研究。
致谢 本实验得到胸外科刘延玲女士和陈和忠博士的大力支持和协助，表示深切感谢!
[参考文献]([REFERENCES])
[1] Globus MY, Busto R, Martinez E, Valdes I, Dietrich WD, Ginsberg MD. Comparative effect of transient global ischemia on extracellular levels of glutamate, glycine and GABA in vulnerable and nonvulnerable brain regions in the rats [J]. J Neurochem, 1991, 57:470-478.
, 百拇医药
[2] Shuaib A, Ijaz S, Sara Hasan S, Kalara J. Gamma-vinyl GABA prevents hippocampal and substantia nigra reticular damage in repetitive transient forebrain ischemia [J]. Brain Research, 1992, 590:13-17.
[3] 张敬军(Zhang JJ),陈 青(Chen Q)，胡冬酶(Hu DM)，陈玉社(Chen YS),孙思琴(Sun SQ).丙戊酸钠与尼莫地平治疗偏头痛的疗效比较[J].新药与临床(New Drugs Clin Rem), 1996, 15:289-290.
[4] 裴印权，库包善.抗癫痫和抗惊厥药[A].见：杨藻宸，主编.医用药理学.第3版[M].北京：人民卫生出版社，1997.264.
, 百拇医药
[5] Haseldonckx M, Van Reempts, Van de Ven M, Wouters L, Borgersm M. Protection with lubeluzole against delayed ischemic brain damage in rats [J]. Stroke, 1997, 28:428-432.
[6] Hatfield RH, Mckernan RM. CSF neuron-specific enolase as a quantitative marker of neuronal damage in a rat stroke model [J]. Brain Research, 1992; 577:249.
[7] Barone FC, Clark RK, Price WJ, et al. Neuronal specific enolase increases in cerebral and systemic circulation following focal ischemia [J]. Brain Research, 1993, 623(1):77.
[8] Lyden P D, Lonzo L. Combination therapy protects ischemic brain in rats: aglutamate antagonist plus a GABA agonist [J]. Stroke, 1994, 25:189-196.
[收稿日期] 1999-01-11 [接受日期] 1999-08-09, 百拇医药
单位：中国人民解放军第二军医大学 附属长海医院 神经科，上海 200433
关键词：丙戊酸钠；脑缺血；免疫组织化学
中国新药与临床杂志000611 [摘要] 目的：观察丙戊酸钠对沙土鼠单侧脑缺血再灌注的保护作用。方法：40只雄性蒙古沙土鼠随机分为2组。左颈内动脉钳夹30 min后使血流再通，缺血开始后即以微量灌注泵自颈外静脉分别注入丙戊酸钠60 mg.kg-1(治疗组)和0.9%氯化钠注射液(对照组)，流速0.5 mL.h-1，历时2 h。术后15 h，每组随机取10只测血浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)，术后7 d，2组脑组织冠状切片以免疫组织化学染色观察海马神经元形态。结果：治疗组神经缺损记分1.5分±0.6分，对照组3.2分±0.8分；治疗组血浆NSE含量64 μg±12 μg，对照组128 μg±20 μg；海马神经元损害程度治疗组1.4分±0.8分，对照组2.9分±0.8分。t检验均有显著差异(P<0.05)。结论：静注丙戊酸钠对沙土鼠脑缺血再灌注有保护作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R971.6；R965
[文献标识码] B
[文章编号] 1007-7669(2000)06-0464-03
Protective effect of sodium valproate on unilateral cerebral ischemic reperfusion in gerbils
ZHANG She-Qing ZHENG Hui-Min XIE Hui-Jun
(Department of Neurology, Changhai Hospital, Second Military Medical University of PLA, SHANGHAI 200433, China)
, 百拇医药
[ABSTRACT] AIM: to observe the protective effect of sodium valproate on unilateral cerebral ischemia reperfusion in gerbils. METHODS: Forty male Mongolian gerbils were randomly divided into 2 groups. Left internal carotid was clipped for 30 min and then removed to recirculate. At the very beginning, sodium valproate 60 mg.kg-1 (treatment group) or 0.9% sodium chloride injection (control group) was perfused through external jugular vein for 2 h by a microperfusion pump, flow rate, 0.5 mL.h-1. Fifteen hours after operation, blood NSE was determined in 10 gerbils randomly chosen for each group. Seven days after operation, coronal brain slices of the remainder was made and hippocampal neurons examined by immunohystochemistry. RESULTS: Neurofunction deficits for treatment group were 1.5±0.6 and 3.2±0.8 for control group. Blood NSE concentrations were 64 μg±12 μg and 128 μg±20 μg for treatment group and control group, respectively. Neuronal deficits in hippocampus were 1.4±0.8 and 2.9±0.8 for treatment group and control group. T tests showed statistically significant difference (P<0.05). CONCLUSION: Intravenous injection of sodium valproate has protective effect against cerebral ischemic reperfusion in gerbils.
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[KEY WORDS] sodium valproate; cerebral ischemia； immunohystochemistry
脑缺血后迟发性神经元坏死与缺血区细胞外兴奋性毒性指数(谷氨酸浓度×甘氨酸浓度÷γ氨基丁酸浓度)有关。毒性指数高的区域，神经元坏死严重，毒性指数低的区域，神经元坏死较轻[1]。在受到反复脑缺血的沙土鼠的第三脑室内持续注入γ氨基丁酸转化酶抑制剂[γ乙酰基氨基丁酸(γ-vinyl GABA)]，可使沙土鼠很好耐受反复脑缺血的损害[2]。丙戊酸钠属GABA转化酶抑制剂[3]，能提高脑细胞外GABA浓度而被广泛用于癫痫的治疗[4]。但它对缺血性脑损害的作用，作者尚未见报道。本实验旨在观察脑缺血和再灌注期丙戊酸钠干预对神经元功能和形态的影响。
材料和方法
1 实验动物和药品 雄性蒙古沙土鼠40只，体重60～75 g,由上海生物制品研究所提供，合格证号：医动字02-21-8。丙戊酸钠(商品名德巴金，Depakine)由法国赛诺菲温萨(中国)集团出品，剂量， 每瓶400 mg，进口批准文号：X940373。
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2 操作步骤 40只沙土鼠被随机分为2组：治疗组和对照组，每组20只。以2%戊巴比妥钠麻醉，左侧颈内动脉钳夹30 min后放开使血流再通。缺血开始后即以微量灌注泵自颈外静脉分别注入丙戊酸钠溶液60 mg.kg-1(治疗组)和0.9%氯化钠注射液(对照组)，流速0.5 mL.h-1，历时2 h。实验结束缝合沙土鼠颈部皮肤，置鼠于鼠笼使其自然苏醒，正常饮饲。麻醉前、脑缺血期，再灌注期测定沙土鼠呼吸、心率，并控制2组直肠温度均在37°C±0.2°C。动物苏醒后请一位不了解分组情况的医师按预先设计的方法记分：4分(偏瘫软弱，饮饲能力差)，3分(偏瘫，行为尚活泼，接近正常饮饲)，2分(轻偏瘫，反应较灵敏)，1分(单肢瘫，饮饲正常)，0分(无明显瘫痪)。
3 沙土鼠血浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量测定 术后15 h，每组随机抽取10只沙土鼠，断头取血，离心15 min，分离血浆，采用放射免疫法测定血浆NSE含量，操作步骤按药盒说明进行。
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4 脑组织NSE含量和神经元形态观察 术后7 d，将每组所剩沙土鼠心腔注射Karnofsky固定液(2%甲醛，2.5%戊二醛，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，取出脑组织浸泡于同一固定液过夜。以立体定向法在前囟前3.6 mm处行冠状脑切片，片厚7 μm，以免疫金银法染色(NSE抗体由华美公司提供)，观察海马部神经元形态。并按以下方法记分：0(无明显神经元损害)，1(神经元损害≤30%)，2(神经元损害≤50%)，3(神经元损害≤70%)，4(神经元损害>70%)[5].
5 统计学处理 2组间各相关指标比较用t检验，P<0.05被认为差异有显著意义。
结果
1 对心率与呼吸影响 实验过程中2组各项生理指标监测结果见表1，t检验无显著差异，2组间具有可比性。
2 对神经缺损记分影响 治疗组神经缺损记分为1.5分±0.6分，对照组为3.2分±0.8分,t检验差异有显著意义(P<0.05)。
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3 对血浆NSE含量影响 血浆NSE含量治疗组为64 μg±12 μg，对照组为128 μg±20 μg(均n=10)，2组差异有非常显著意义(P<0.01)。
4 对海马部神经元损害程度记分影响 海马部神经元损害程度记分，治疗组1.4分±0.8分，对照组为2.9分±0.8分。t检验差异有显著意义(P<0.05)。
5 病理组织化学染色 病理切片显示：对照组海马部神经元染色呈弱阳性(图1)，治疗组则为强阳性(图2)。
表1 2组沙土鼠脑缺血前后心率、呼吸监测(n=10) 指标
对照组
治疗组
心率/次.min-1
, http://www.100md.com
麻醉前
176±12a
180±10
脑缺血期
158±14a
156±12
再灌注期
147±14a
145±16
呼吸/次.min-1
麻醉前
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74±10
脑缺血期
60±7a
58±6
再灌注期
62±11a
60±10
2组生理指标比较经t检验：aP>0.05。
图1 对照组脑缺血海马部神经元
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NSE染色呈弱阳性(3.3×40)
讨论 从我们实验结果来看，脑缺血和再灌注期以丙戊酸钠干预可明显改善沙土鼠单侧脑缺血引起的神经功能和神经病理学损害。丙戊酸钠是γ-氨基丁酸转化酶抑制剂，可提高脑内神经细胞外GABA的含量[3]，相应降低神经细胞的兴奋性毒性指数，这可能是丙戊酸钠保护脑缺血后迟发性神经元损害的重要原因。
图2 治疗组脑缺血侧海马部神经元
NSE染色是强阳性(3.3×40)
神经元烯醇化酶(NSE)，特异定位于神经元和神经内分泌细胞，是胞浆内可溶性蛋白质，其功能与糖代谢有关。脑缺血后神经细胞膜通透性增加，血脑屏障破坏，使血清NSE增高[6，7]。从本实验来看，脑缺血和再灌注期丙戊酸钠干预可使治疗组血浆NSE含量显著低于对照组，说明神经元受到保护，这也从生化方面证实丙戊酸钠的神经保护作用。
, http://www.100md.com
最近有报道表明：联合应用谷氨酸拮抗剂和GABA拟似剂，其神经保护作用明显优于单用两者之一的，并且联合用药时，各药剂量减少，副作用明显减轻[8]。这也为γ氨基丁酸转化酶抑制剂治疗脑缺血提供了实验依据。总之，本实验在沙土鼠脑缺血模型上初步证实了丙戊酸钠对脑缺血再灌注损伤的保护作用，但未能显示剂量和疗效的关系，对此尚须进一步观察研究。
致谢 本实验得到胸外科刘延玲女士和陈和忠博士的大力支持和协助，表示深切感谢!
[参考文献]([REFERENCES])
[1] Globus MY, Busto R, Martinez E, Valdes I, Dietrich WD, Ginsberg MD. Comparative effect of transient global ischemia on extracellular levels of glutamate, glycine and GABA in vulnerable and nonvulnerable brain regions in the rats [J]. J Neurochem, 1991, 57:470-478.
, 百拇医药
[2] Shuaib A, Ijaz S, Sara Hasan S, Kalara J. Gamma-vinyl GABA prevents hippocampal and substantia nigra reticular damage in repetitive transient forebrain ischemia [J]. Brain Research, 1992, 590:13-17.
[3] 张敬军(Zhang JJ),陈 青(Chen Q)，胡冬酶(Hu DM)，陈玉社(Chen YS),孙思琴(Sun SQ).丙戊酸钠与尼莫地平治疗偏头痛的疗效比较[J].新药与临床(New Drugs Clin Rem), 1996, 15:289-290.
[4] 裴印权，库包善.抗癫痫和抗惊厥药[A].见：杨藻宸，主编.医用药理学.第3版[M].北京：人民卫生出版社，1997.264.
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[5] Haseldonckx M, Van Reempts, Van de Ven M, Wouters L, Borgersm M. Protection with lubeluzole against delayed ischemic brain damage in rats [J]. Stroke, 1997, 28:428-432.
[6] Hatfield RH, Mckernan RM. CSF neuron-specific enolase as a quantitative marker of neuronal damage in a rat stroke model [J]. Brain Research, 1992; 577:249.
[7] Barone FC, Clark RK, Price WJ, et al. Neuronal specific enolase increases in cerebral and systemic circulation following focal ischemia [J]. Brain Research, 1993, 623(1):77.
[8] Lyden P D, Lonzo L. Combination therapy protects ischemic brain in rats: aglutamate antagonist plus a GABA agonist [J]. Stroke, 1994, 25:189-196.
[收稿日期] 1999-01-11 [接受日期] 1999-08-09, 百拇医药