国产亚叶酸钙片、胶囊与进口亚叶酸钙片的人体相对生物利用度比较
作者：段更利 郑璐侠 陈钧 黄建明 顾丽华 梁建英 李锐 刘杰
单位：上海医科大学 药学院 药物分析教研室，上海 200032
关键词：亚叶酸钙；胶囊；片剂；高压液相色谱法；生物利用度
中国新药与临床杂志000603[摘要] 目的：研究3种亚叶酸钙制剂(国产片剂、胶囊和进口片剂)在12名健康志愿者体内的相对生物利用度。方法：同体交叉试验后，测定血浆中亚叶酸钙浓度，计算主要药物动力学参数和相对生物利用度，并进行统计学分析。结果：国产片、胶囊和进口片单剂量75 mg,po后，Tmax分别为(2.5± s 0.3) h,(2.5±0.3) h和(2.4±0.3) h；Cmax为(654±146) μg.L-1，(599±132) μg.L-1和(640±163) μg.L-1；AUC0～∞为(7811±1481) μg.h.L-1，(7091±1397) μg.h.L-1和(7898±1855) μg.h.L-1；T(1)/(2)为(8.7±0.6) h，(8.6±0.4) h和(8.6±0.5) h。国产片、胶囊相对生物利用度分别为(101±14)%，(93±11)%。结论：3种制剂生物等效。
, 百拇医药
[中图分类号] R969.1，R973.3，R979.3
[文献标识码] A
[文章编号] 1007-7669(2000)06-0441-03
Domestic calcium folinate tablets and capsules vs imported calcium folinate tablets relative bioavailability in healthy volunteers
DUAN Geng-Li ZHENG Lu-Xia CHEN Jun HUANG Jian-Ming GU Li-Hua LIANG Jian-Ying LI Rui LIU Jie
(Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Shanghai Medical University, SHANGHAI 200032, China)
, 百拇医药
[ABSTRACT] AIM: To study the pharmacokinetics and relative bioavailability of calcium folinate domestic tablets and capsules and imported tablets in 12 healthy volunteers. METHODS: According to the crossover design, each volunteer was orally given calcium folinate tablets or capsule (75 mg). The drug concentrations in plasma were determined by RP-HPLC. RESULTS: The pharmacokinetic parameters of the domestic tablets, capsules and imported tablets were as following: Tmax(2.5±0.3) h,(2.5±0.3) h and (2.4±0.3) h;Cmax(654±146) μg.L-1,(599±132) μg.L-1 and (640±163) μg.L-1; AUC0-∞(7811±1855) μg.h.L-1,(7091±1397) μg.h.L-1 and (7898±1855) μg.h.L-1;T(1)/(2)(8.7±0.6) h,(8.6±0.4) h and (8.6±0.5) h. The relative bioavailability of the domestic tablets and capsules was (101±14)% and (93±11)%. CONCLUSION: The result of statistical analysis shows that three formulations are bioequivalent.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] calcium folinate； capsules; tablets; high pressure liquid chromatography; biological availability
亚叶酸钙(calcium folinate)为抗贫血、解毒药。它不良反应小，可中和叶酸拮抗剂(如甲氨喋呤)的即时毒性反应，主要用于治疗营养不良、婴儿期、肝脏疾病及吸收障碍综合征引起的巨幼红细胞性贫血。氟尿嘧啶是治疗消化系统恶性肿瘤的常用抗癌药物[1]。亚叶酸钙与氟尿嘧啶合用治疗结、直肠癌，可加强氟尿嘧啶抗癌效果。亚叶酸钙胶囊(片剂)是正在开发的四类新药，作者未见国内文献报道，为评价亚叶酸钙国产片、胶囊与进口片在健康人体内生物等效性，本文选择12名健康男性受试者，按三交叉给药方案，用RP-HPLC法测定血浆中亚叶酸钙的浓度，对其进行相对生物利用度研究，为临床合理用药提供参考依据。
材料和方法
, 百拇医药
药品与试剂 试验片：亚叶酸钙片(浙江医药研究开发中心，批号：980826，每片15 mg)；试验胶囊；亚叶酸钙胶囊(浙江医药研究开发中心，批号：980825，每粒25 mg)；对照品：亚叶酸钙片(商品名安曲希Antrex，芬兰奥立安药厂，批号：YHA74A，每片15 mg)；亚叶酸钙对照品(含量>99%,HPLC，瑞士Fluka公司)。磷酸四丁基铵(化学纯，瑞士Fluka公司)，乙腈、甲醇为HPLC级，水为三蒸水，其他试剂为AR级。
主要仪器 法国Gilson高效液相色谱仪；Sep-Pak固相萃取柱(Classic C18, Waters公司)。
受试者 健康男性12名，年龄(21.5± s 0.8) a，身高(175±6) cm，体重(67±9) kg。经病史询问，并经肝、肾功能，血、尿常规和心电图检查证实为健康者。试验前2 wk开始至试验结束，禁服任何其他药物，试验期间禁烟、酒、茶。
, 百拇医药
血样预处理 在活化后的Sep-pak固相萃取柱上，加入100 μl内标水溶液(对氨基苯乙酮1.5 mg.L-1)，0.5 mL血浆与0.5 mL磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH5.0)混匀，缓缓流过Sep-pak柱后，用4 mL磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH5.0)过柱洗去杂质，尽量使柱中的水流干，用5 mL甲醇洗脱柱上药物，收集洗脱液，在60°C氮气流下挥干。残渣用流动相100 μL溶解，进样40 μL，作HPLC分析。
测定方法 采用Lichrosorb C-18色谱柱(4.6×150 mm,5 μm)，柱温为常温，流动相为乙腈∶磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH 5.0,含10 mmol.L-1磷酸四丁基铵)=15∶85(v/v)，流速1.0 mL.min-1，检测波长290 nm。
, http://www.100md.com 标准曲线制备 取空白血浆0.5 mL，精密加入一定量亚叶酸钙标准液，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为50，100，200，400，800，1200，2000 μg.L-1，照“血样预处理”项下操作，作HPLC分析。以亚叶酸钙与内标物的峰高比(Y)对亚叶酸钙的血浆浓度(C)线性回归，得回归方程为：
Y=0.001351C+0.08536(r=0.9993,n=7)
本法测定的线性范围为50～2000 μg.L-1。
方法回收率 取空白血浆每份0.5 mL，照“标准曲线制备”项下制备标准血样，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为200，800，1400 μg.L-1，每一浓度配制5份样品。结果：方法的平均回收率为(99.6±1.0)%。
方法精密度 取空白血浆每份0.5 mL，照“标准曲线制备”项下制备标准血样，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为200，800，1400 μg.L-1，测定日内、日间精密度。结果：日内RSD(n=5)分别为6.05%，3.22%，2.80%；日间RSD(n=5)分别为5.28%，3.26%，2.44%。
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方法灵敏度 信噪比为3时，亚叶酸钙的最低检测浓度为40 μg.L-1血浆，标准品的检测限为15 ng。
方法专一性 在所建立的HPLC条件下，亚叶酸钙(主药)约5.2 min，对氨基苯乙酮(内标)约6.5 min。血浆中的内源性杂质及亚叶酸钙的代谢产物5-甲基四氢叶酸均不干扰亚叶酸钙及内标物的色谱峰。
给药方案和血样采集 采用随机交叉试验方法进行试验设计，12名受试者随机分成3组，空腹po给国产片、胶囊或进口片75 mg(片剂为15 mg×5片，胶囊为25 mg×3粒)，1，2 wk后进行同体交叉给药。受试者给药前1 d晚餐后开始禁食，清晨用200 mL温开水送服，给药2 h后进标准餐，中午、晚上均给低脂肪标准餐。整个试验在富有经验的临床医师监护下进行。血样采集前，埋置肝素留置针头，服药前取空白血，并分别在给药后0.5，1，1.5，2，2.5，3，5，7，9，12，24 h取肘静脉血3.5 mL，收集于加有肝素钠的离心管内，500×g离心10 min后分离得血浆，-20°C避光保存至测定。
, http://www.100md.com
数据处理 受试者服药后Tmax,Cmax为实测数据，AUC0-T，MRT0-T，AUC0-∞，T(1)/(2)均为统计矩法求得。用试验片、试验胶囊和对照片的AUC0-T值，分别计算其相对生物利用度。用SAS软件进行方差分析，并用双单侧t检验进行生物等效性的判定。
结果
12名受试者po国产片、胶囊和进口片后的平均药时数据见表1，其药时曲线见图1，主要药物动力学参数见表2。
图1 亚叶酸钙国产片、胶囊和进口片平均血药
浓度-时间曲线
, http://www.100md.com
表1 受试者po亚叶酸钙片、胶囊后的平均血药
浓度-时间数据(n=12, x±s,μg.L-1) 取血时间/h
进口片
国产片
国产胶囊
0.5
245±
90
214±
59
168±
58
, 百拇医药
1.0
414±
106
381±
123
344±
104
1.5
507±
118
493±
108
441±
, http://www.100md.com
146
2.0
580±
136
586±
147
557±
154
2.5
612±
177
630±
142
, 百拇医药
600±
156
3.0
544±
150
560±
115
540±
115
5.0
458±
114
454±
, 百拇医药
91
436±
94
7.0
381±
98
364±
74
352±
74
9.0
316±
83
, 百拇医药
300±
62
290±
66
12.0
246±
73
246±
53
221±
49
24.0
93±
, http://www.100md.com
26
92±
21
86±
20
表2 受试者po亚叶酸钙片、胶囊后的主要药物动力学
参数(n=12) 参数
进口片
国产片
国产胶囊
Tmax/h
2.4±
, 百拇医药
0.3
2.5±
0.3
2.4±
0.3
Cmax/μg.L-1
640±
163
654±
146
599±
132
, 百拇医药 T(1)/(2)/h
8.6±
0.5
8.7±
0.6
8.6±
0.4
AUC0-T/h.μg.L-1
6740±
1717
6655±
1257
, 百拇医药
6052±
1222
AUC0-∞/h.μg.L-1
7898±
1855
7811±
1481
7091±
1397
MRT0-T/h
6.12±
0.19
, http://www.100md.com
6.10±
0.19
6.16±
0.21
F/%
101±
14
93±
11
国产片、胶囊和进口片的上述药物动力学参数经交叉试验方差分析显示差异无显著意义(P>0.05)。AUC0-T和Cmax经双单侧t检验显示三者为生物等效，国产片平均相对生物利用度为(101±14)%(n=12,以AUC0-T计算)，国产胶囊平均相对生物利用度为(93±11)%(n=12，以AUC0-T计算)。
, 百拇医药
讨论
亚叶酸钙水溶性很大，曾经尝试将血样用乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂提取均失败。改用固相萃取[2-3]后，虽然操作繁琐耗时，但回收率较高，重现性好，可获得较为满意的结果。
亚叶酸钙性质不甚稳定，对照品及血样需避光低温保存，1 mo内未发生降解。操作过程也应尽量避光。
本研究建立的血浆中亚叶酸钙含量测定方法具有快速、灵敏和准确等特点，为研究亚叶酸钙的生物利用度奠定了基础。
试验结果经统计学检验表明国产亚叶酸钙片、胶囊与进口片的主要药物动力学参数无明显差异，其数值与国外文献[4]报道较为一致。Cmax和AUC数据以双单侧t检验进行生物等效性判定，确认国产片、胶囊与进口片相比为生物等效。
, 百拇医药 [参考文献]([REFERENCES])
[1] 陆继珍(Lu JZ)，杨秉辉(Yang BH)，余业勤(Yu YQ)，汤剑猷(Tang JY). 氟尿苷和氟尿嘧啶动脉内输注治疗原发性肝癌的比较[J].新药与临床(New Drugs Clin Rem),1998, 7:357-359.
[2] Belz S, Frickel C, Wolfrom C, Nau H, Henze G. High-performance liquid chromatographic determination of methotrexate, 7-hydroxymethotrexate, 5-methyltetrahydrofolic acid and folinic acid in serum and cerebrospinal fluid [J]. J Chromatogr B, 1994, 661:109-118.
, 百拇医药
[3] Wolfrom C, Hepp R, Hartmann R, Breithaupt H, Henze G. Pharmacokinetic study of methotrexate, folinic acid and their serum metabolites in children treated with high-dose methotrexate and leucovorin rescue [J]. Eur J Clin Pharmaco, 1990, 139:377-383.
[4] Schilsky RL, Ratain MJ. Clinical Pharmacokinetics of high-dose leucovorin calcium after intravenous and oral administration [J]. J Natl Cancer Inst, 1990, 82:1411-1415.
[收稿日期] 1999-08-02 [接受日期] 1999-11-17, 百拇医药
单位：上海医科大学 药学院 药物分析教研室，上海 200032
关键词：亚叶酸钙；胶囊；片剂；高压液相色谱法；生物利用度
中国新药与临床杂志000603[摘要] 目的：研究3种亚叶酸钙制剂(国产片剂、胶囊和进口片剂)在12名健康志愿者体内的相对生物利用度。方法：同体交叉试验后，测定血浆中亚叶酸钙浓度，计算主要药物动力学参数和相对生物利用度，并进行统计学分析。结果：国产片、胶囊和进口片单剂量75 mg,po后，Tmax分别为(2.5± s 0.3) h,(2.5±0.3) h和(2.4±0.3) h；Cmax为(654±146) μg.L-1，(599±132) μg.L-1和(640±163) μg.L-1；AUC0～∞为(7811±1481) μg.h.L-1，(7091±1397) μg.h.L-1和(7898±1855) μg.h.L-1；T(1)/(2)为(8.7±0.6) h，(8.6±0.4) h和(8.6±0.5) h。国产片、胶囊相对生物利用度分别为(101±14)%，(93±11)%。结论：3种制剂生物等效。
, 百拇医药
[中图分类号] R969.1，R973.3，R979.3
[文献标识码] A
[文章编号] 1007-7669(2000)06-0441-03
Domestic calcium folinate tablets and capsules vs imported calcium folinate tablets relative bioavailability in healthy volunteers
DUAN Geng-Li ZHENG Lu-Xia CHEN Jun HUANG Jian-Ming GU Li-Hua LIANG Jian-Ying LI Rui LIU Jie
(Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Shanghai Medical University, SHANGHAI 200032, China)
, 百拇医药
[ABSTRACT] AIM: To study the pharmacokinetics and relative bioavailability of calcium folinate domestic tablets and capsules and imported tablets in 12 healthy volunteers. METHODS: According to the crossover design, each volunteer was orally given calcium folinate tablets or capsule (75 mg). The drug concentrations in plasma were determined by RP-HPLC. RESULTS: The pharmacokinetic parameters of the domestic tablets, capsules and imported tablets were as following: Tmax(2.5±0.3) h,(2.5±0.3) h and (2.4±0.3) h;Cmax(654±146) μg.L-1,(599±132) μg.L-1 and (640±163) μg.L-1; AUC0-∞(7811±1855) μg.h.L-1,(7091±1397) μg.h.L-1 and (7898±1855) μg.h.L-1;T(1)/(2)(8.7±0.6) h,(8.6±0.4) h and (8.6±0.5) h. The relative bioavailability of the domestic tablets and capsules was (101±14)% and (93±11)%. CONCLUSION: The result of statistical analysis shows that three formulations are bioequivalent.
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[KEY WORDS] calcium folinate； capsules; tablets; high pressure liquid chromatography; biological availability
亚叶酸钙(calcium folinate)为抗贫血、解毒药。它不良反应小，可中和叶酸拮抗剂(如甲氨喋呤)的即时毒性反应，主要用于治疗营养不良、婴儿期、肝脏疾病及吸收障碍综合征引起的巨幼红细胞性贫血。氟尿嘧啶是治疗消化系统恶性肿瘤的常用抗癌药物[1]。亚叶酸钙与氟尿嘧啶合用治疗结、直肠癌，可加强氟尿嘧啶抗癌效果。亚叶酸钙胶囊(片剂)是正在开发的四类新药，作者未见国内文献报道，为评价亚叶酸钙国产片、胶囊与进口片在健康人体内生物等效性，本文选择12名健康男性受试者，按三交叉给药方案，用RP-HPLC法测定血浆中亚叶酸钙的浓度，对其进行相对生物利用度研究，为临床合理用药提供参考依据。
材料和方法
, 百拇医药
药品与试剂 试验片：亚叶酸钙片(浙江医药研究开发中心，批号：980826，每片15 mg)；试验胶囊；亚叶酸钙胶囊(浙江医药研究开发中心，批号：980825，每粒25 mg)；对照品：亚叶酸钙片(商品名安曲希Antrex，芬兰奥立安药厂，批号：YHA74A，每片15 mg)；亚叶酸钙对照品(含量>99%,HPLC，瑞士Fluka公司)。磷酸四丁基铵(化学纯，瑞士Fluka公司)，乙腈、甲醇为HPLC级，水为三蒸水，其他试剂为AR级。
主要仪器 法国Gilson高效液相色谱仪；Sep-Pak固相萃取柱(Classic C18, Waters公司)。
受试者 健康男性12名，年龄(21.5± s 0.8) a，身高(175±6) cm，体重(67±9) kg。经病史询问，并经肝、肾功能，血、尿常规和心电图检查证实为健康者。试验前2 wk开始至试验结束，禁服任何其他药物，试验期间禁烟、酒、茶。
, 百拇医药
血样预处理 在活化后的Sep-pak固相萃取柱上，加入100 μl内标水溶液(对氨基苯乙酮1.5 mg.L-1)，0.5 mL血浆与0.5 mL磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH5.0)混匀，缓缓流过Sep-pak柱后，用4 mL磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH5.0)过柱洗去杂质，尽量使柱中的水流干，用5 mL甲醇洗脱柱上药物，收集洗脱液，在60°C氮气流下挥干。残渣用流动相100 μL溶解，进样40 μL，作HPLC分析。
测定方法 采用Lichrosorb C-18色谱柱(4.6×150 mm,5 μm)，柱温为常温，流动相为乙腈∶磷酸盐缓冲液(10 mmol.L-1,pH 5.0,含10 mmol.L-1磷酸四丁基铵)=15∶85(v/v)，流速1.0 mL.min-1，检测波长290 nm。
, http://www.100md.com 标准曲线制备 取空白血浆0.5 mL，精密加入一定量亚叶酸钙标准液，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为50，100，200，400，800，1200，2000 μg.L-1，照“血样预处理”项下操作，作HPLC分析。以亚叶酸钙与内标物的峰高比(Y)对亚叶酸钙的血浆浓度(C)线性回归，得回归方程为：
Y=0.001351C+0.08536(r=0.9993,n=7)
本法测定的线性范围为50～2000 μg.L-1。
方法回收率 取空白血浆每份0.5 mL，照“标准曲线制备”项下制备标准血样，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为200，800，1400 μg.L-1，每一浓度配制5份样品。结果：方法的平均回收率为(99.6±1.0)%。
方法精密度 取空白血浆每份0.5 mL，照“标准曲线制备”项下制备标准血样，使血浆中亚叶酸钙的浓度分别为200，800，1400 μg.L-1，测定日内、日间精密度。结果：日内RSD(n=5)分别为6.05%，3.22%，2.80%；日间RSD(n=5)分别为5.28%，3.26%，2.44%。
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方法灵敏度 信噪比为3时，亚叶酸钙的最低检测浓度为40 μg.L-1血浆，标准品的检测限为15 ng。
方法专一性 在所建立的HPLC条件下，亚叶酸钙(主药)约5.2 min，对氨基苯乙酮(内标)约6.5 min。血浆中的内源性杂质及亚叶酸钙的代谢产物5-甲基四氢叶酸均不干扰亚叶酸钙及内标物的色谱峰。
给药方案和血样采集 采用随机交叉试验方法进行试验设计，12名受试者随机分成3组，空腹po给国产片、胶囊或进口片75 mg(片剂为15 mg×5片，胶囊为25 mg×3粒)，1，2 wk后进行同体交叉给药。受试者给药前1 d晚餐后开始禁食，清晨用200 mL温开水送服，给药2 h后进标准餐，中午、晚上均给低脂肪标准餐。整个试验在富有经验的临床医师监护下进行。血样采集前，埋置肝素留置针头，服药前取空白血，并分别在给药后0.5，1，1.5，2，2.5，3，5，7，9，12，24 h取肘静脉血3.5 mL，收集于加有肝素钠的离心管内，500×g离心10 min后分离得血浆，-20°C避光保存至测定。
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数据处理 受试者服药后Tmax,Cmax为实测数据，AUC0-T，MRT0-T，AUC0-∞，T(1)/(2)均为统计矩法求得。用试验片、试验胶囊和对照片的AUC0-T值，分别计算其相对生物利用度。用SAS软件进行方差分析，并用双单侧t检验进行生物等效性的判定。
结果
12名受试者po国产片、胶囊和进口片后的平均药时数据见表1，其药时曲线见图1，主要药物动力学参数见表2。
图1 亚叶酸钙国产片、胶囊和进口片平均血药
浓度-时间曲线
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表1 受试者po亚叶酸钙片、胶囊后的平均血药
浓度-时间数据(n=12, x±s,μg.L-1) 取血时间/h
进口片
国产片
国产胶囊
0.5
245±
90
214±
59
168±
58
, 百拇医药
1.0
414±
106
381±
123
344±
104
1.5
507±
118
493±
108
441±
, http://www.100md.com
146
2.0
580±
136
586±
147
557±
154
2.5
612±
177
630±
142
, 百拇医药
600±
156
3.0
544±
150
560±
115
540±
115
5.0
458±
114
454±
, 百拇医药
91
436±
94
7.0
381±
98
364±
74
352±
74
9.0
316±
83
, 百拇医药
300±
62
290±
66
12.0
246±
73
246±
53
221±
49
24.0
93±
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26
92±
21
86±
20
表2 受试者po亚叶酸钙片、胶囊后的主要药物动力学
参数(n=12) 参数
进口片
国产片
国产胶囊
Tmax/h
2.4±
, 百拇医药
0.3
2.5±
0.3
2.4±
0.3
Cmax/μg.L-1
640±
163
654±
146
599±
132
, 百拇医药 T(1)/(2)/h
8.6±
0.5
8.7±
0.6
8.6±
0.4
AUC0-T/h.μg.L-1
6740±
1717
6655±
1257
, 百拇医药
6052±
1222
AUC0-∞/h.μg.L-1
7898±
1855
7811±
1481
7091±
1397
MRT0-T/h
6.12±
0.19
, http://www.100md.com
6.10±
0.19
6.16±
0.21
F/%
101±
14
93±
11
国产片、胶囊和进口片的上述药物动力学参数经交叉试验方差分析显示差异无显著意义(P>0.05)。AUC0-T和Cmax经双单侧t检验显示三者为生物等效，国产片平均相对生物利用度为(101±14)%(n=12,以AUC0-T计算)，国产胶囊平均相对生物利用度为(93±11)%(n=12，以AUC0-T计算)。
, 百拇医药
讨论
亚叶酸钙水溶性很大，曾经尝试将血样用乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂提取均失败。改用固相萃取[2-3]后，虽然操作繁琐耗时，但回收率较高，重现性好，可获得较为满意的结果。
亚叶酸钙性质不甚稳定，对照品及血样需避光低温保存，1 mo内未发生降解。操作过程也应尽量避光。
本研究建立的血浆中亚叶酸钙含量测定方法具有快速、灵敏和准确等特点，为研究亚叶酸钙的生物利用度奠定了基础。
试验结果经统计学检验表明国产亚叶酸钙片、胶囊与进口片的主要药物动力学参数无明显差异，其数值与国外文献[4]报道较为一致。Cmax和AUC数据以双单侧t检验进行生物等效性判定，确认国产片、胶囊与进口片相比为生物等效。
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, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-08-02 [接受日期] 1999-11-17, 百拇医药