p16基因对脑胶质瘤细胞作用的实验研究
作者：陈一招 徐如祥 邹琳
单位：陈一招 徐如祥 邹琳(第一军医大学珠江医院神经外科 广州 510282)
关键词：神经胶质瘤；基因，p16；转染
肿瘤000405 摘要：目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因在脑胶质瘤临床诊断、治疗中的应用前景。方法 采用脂质体转染的方法，将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，免疫组化检测p16基因表达，用MTT法测定瘤细胞生长曲线及对转染的瘤细胞在裸鼠体内形成瘤块的变化进行分析。结果 转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，瘤细胞在裸鼠中形成瘤块体积显著降低。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖。
中图分类号：R73-362；R739.41 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0252-03
, 百拇医药
EXPERIMENTAL RESEARCH ON THE EFFECTS OF p16 GENE IN HUMAN GLIOMA CELL LINES
CHEN Yi-zhao
(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
XU Ru-xiang
(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
ZOU Lin.
, 百拇医药
(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
Abstract：Objective To determine the effects of p16 gene on human glioma cell lines. Methods p16 gene was transfected into U251 and C6 glioma cell lines by lipofectin. Integration and expression of exogenous p16 gene were detected. MTT colorimetric assay was used to measure cell growth. Tumor mass formation of glioma cells was observed in nude mice. Results Expression of p16 gene was demonstrated by immunohistochemistry. The growth rate of both p16 gene transfected U251 and C6 reduced. Tumor mass formation of tumor cells in nude mice was inhibited by transfected p16 gene. Conclusion The expression of p16 gene can inhibit the growth of glioma and tumor formation in nude mice.
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Key words： Glioma; Gene， p16; Transfection
p16基因(MTS1，CDK4I，CDKN2)是近年发现的一个新的抑癌基因，是细胞周期调控基因家族中的重要成员，其主要作用机制是直接抑制细胞周期。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达82 %[1]，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高未来脑胶质瘤诊断治疗水平具有重要意义。本文通过将野生型p16基因转染于人胶质瘤细胞系U251及C6细胞系，以探讨p16基因对胶质瘤细胞的作用。
材料和方法
一、细胞 人U251及C6胶质瘤细胞系均为本实验室常规保存。
二、质粒 含野生型p16基因的质粒pCDNA3-neo-p16由日本香川医科大学脑神经外科惠赠。
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三、基因转染 采用lipofectin脂质体转染的方法，将pCDNA3-neo-p16或pCDNA3(为对照)导入U251，C6细胞系。
四、免疫组织化学 采用ABC法。鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。荧光标记的羊抗鼠二抗为Kirkegaard & Perry Laboratories LNC产品。
五、细胞生长曲线的测定 参考郝新保等[2]的方法，绘制U251、C6、U251-pCDNA3、C6-pCDNA3、U251-p16及C6-p16细胞系的细胞生长曲线。
六、流式细胞仪细胞周期分析及p16基因高表达克隆的筛选 按Nicoletti I的方法[3]，常规消化各细胞系后，400目过滤，200 g离心后将细胞重悬于PI染液中(PI 50 μg/ml，0.1%柠檬酸钠，0.1% Triton X-100)，避光4 ℃过夜后上机检测。p16基因高表达克隆的筛选按参考文献[4]的方法进行。
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七、裸鼠皮下移植实验 将107细胞/0.1 ml胰酶消化的经G418筛选后U251-pCDNA3细胞(p16阴性细胞)与稳定转染p16基因的U251-p16细胞(p16阳性细胞)分别接种于4只BALB/c-nu裸鼠右后肢臀部皮下(U251-pCDNA3)与左后肢臀部皮下(U251-p16)，定时测量瘤体最大径，观察3周，绘制生长曲线。
八、统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析。两均数间的比较采用t检验。
结果
一、胶质瘤细胞系C6、U251转染后克隆的筛选和鉴定结果 经500 μg/ml G418筛选7天后，大部分细胞死亡。14天后，对照组(U251-pCDNA3、C6-pCDNA3)开始出现克隆，26天后，转染组(U251-p16、C6-p16)才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空pCDNA3质粒转染组。5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，经流式细胞仪检测筛选高表达克隆。免疫组化结果显示，U251-p16、C6-p16细胞p16基因表达强阳性(见封三图2B)，对照组p16基因表达阴性或弱阳性(见封三图2A)。
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图2 U251细胞稳定转染筛选后的免疫组化(DAB湿色,苏木素受染)
A.转染pCDNA3空质粒的U251对照细胞
B.转染p16基因和U251-p16细胞
二、转染细胞的生长曲线 图1A、B分别显示U251-p16和C6-p16与C6、U251亲代及U251-pCDNA3、C6-pCDNA3相比，生长速度明显减慢。
图1A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
1B 野生型p16基因表达对胶质瘤细胞系C6的影响
三、细胞周期分析 图2示，p16基因转染的胶质瘤细胞系与对照组相比，二倍体峰后细胞及四倍体峰细胞明显减少。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01，见表1)。
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图2 p16基因转染后流式细胞仪结果的比较(PI染色)
A：U251细胞 B：U251-p16细胞
表1 基因转染后胶质瘤细胞周期的分布
(t检验，n=10，P<0.05) 细胞系
G1%
G2%
S%
U251
69.8±3.1
12.3±2.9
19.9±2.2
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U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
C6
66.3±3.8
10.1±2.5
23.6±4.7
C6-p16
77.1±4.0
3.1±1.5
19.8±2.7
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四、裸鼠皮下移植U251-p16，U251-pCDNA3形成瘤块的结果 移植4天后，裸鼠后肢两侧均出现肉眼可见的瘤块，但以后左侧(接种U251-p16细胞)的瘤块增大速度明显较慢，至第21天，仅7 mm；而对照侧生长速度较快，已达28 mm(见图3)。
图3 BALB/c-nu裸鼠致瘤性分析
讨论
目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)——细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体，从而达到对细胞由G1期到S期的调控，当细胞由于某种原因p16基因缺失或失活，cyclin D-CDK复合体持续高活性的存在于细胞内，进而导致Rb蛋白的磷酸化，并释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期不受控特性[6]。本实验将p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，结果两者的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，裸鼠移植瘤块体积显著降低，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可导致细胞的恶性增殖[7，8]。
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本实验表明，p16基因能抑制胶质瘤细胞的生长，为进一步深入研究p16基因的临床治疗提供了实验依据。
作者简介：陈一招，男，硕士，医师。
参考文献
[1]Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types〔J〕. Science,1994,15:265(5157):436
[2]郝新保，张利朝，殷缨.MTT法测定细胞生长曲线〔J〕.第四军医大学学报.1997，18(4)：190
[3]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry〔J〕. J Immunological Methods, 1991,139:271
, 百拇医药
[4]汪谦，朱晓峰，赵西龙.现代医学实验方法.第1版.1997：887
[5]Walker DG, Duan W, Popovoic EA. Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytoma 〔J〕. Cancer Res,1995,55:20
[6]Peter B. Dirksk JT, Rutka. Current concepts in neuro-oncology. The cell cycle-A review〔J〕. Neurosurgery,1997,40:1000
[7]Hama S, Sadatomo T, Yoshioka H. Transformation of human glioma cell lines with the p16 gene inhibits cell proliferation〔J〕. Anticancer Res,1997,17(3C):1933
[8]Ikeda H, Yoshida J, Yamada H. Retroviral introduction of the p16 gene into murine cell lines to elicit marked antiproliferative effects〔J〕. Jpn J Cancer Res,1997,88(8):712
(收稿日期：1999-06-30；修回日期：2000-04-14), http://www.100md.com
单位：陈一招 徐如祥 邹琳(第一军医大学珠江医院神经外科 广州 510282)
关键词：神经胶质瘤；基因，p16；转染
肿瘤000405 摘要：目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因在脑胶质瘤临床诊断、治疗中的应用前景。方法 采用脂质体转染的方法，将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，免疫组化检测p16基因表达，用MTT法测定瘤细胞生长曲线及对转染的瘤细胞在裸鼠体内形成瘤块的变化进行分析。结果 转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，瘤细胞在裸鼠中形成瘤块体积显著降低。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖。
中图分类号：R73-362；R739.41 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0252-03
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EXPERIMENTAL RESEARCH ON THE EFFECTS OF p16 GENE IN HUMAN GLIOMA CELL LINES
CHEN Yi-zhao
(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
XU Ru-xiang
(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
ZOU Lin.
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(Neurosurgery Department, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Huangzhou,510282 China)
Abstract：Objective To determine the effects of p16 gene on human glioma cell lines. Methods p16 gene was transfected into U251 and C6 glioma cell lines by lipofectin. Integration and expression of exogenous p16 gene were detected. MTT colorimetric assay was used to measure cell growth. Tumor mass formation of glioma cells was observed in nude mice. Results Expression of p16 gene was demonstrated by immunohistochemistry. The growth rate of both p16 gene transfected U251 and C6 reduced. Tumor mass formation of tumor cells in nude mice was inhibited by transfected p16 gene. Conclusion The expression of p16 gene can inhibit the growth of glioma and tumor formation in nude mice.
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Key words： Glioma; Gene， p16; Transfection
p16基因(MTS1，CDK4I，CDKN2)是近年发现的一个新的抑癌基因，是细胞周期调控基因家族中的重要成员，其主要作用机制是直接抑制细胞周期。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达82 %[1]，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高未来脑胶质瘤诊断治疗水平具有重要意义。本文通过将野生型p16基因转染于人胶质瘤细胞系U251及C6细胞系，以探讨p16基因对胶质瘤细胞的作用。
材料和方法
一、细胞 人U251及C6胶质瘤细胞系均为本实验室常规保存。
二、质粒 含野生型p16基因的质粒pCDNA3-neo-p16由日本香川医科大学脑神经外科惠赠。
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三、基因转染 采用lipofectin脂质体转染的方法，将pCDNA3-neo-p16或pCDNA3(为对照)导入U251，C6细胞系。
四、免疫组织化学 采用ABC法。鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。荧光标记的羊抗鼠二抗为Kirkegaard & Perry Laboratories LNC产品。
五、细胞生长曲线的测定 参考郝新保等[2]的方法，绘制U251、C6、U251-pCDNA3、C6-pCDNA3、U251-p16及C6-p16细胞系的细胞生长曲线。
六、流式细胞仪细胞周期分析及p16基因高表达克隆的筛选 按Nicoletti I的方法[3]，常规消化各细胞系后，400目过滤，200 g离心后将细胞重悬于PI染液中(PI 50 μg/ml，0.1%柠檬酸钠，0.1% Triton X-100)，避光4 ℃过夜后上机检测。p16基因高表达克隆的筛选按参考文献[4]的方法进行。
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七、裸鼠皮下移植实验 将107细胞/0.1 ml胰酶消化的经G418筛选后U251-pCDNA3细胞(p16阴性细胞)与稳定转染p16基因的U251-p16细胞(p16阳性细胞)分别接种于4只BALB/c-nu裸鼠右后肢臀部皮下(U251-pCDNA3)与左后肢臀部皮下(U251-p16)，定时测量瘤体最大径，观察3周，绘制生长曲线。
八、统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析。两均数间的比较采用t检验。
结果
一、胶质瘤细胞系C6、U251转染后克隆的筛选和鉴定结果 经500 μg/ml G418筛选7天后，大部分细胞死亡。14天后，对照组(U251-pCDNA3、C6-pCDNA3)开始出现克隆，26天后，转染组(U251-p16、C6-p16)才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空pCDNA3质粒转染组。5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，经流式细胞仪检测筛选高表达克隆。免疫组化结果显示，U251-p16、C6-p16细胞p16基因表达强阳性(见封三图2B)，对照组p16基因表达阴性或弱阳性(见封三图2A)。
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图2 U251细胞稳定转染筛选后的免疫组化(DAB湿色,苏木素受染)
A.转染pCDNA3空质粒的U251对照细胞
B.转染p16基因和U251-p16细胞
二、转染细胞的生长曲线 图1A、B分别显示U251-p16和C6-p16与C6、U251亲代及U251-pCDNA3、C6-pCDNA3相比，生长速度明显减慢。
图1A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
1B 野生型p16基因表达对胶质瘤细胞系C6的影响
三、细胞周期分析 图2示，p16基因转染的胶质瘤细胞系与对照组相比，二倍体峰后细胞及四倍体峰细胞明显减少。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01，见表1)。
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图2 p16基因转染后流式细胞仪结果的比较(PI染色)
A：U251细胞 B：U251-p16细胞
表1 基因转染后胶质瘤细胞周期的分布
(t检验，n=10，P<0.05) 细胞系
G1%
G2%
S%
U251
69.8±3.1
12.3±2.9
19.9±2.2
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U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
C6
66.3±3.8
10.1±2.5
23.6±4.7
C6-p16
77.1±4.0
3.1±1.5
19.8±2.7
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四、裸鼠皮下移植U251-p16，U251-pCDNA3形成瘤块的结果 移植4天后，裸鼠后肢两侧均出现肉眼可见的瘤块，但以后左侧(接种U251-p16细胞)的瘤块增大速度明显较慢，至第21天，仅7 mm；而对照侧生长速度较快，已达28 mm(见图3)。
图3 BALB/c-nu裸鼠致瘤性分析
讨论
目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)——细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体，从而达到对细胞由G1期到S期的调控，当细胞由于某种原因p16基因缺失或失活，cyclin D-CDK复合体持续高活性的存在于细胞内，进而导致Rb蛋白的磷酸化，并释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期不受控特性[6]。本实验将p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，结果两者的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，裸鼠移植瘤块体积显著降低，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可导致细胞的恶性增殖[7，8]。
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本实验表明，p16基因能抑制胶质瘤细胞的生长，为进一步深入研究p16基因的临床治疗提供了实验依据。
作者简介：陈一招，男，硕士，医师。
参考文献
[1]Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types〔J〕. Science,1994,15:265(5157):436
[2]郝新保，张利朝，殷缨.MTT法测定细胞生长曲线〔J〕.第四军医大学学报.1997，18(4)：190
[3]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry〔J〕. J Immunological Methods, 1991,139:271
, 百拇医药
[4]汪谦，朱晓峰，赵西龙.现代医学实验方法.第1版.1997：887
[5]Walker DG, Duan W, Popovoic EA. Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytoma 〔J〕. Cancer Res,1995,55:20
[6]Peter B. Dirksk JT, Rutka. Current concepts in neuro-oncology. The cell cycle-A review〔J〕. Neurosurgery,1997,40:1000
[7]Hama S, Sadatomo T, Yoshioka H. Transformation of human glioma cell lines with the p16 gene inhibits cell proliferation〔J〕. Anticancer Res,1997,17(3C):1933
[8]Ikeda H, Yoshida J, Yamada H. Retroviral introduction of the p16 gene into murine cell lines to elicit marked antiproliferative effects〔J〕. Jpn J Cancer Res,1997,88(8):712
(收稿日期：1999-06-30；修回日期：2000-04-14), http://www.100md.com