N-糖基化抑制反应诱导胶质瘤细胞的早期凋亡
作者：张健 张宗城 李鹏 张积仁
单位：张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；李鹏(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)
关键词：N-糖基化；神经胶质瘤；凋亡
第一军医大学学报000210 摘要：目的 研究N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长状态的影响。方法 以依霉素(tunicamycin)为N-糖基化抑制剂，作用于人脑胶质瘤细胞株SWO-38，运用电镜技术及琼脂糖电泳，观察N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长的影响。结果 依霉素作用于SWO-38细胞后，透射电镜下细胞出现线粒体等细胞器增殖，核仁消失，细胞固缩。琼脂糖电泳出现DNA梯形条带。结论N-糖基化抑制可以诱导胶质瘤细胞的早期凋亡。
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中图分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588 (2000) 02-0166-03
Induction of early apoptosis of glioma cells by N-glycosylation inhibition
ZHANG Jian，ZHANG Zong-cheng，LI Peng，ZHANG Ji-ren
(Center of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282, China)
Abstract: Objective The effect of N-glycosylation inhibition on the growth of glioma cells was observed in vitro. Methods Tunicamycin was used as N-glycosylation inhibitor and its effect on the glioma cell line SWO-38 was observed by transmission electron microscopy and DNA electrophoresis. Results The morphological changes characteristic of early apoptosis have been found, including proliferation of the cell organelle, such as mitochondria, reduction of cell volume, chromatin condensation. DNA ladder was also observed in tunicamycin treated cells. Conclusion N-glycosylation inhibition can induce early apoptosis in glioma cells.
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Key words: N-glycosylation; inhibition; glioma; apoptosis
细胞膜复合糖分子变异在诱导细胞分化、浸润、粘附、增殖中具有重要作用。近几年本实验室在对肿瘤细胞N-糖基化的系统研究基础上已证实，肿瘤细胞N-糖基化作用增强与免疫逃避相关[1]，肿瘤患者血清中 N-糖基化分子增加与免疫抑制相关[2]。为了将课题进一步深入，我们研究了N-糖基化抑制对肿瘤细胞生长状态的影响。
1 材料和方法
1.1细胞株
SWO-38系人脑星形胶质瘤细胞株[3]，购自暨南大学医学院病理教研室，本室传代培养。
1.2 主要实验试剂
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N-糖基化抑制剂依霉素(tunicamycin) 购自Boehringer Mannheim公司。RPMI-1640培养液购自Gibco公司。琼脂糖为国产。TMB过氧化物酶ELISA底物试验盒(TMB Peroxidase ELA Substrate kit)为BIO-RAD公司产品。生物素标记的刀豆凝集素(Bio-ConA)生物素标记的麦胚凝集素(Bio-WGA) 、生物素标记的花生凝集素(Bio-PNA) 购自北京中山公司。丙酮、乙酸异戊酯、锇酸等常规试剂为国产分析纯试剂。
1.3 实验方法
1.3.1 SWO-38细胞的培养 用含10%小牛血清的1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3.2 依霉素的配制 依霉素溶于1640培养液中，其中加入0.1%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)以促溶，用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
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1.3.3 依霉素对SWO-38细胞增殖的影响 (MTT法) 取对数生长期的SWO-38细胞，用0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化制成单细胞悬液，调整其细胞浓度为105/ml，置于含2%小牛血清的完全培养基中培养。加细胞悬液及依霉素于96孔板中，依霉素设5个浓度梯度(0，1.0，2.5，5.0，10.0μg/ml)，每组设4个复孔。置96孔板于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养48 h。吸弃上清，加1:10 (V/V) MTT溶液100μl/孔，再置于CO2孵箱中培养48 h，吸弃上清，加DMSO 100μl/孔，终止反应。用ELISA仪检测D(λ)值(波长为570 nm)。分析计算：抑制率=1– (A/B).100% [A为试验管平均D D(λ)，B为对照管平均D(λ)]。
1.3.4 免疫细胞化学分析N糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响 将细胞稀释至一定浓度后置于96孔板中， 实验设2组，依霉素浓度梯度为1、5μg /ml，在37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养1、8、24 h， 对照组加入0.1% DMSO。加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗涤，0.3% H2O2-甲醇孵育10 min (室温)后，以2%小牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。吸去封闭剂，分别加入生物素标记的刀豆凝集素(Bio-ConA)、麦胚凝集素(Bio-WGA)、花生凝集素(Bio-PNA)，每组实验设3个复孔，4～8℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的卵白素(avidin)，37℃反应1 h，用TMB过氧化物酶ELISA底物试验盒(TMB Peroxidase ELA Substrate Kit：BIO-RAD公司)显色，酶联免疫检测仪上测波长为655 nm的吸光度，实验以同样方法重复3次。
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1.3.5 N糖基化抑制诱导SWO-38细胞的早期凋亡
1.3.5.1透射电镜观察 实验分2组，实验组细胞加入5μg/ml的依霉素，对照组加入0.1% DMSO，37℃、5% CO2、饱和湿度下培养8 h。按下述方法制备2%琼脂糖管：细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，去上清，再加入2%戊二醛固定5 h。取出琼脂糖模，剥离出细胞团，加入0.2 mol/L pH 7.2 的PBS液漂洗2遍。加入锇酸固定1.5 h后，PBS液漂洗。用丙酮按50%、70%、90%、100%、100%、100%的浓度梯度各脱水10 min。丙酮:树脂(1:1)反应1 h，丙酮:树脂 (1:2) 反应2 h，100%树脂反应3 h。细胞团置入100%树脂中，70℃反应12 h后，聚合修块、切片，电子染色后透射电镜观察。
1.3.5.2细胞核酸电泳 实验设2组，实验组加入5μg/ml 依霉素后，37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养8、24 h， 对照组加入0.1% DMSO；106个细胞中加入30μl 细胞裂解液(含0.15 g/L的蛋白酶K，0.5% SDS，pH8.0，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl)，50℃反应3 h。加入RNA酶(20μg/ml) 2μl，65℃反应30 min；2%琼脂糖，50 V电压下电泳4 h后紫外透射仪下观察、摄相。
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2 结果
2.1 依霉素对SWO-38细胞增殖的影响
其作用随着剂量的增加而增强，但剂量由5μg/ml增至10μg/ml时，作用增强不明显， MTT 结果见图1。
图1 依霉素对胶质瘤细胞SWO-38生长的影响
Fig.1 Effect of tunicamycin on the growth of glioma cell line SWO-38
2.2 N糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响
依霉素对胶质瘤细胞株凝集素受体的影响见表1，在5μg/ml 依霉素作用1 h后，ConA和WGA的表达部分受到影响(P<0.01)，8 h更为明显，当5μg/ml 依霉素作用24 h后，ConA、WGA和PNA的表达均受到抑制(P<0.01)，1μg/ml的依霉素对SWO-38细胞凝集素受体的表达无影响(P>0.01)。
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表1 N-糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响 (
±s, n =18)
Tab.1 Effect of the inhibition of N-glycosylation on the lectin receptorof SWO-38 cells (Mean±SD, n =18)
Tunicamycin (1 h)
Tunicamycin (8 h)
Tunicamycin (24 h)
Lectin receptor
0 g/L
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0.001 g/L
0.005 g/ L
0 g/L
0.001 g/L
0.005 g/L
0 g/L
0.001g/L
0.005 g/L
ConA
0.68±0.03
0.66±0.04
0.50±0.02
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0.68±0.05
0.65±0.04
0.49±0.04
0.68±0.05
0.65±0.04
0.29±0.04
PNA
0.53±0.03
0.54±0.04
0.53±0.03
0.53±0.04
0.53±0.03
, 百拇医药
0.52±0.03
0.53±0.04
0.53±0.03
0.31±0.03
WGA
0.42±0.02
0.40±0.02
0.35±0.02
0.42±0.02
0.41±0.03
0.36±0.03
0.42±0.02
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0.41±0.03
0.22±0.03
图2 N-糖基化抑制诱导SWO-38细胞早期凋亡的透射电镜结果
Fig.2 Transmission electron microscopy of the apoptosis of SWO-38 cells induced by N-glycosylation
(1) Lipid drops were present in the mitochondria (2) Nucleus were not present (3) Cellular pyknosis (4) Formation of apoptotic bodies was observed before breaking off
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2.3 透射电镜观察N糖基化抑制诱导SWO-38细胞的早期凋亡
细胞经5μg/ml 依霉素作用8 h以后，透射电镜下可见线粒体等细胞器增殖并出现脂滴，核仁消失，细胞固缩，凋亡小体形成但尚未脱落(图2)。经5μg/ml 依霉素处理8 h后，2%琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带，5μg/ml处理24 h后，DNA梯形条带更为明显(图3)。
图3 2%琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.3 DNA gel electrophoresis in 2% agarose
Lane 1: control group; Lane 2: treated group with 5μg/ml tunicamycin for 8 h; Lane 3: treated group with 3.5μg/ml tunicamycin for 24 h
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3 讨论
单糖、寡糖或多糖链与蛋白质或脂类共价结合成糖复合物的过程称为糖基化作用(glycosylation)，糖链与蛋白质以糖苷键相连，按糖链与肽链连接方式不同，主要分两种类型，一是β-构型的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)与天门冬酰胺的酰胺基之间形成的糖苷键，称N-糖苷键；二是主要由α-构型的N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc) 与丝氨酸或苏氨酸的羟基之间形成的糖苷键，称O-糖苷键。N-糖苷键与蛋白质相连的寡糖在保持糖蛋白的功能中起着非常重要的作用，并与细胞间的识别、信息传递及细胞突变有关[4]。
去糖基化是研究糖蛋白的功能和作用的一个重要手段。依霉素是一种核苷抗菌素(Nucleoside antibiotic)，它抑制GlcNAc-1-P转移酶的活性，从而抑制寡糖-脂质中间体(Lipid-linked oligosaccharide precusor)生物合成的第一步，即抑制UDP GlcNAc(UDP为核苷酸糖，是糖基供体的一种，GlcNAc 为乙酰葡萄糖胺)中GlcNAc转移到P-Dol(磷酸多萜醇)上，从而选择性地阻断蛋白质天门冬酰胺残基端的糖基化。据报道[4]依霉素可以显著改变体外培养细胞的形态，影响细胞间的识别和粘附，抑制细胞的分化。
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凝集素是与特定糖特异性结合的单纯蛋白质或糖蛋白，文献报道其在低浓度下6～9 h内即可抑制N糖蛋白的合成。本实验根据其对糖链的选择性，分别选择了仅与N-糖苷键型糖蛋白结合的ConA、仅与O-糖苷键型糖蛋白结合的PNA以及与两者都结合的 WGA，研究了依霉素作用前后糖蛋白的定量变化。结果表明5μg/ml 依霉素作用于SWO-38细胞1 h即可出现N糖基化抑制，至8 h更为明显，但至24 h时总蛋白的合成受到抑制，说明依霉素在一定的浓度和时间内，并不抑制总蛋白质的合成，而只是选择性地抑制N-糖蛋白的合成。
蛋白质的N-糖基化对于维持细胞周期进程是必需的，一些实验已表明N-糖基化抑制可以阻断细胞周期于G1期[5]，Perez等[6]发现依霉素可以诱导HL60及U937细胞的凋亡。但依霉素并不能诱导所有细胞的凋亡，有时甚至还有相反的作用，如依霉素就不能诱导K562细胞的凋亡，可能是由于其细胞膜上含有较高浓度的胆固醇以及其GlcNAc-1-P转移酶的含量及活力与HL60等细胞不同。依霉素还可以抑制肿瘤坏死因子(TNF)所致的肝细胞凋亡[7]，其机理不甚清楚，但说明N-糖基化抑制既可参与诱导细胞的凋亡，也可抑制细胞的凋亡，其作用主要因细胞的种类不同而异。N-糖基化抑制对胶质瘤细胞SWO-38的作用又如何呢？本实验中透射电镜结果显示经5μg/ml 依霉素作用8 h后，SWO-38细胞出现线粒体、内质网等细胞器增殖，并出现脂滴、核仁消失、细胞固缩等细胞凋亡早期的表现，但未见形成凋亡小体。对于线粒体等细胞器的增殖，朴英杰等[8]认为系凋亡早期细胞的反跳现象。SWO-38细胞经5μg/ml 依霉素作用8 h后，核酸电泳出现了DNA梯形带，但不明显，经作用24 h后梯形带较前明显，结果说明依霉素诱导SWO-38细胞的早期凋亡与N糖基化抑制相关。细胞最终走向凋亡是由于N糖基化抑制启动了凋亡过程，还是由于细胞总蛋白合成受抑制所致，还需进一步的研究。
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脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其恶性度高，临床治疗的效果差。本实验发现N糖基化抑制可以诱导恶性增殖的胶质瘤细胞凋亡，为胶质瘤的临床治疗和基础研究提供了一个新的途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700143)
作者简介：张 健，男，湖北武汉人，1999年从中山医科大学博士后流动站出站，讲师，主治医师，电话：85143845
参考文献
1，Zhang JR, Wang SM, Fan SD et al. Analysis of the N-glysylation of the serum glycoproteins defined by ConA, PHA-E, RCAI and WGA in Chinese patients with gastrointestinal diseases[J]. Chin Med Sci J, 1996, 11(1):36～40.
, 百拇医药
2，Zhang JR, Wang SM, Fan SD et al. Analysis of the antitumor molecules with N- glycosylation in serum of patients with lung cancer[J]. Journal of Tumor Marker Oncology, 11(2):92～3.
3，司徒锐, 王惠华, 王锦环等. 人脑恶性胶质瘤体外细胞系SWO-38的建立和生物学特性[J]. 癌症, 1987, 6(4):235～7.
4，Matherly LM, Angeles SM. Role of N-glycosylation in the structure and function of the methotrexate membrane transporter from CCRF- CEM human lymphoblastic leukemia cells[J]. Biochem Pharmacol, 1994, 47(6): 1094～8.
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5，Larsson O. Cell cycle-specific growth inhibition of human breast cancer cells induced by metabolic inhibitors[J]. Glycobiology, 1993, 3(5): 475～9.
6，Perez SD, Mollinedo- F. Inhibition of N- linked glycosylation induces early apoptosis in human promyelocytic HL- 60 cells[J]. J cell Physiol, 1995, 163(3): 523～31.
7，Leist M, Wendel A. Tunicamycin potently inhibits tumor necrosis factor induced hepatocyte apoptosis[J]. Eur J Pharmacol, 1995, 292(2): 201～4.
8，朴英杰, 黄行许, 霍霞等. 淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究[J]. 第一军医大学学报, 1996, 16(3): 165～171.
收稿日期：1999-03-05, 百拇医药
单位：张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；李鹏(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)
关键词：N-糖基化；神经胶质瘤；凋亡
第一军医大学学报000210 摘要：目的 研究N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长状态的影响。方法 以依霉素(tunicamycin)为N-糖基化抑制剂，作用于人脑胶质瘤细胞株SWO-38，运用电镜技术及琼脂糖电泳，观察N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长的影响。结果 依霉素作用于SWO-38细胞后，透射电镜下细胞出现线粒体等细胞器增殖，核仁消失，细胞固缩。琼脂糖电泳出现DNA梯形条带。结论N-糖基化抑制可以诱导胶质瘤细胞的早期凋亡。
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中图分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588 (2000) 02-0166-03
Induction of early apoptosis of glioma cells by N-glycosylation inhibition
ZHANG Jian，ZHANG Zong-cheng，LI Peng，ZHANG Ji-ren
(Center of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282, China)
Abstract: Objective The effect of N-glycosylation inhibition on the growth of glioma cells was observed in vitro. Methods Tunicamycin was used as N-glycosylation inhibitor and its effect on the glioma cell line SWO-38 was observed by transmission electron microscopy and DNA electrophoresis. Results The morphological changes characteristic of early apoptosis have been found, including proliferation of the cell organelle, such as mitochondria, reduction of cell volume, chromatin condensation. DNA ladder was also observed in tunicamycin treated cells. Conclusion N-glycosylation inhibition can induce early apoptosis in glioma cells.
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Key words: N-glycosylation; inhibition; glioma; apoptosis
细胞膜复合糖分子变异在诱导细胞分化、浸润、粘附、增殖中具有重要作用。近几年本实验室在对肿瘤细胞N-糖基化的系统研究基础上已证实，肿瘤细胞N-糖基化作用增强与免疫逃避相关[1]，肿瘤患者血清中 N-糖基化分子增加与免疫抑制相关[2]。为了将课题进一步深入，我们研究了N-糖基化抑制对肿瘤细胞生长状态的影响。
1 材料和方法
1.1细胞株
SWO-38系人脑星形胶质瘤细胞株[3]，购自暨南大学医学院病理教研室，本室传代培养。
1.2 主要实验试剂
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N-糖基化抑制剂依霉素(tunicamycin) 购自Boehringer Mannheim公司。RPMI-1640培养液购自Gibco公司。琼脂糖为国产。TMB过氧化物酶ELISA底物试验盒(TMB Peroxidase ELA Substrate kit)为BIO-RAD公司产品。生物素标记的刀豆凝集素(Bio-ConA)生物素标记的麦胚凝集素(Bio-WGA) 、生物素标记的花生凝集素(Bio-PNA) 购自北京中山公司。丙酮、乙酸异戊酯、锇酸等常规试剂为国产分析纯试剂。
1.3 实验方法
1.3.1 SWO-38细胞的培养 用含10%小牛血清的1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3.2 依霉素的配制 依霉素溶于1640培养液中，其中加入0.1%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)以促溶，用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
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1.3.3 依霉素对SWO-38细胞增殖的影响 (MTT法) 取对数生长期的SWO-38细胞，用0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化制成单细胞悬液，调整其细胞浓度为105/ml，置于含2%小牛血清的完全培养基中培养。加细胞悬液及依霉素于96孔板中，依霉素设5个浓度梯度(0，1.0，2.5，5.0，10.0μg/ml)，每组设4个复孔。置96孔板于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养48 h。吸弃上清，加1:10 (V/V) MTT溶液100μl/孔，再置于CO2孵箱中培养48 h，吸弃上清，加DMSO 100μl/孔，终止反应。用ELISA仪检测D(λ)值(波长为570 nm)。分析计算：抑制率=1– (A/B).100% [A为试验管平均D D(λ)，B为对照管平均D(λ)]。
1.3.4 免疫细胞化学分析N糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响 将细胞稀释至一定浓度后置于96孔板中， 实验设2组，依霉素浓度梯度为1、5μg /ml，在37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养1、8、24 h， 对照组加入0.1% DMSO。加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗涤，0.3% H2O2-甲醇孵育10 min (室温)后，以2%小牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。吸去封闭剂，分别加入生物素标记的刀豆凝集素(Bio-ConA)、麦胚凝集素(Bio-WGA)、花生凝集素(Bio-PNA)，每组实验设3个复孔，4～8℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的卵白素(avidin)，37℃反应1 h，用TMB过氧化物酶ELISA底物试验盒(TMB Peroxidase ELA Substrate Kit：BIO-RAD公司)显色，酶联免疫检测仪上测波长为655 nm的吸光度，实验以同样方法重复3次。
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1.3.5 N糖基化抑制诱导SWO-38细胞的早期凋亡
1.3.5.1透射电镜观察 实验分2组，实验组细胞加入5μg/ml的依霉素，对照组加入0.1% DMSO，37℃、5% CO2、饱和湿度下培养8 h。按下述方法制备2%琼脂糖管：细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，去上清，再加入2%戊二醛固定5 h。取出琼脂糖模，剥离出细胞团，加入0.2 mol/L pH 7.2 的PBS液漂洗2遍。加入锇酸固定1.5 h后，PBS液漂洗。用丙酮按50%、70%、90%、100%、100%、100%的浓度梯度各脱水10 min。丙酮:树脂(1:1)反应1 h，丙酮:树脂 (1:2) 反应2 h，100%树脂反应3 h。细胞团置入100%树脂中，70℃反应12 h后，聚合修块、切片，电子染色后透射电镜观察。
1.3.5.2细胞核酸电泳 实验设2组，实验组加入5μg/ml 依霉素后，37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养8、24 h， 对照组加入0.1% DMSO；106个细胞中加入30μl 细胞裂解液(含0.15 g/L的蛋白酶K，0.5% SDS，pH8.0，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl)，50℃反应3 h。加入RNA酶(20μg/ml) 2μl，65℃反应30 min；2%琼脂糖，50 V电压下电泳4 h后紫外透射仪下观察、摄相。
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2 结果
2.1 依霉素对SWO-38细胞增殖的影响
其作用随着剂量的增加而增强，但剂量由5μg/ml增至10μg/ml时，作用增强不明显， MTT 结果见图1。
图1 依霉素对胶质瘤细胞SWO-38生长的影响
Fig.1 Effect of tunicamycin on the growth of glioma cell line SWO-38
2.2 N糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响
依霉素对胶质瘤细胞株凝集素受体的影响见表1，在5μg/ml 依霉素作用1 h后，ConA和WGA的表达部分受到影响(P<0.01)，8 h更为明显，当5μg/ml 依霉素作用24 h后，ConA、WGA和PNA的表达均受到抑制(P<0.01)，1μg/ml的依霉素对SWO-38细胞凝集素受体的表达无影响(P>0.01)。
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表1 N-糖基化抑制对SWO-38细胞凝集素受体的影响 (
±s, n =18)Tab.1 Effect of the inhibition of N-glycosylation on the lectin receptorof SWO-38 cells (Mean±SD, n =18)
Tunicamycin (1 h)
Tunicamycin (8 h)
Tunicamycin (24 h)
Lectin receptor
0 g/L
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0.001 g/L
0.005 g/ L
0 g/L
0.001 g/L
0.005 g/L
0 g/L
0.001g/L
0.005 g/L
ConA
0.68±0.03
0.66±0.04
0.50±0.02
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0.68±0.05
0.65±0.04
0.49±0.04
0.68±0.05
0.65±0.04
0.29±0.04
PNA
0.53±0.03
0.54±0.04
0.53±0.03
0.53±0.04
0.53±0.03
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0.52±0.03
0.53±0.04
0.53±0.03
0.31±0.03
WGA
0.42±0.02
0.40±0.02
0.35±0.02
0.42±0.02
0.41±0.03
0.36±0.03
0.42±0.02
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0.41±0.03
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图2 N-糖基化抑制诱导SWO-38细胞早期凋亡的透射电镜结果
Fig.2 Transmission electron microscopy of the apoptosis of SWO-38 cells induced by N-glycosylation
(1) Lipid drops were present in the mitochondria (2) Nucleus were not present (3) Cellular pyknosis (4) Formation of apoptotic bodies was observed before breaking off
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2.3 透射电镜观察N糖基化抑制诱导SWO-38细胞的早期凋亡
细胞经5μg/ml 依霉素作用8 h以后，透射电镜下可见线粒体等细胞器增殖并出现脂滴，核仁消失，细胞固缩，凋亡小体形成但尚未脱落(图2)。经5μg/ml 依霉素处理8 h后，2%琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带，5μg/ml处理24 h后，DNA梯形条带更为明显(图3)。
图3 2%琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.3 DNA gel electrophoresis in 2% agarose
Lane 1: control group; Lane 2: treated group with 5μg/ml tunicamycin for 8 h; Lane 3: treated group with 3.5μg/ml tunicamycin for 24 h
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3 讨论
单糖、寡糖或多糖链与蛋白质或脂类共价结合成糖复合物的过程称为糖基化作用(glycosylation)，糖链与蛋白质以糖苷键相连，按糖链与肽链连接方式不同，主要分两种类型，一是β-构型的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)与天门冬酰胺的酰胺基之间形成的糖苷键，称N-糖苷键；二是主要由α-构型的N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc) 与丝氨酸或苏氨酸的羟基之间形成的糖苷键，称O-糖苷键。N-糖苷键与蛋白质相连的寡糖在保持糖蛋白的功能中起着非常重要的作用，并与细胞间的识别、信息传递及细胞突变有关[4]。
去糖基化是研究糖蛋白的功能和作用的一个重要手段。依霉素是一种核苷抗菌素(Nucleoside antibiotic)，它抑制GlcNAc-1-P转移酶的活性，从而抑制寡糖-脂质中间体(Lipid-linked oligosaccharide precusor)生物合成的第一步，即抑制UDP GlcNAc(UDP为核苷酸糖，是糖基供体的一种，GlcNAc 为乙酰葡萄糖胺)中GlcNAc转移到P-Dol(磷酸多萜醇)上，从而选择性地阻断蛋白质天门冬酰胺残基端的糖基化。据报道[4]依霉素可以显著改变体外培养细胞的形态，影响细胞间的识别和粘附，抑制细胞的分化。
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凝集素是与特定糖特异性结合的单纯蛋白质或糖蛋白，文献报道其在低浓度下6～9 h内即可抑制N糖蛋白的合成。本实验根据其对糖链的选择性，分别选择了仅与N-糖苷键型糖蛋白结合的ConA、仅与O-糖苷键型糖蛋白结合的PNA以及与两者都结合的 WGA，研究了依霉素作用前后糖蛋白的定量变化。结果表明5μg/ml 依霉素作用于SWO-38细胞1 h即可出现N糖基化抑制，至8 h更为明显，但至24 h时总蛋白的合成受到抑制，说明依霉素在一定的浓度和时间内，并不抑制总蛋白质的合成，而只是选择性地抑制N-糖蛋白的合成。
蛋白质的N-糖基化对于维持细胞周期进程是必需的，一些实验已表明N-糖基化抑制可以阻断细胞周期于G1期[5]，Perez等[6]发现依霉素可以诱导HL60及U937细胞的凋亡。但依霉素并不能诱导所有细胞的凋亡，有时甚至还有相反的作用，如依霉素就不能诱导K562细胞的凋亡，可能是由于其细胞膜上含有较高浓度的胆固醇以及其GlcNAc-1-P转移酶的含量及活力与HL60等细胞不同。依霉素还可以抑制肿瘤坏死因子(TNF)所致的肝细胞凋亡[7]，其机理不甚清楚，但说明N-糖基化抑制既可参与诱导细胞的凋亡，也可抑制细胞的凋亡，其作用主要因细胞的种类不同而异。N-糖基化抑制对胶质瘤细胞SWO-38的作用又如何呢？本实验中透射电镜结果显示经5μg/ml 依霉素作用8 h后，SWO-38细胞出现线粒体、内质网等细胞器增殖，并出现脂滴、核仁消失、细胞固缩等细胞凋亡早期的表现，但未见形成凋亡小体。对于线粒体等细胞器的增殖，朴英杰等[8]认为系凋亡早期细胞的反跳现象。SWO-38细胞经5μg/ml 依霉素作用8 h后，核酸电泳出现了DNA梯形带，但不明显，经作用24 h后梯形带较前明显，结果说明依霉素诱导SWO-38细胞的早期凋亡与N糖基化抑制相关。细胞最终走向凋亡是由于N糖基化抑制启动了凋亡过程，还是由于细胞总蛋白合成受抑制所致，还需进一步的研究。
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脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其恶性度高，临床治疗的效果差。本实验发现N糖基化抑制可以诱导恶性增殖的胶质瘤细胞凋亡，为胶质瘤的临床治疗和基础研究提供了一个新的途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700143)
作者简介：张 健，男，湖北武汉人，1999年从中山医科大学博士后流动站出站，讲师，主治医师，电话：85143845
参考文献
1，Zhang JR, Wang SM, Fan SD et al. Analysis of the N-glysylation of the serum glycoproteins defined by ConA, PHA-E, RCAI and WGA in Chinese patients with gastrointestinal diseases[J]. Chin Med Sci J, 1996, 11(1):36～40.
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2，Zhang JR, Wang SM, Fan SD et al. Analysis of the antitumor molecules with N- glycosylation in serum of patients with lung cancer[J]. Journal of Tumor Marker Oncology, 11(2):92～3.
3，司徒锐, 王惠华, 王锦环等. 人脑恶性胶质瘤体外细胞系SWO-38的建立和生物学特性[J]. 癌症, 1987, 6(4):235～7.
4，Matherly LM, Angeles SM. Role of N-glycosylation in the structure and function of the methotrexate membrane transporter from CCRF- CEM human lymphoblastic leukemia cells[J]. Biochem Pharmacol, 1994, 47(6): 1094～8.
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5，Larsson O. Cell cycle-specific growth inhibition of human breast cancer cells induced by metabolic inhibitors[J]. Glycobiology, 1993, 3(5): 475～9.
6，Perez SD, Mollinedo- F. Inhibition of N- linked glycosylation induces early apoptosis in human promyelocytic HL- 60 cells[J]. J cell Physiol, 1995, 163(3): 523～31.
7，Leist M, Wendel A. Tunicamycin potently inhibits tumor necrosis factor induced hepatocyte apoptosis[J]. Eur J Pharmacol, 1995, 292(2): 201～4.
8，朴英杰, 黄行许, 霍霞等. 淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究[J]. 第一军医大学学报, 1996, 16(3): 165～171.
收稿日期：1999-03-05, 百拇医药