盐酸林可霉素注射液细菌内毒素检查法的研究
作者：刘廷快
单位：广西壮族自治区药品检验所
关键词：
中国药典1995年版二部规定盐酸林可霉素注射液的热原检查法为家兔法 中国药典1995年版二部规定盐酸林可霉素注射液的热原检查法为家兔法。美国药典1995年23版[1]已将其热原检查改为细菌内毒素检查，并规定细菌内毒素限值为0.5 EU/mg。本文参考美国药典的限值对其细菌内毒素检查法进行了研究。
1 材料
样品(S)：盐酸林可霉素注射液，批号980413，980414，980415规格2ml∶0.6 g，桂林市第二制药厂生产，鲎试剂(TAL)：批号981108，灵敏度(λ)0.5 EU/ml；批号980218，λ＝0.125 EU/ml；批号980302，λ＝0.25 EU/ml，规格均为0.1 ml/支，福州东方鲎试剂厂提供；细菌内毒素工作标准品，规格60 EU/支，批号9801，中国药品生物制品检定所提供；细菌内毒素检查用水(WBET)，规格5 ml/支，批号980226，湛江安度斯生物有限公司提供。
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核 按中国药典1995年版二部附录XIE[2]鲎试剂灵敏度复核项下进行。结果，981108批TALλc＝0.5 EU/ml，980302批TALλc＝0.125 EU/ml，980218批TALλc＝0.25 EU/ml，均符合规定。
2.2 样品内毒素限值(L)的确定[3] 按公式L＝K/M计算样品内毒素限值，K为按规定的给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阀剂量，以EU/kg表示，静脉注射的药品规定为5 EU/kg；M为热原检查时家兔的剂量，以ml/kg表示。本品家兔注射剂量为1 ml/kg(5mg/ml)，则本品L值为5 EU/ml(1 EU/mg)。而美国药典23版该品种规定为0.5 EU/mg，为严格起见，本文选用L值0.5 EU/mg。
2.3 干扰试验最大有效稀释倍数(MVD)计算 目前常用的TAL灵敏度一般在0.125～0.5 EU/ml之间，按公式MVD＝L/λ，可算出MVD值为300～1280倍，对λ＝0.5 EU/ml，MVC＝1 mg/ml，因此，MVD＝产品效价/MVC＝300倍。当λ＝0.125 EU/ml时，MVD＝1280倍。
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2.4 最高非干扰浓度预测 以检查用水将样品分别作1，5，10，20……1280倍稀释，稀释溶液记为Sw。分别做两个反应系列：一是阳性产品对照(PPC)系列，用各个稀释度的Sw 0.1 ml复溶TAL，然后加入2 λ浓度的内毒素溶液0.1 ml与之反应；二是阴性产品对照(NPC)系列，用检查用水复溶TAL，然后与Sw反应。用λ＝0.5 EU/ml，λ＝0.125 EU/ml的TAL两种不同灵敏度进行试验。结果(见表1)。
表1 最高非干扰浓度预测结果
TAL批号
样品稀释倍数
1
5
10
20
, http://www.100md.com
40
80
160
320
640
1280
981108
样品3批
PPC
-
-
+
+
, 百拇医药 +
+
+
+
+
+
λ＝0.5 EU/ml
NPC
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
980302
样品3批
PPC
-
-
-
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
λ＝0.125 EU/ml
NPC
-
-
-
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
2.5 干扰试验 从预试验结果可见，样品最高非干扰浓度为15 mg/ml(即稀释20倍)，为使其干扰得到确切的排除，将3批样品稀释至40倍，按中国药典1995年版二部附录XIE进行干扰试验。结果(见表2)。
表2 干 扰 试 验 结 果(样品浓度7.5 mg/ml)
TAL批号
样品批号
细 菌 内 毒 素 浓 度(EU/ml)
1.0
0.5
0.25
0.125
, 百拇医药
0.06
0.03
NC
981108
980413
++++
++++------------
980414
++++
++++------------
980415
++++
, 百拇医药
++++------------
WBET
++++
++++------------
980302
980413
++++
++++------------
980414
++++
++++------------
980415
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++++
++++------------
WBET
++++
++++------------
从表2可见，细菌内毒素与TAL的反应在水溶液和在样品溶液中进行无差异，表明盐酸林可霉素注射液经稀释40倍后不再干扰细菌内毒素试验。
2.6 样品细菌内毒素检查 2.6.1 样品不加内毒素的检查 将3批样品分别用检查用水作300倍稀释(根据本品内毒素限值L＝0.5 EU/mg而定)，使用λ＝0.5 EU/ml的TAL，按中国药典1995年版二部细菌内毒素检查法进行检查，同时增加PPC管，结果，3批样品管和阴性管均为阴性，阳性管和PPC管均为阳性。样品检查均符合规定。2.6.2 样品加入内毒素的检查 分别将3批样品原液溶解、稀释细菌内毒素，使样品原液污染内毒素达到限值(即污染样品)150 EU/ml，以不同λ值的TAL分别进行检查，检查方法同试验2.6.1，结果(见表3)。
, 百拇医药
表3 阳 性 样 品 的 细 菌 内 毒 素 检 查 结 果
TAL批号
样品3批
NC
PC
PPC
981108(λ＝0.5 EU/ml)
++
-
+
+
980218(λ＝0.25 EU/ml)
, http://www.100md.com
++
-
+
+
980302(λ＝0.125 EU/ml)
++
-
+
+
从表3结果可见，采用不同灵敏度的TAL，3批样品均呈阳性反应，说明对样品作排除干扰处理不会影响其内毒素的检出。
3 讨论
盐酸林可霉素对鲎试剂与内毒素的反应有抑制作用，但可通过简便的稀释方法加以排除。干扰试验结果证实，盐酸林可霉素注射液经稀释40倍(7.5 mg/ml)后即可排除干扰，在作样品细菌内毒素检查时，由于常用的TAL灵敏度值为0.5 EU/ml或以下，对应的稀释倍数在300倍以上，这大大降低了样品对试验干扰的可能性，因而本品可采用细菌内毒素检查法控制热原。在作细菌内毒素检查时，可取本品以检用水稀释至300倍(1 mg/ml)按中国药典细菌内毒素检查法进行检查，每ml稀释液细菌内毒素含量应小于0.5 EU/ml。
参考文献
1.Lincomycin Hydrochloride Injection：USP-NF X XⅢ 1995；891
2.卫生部药典委员会：细菌内毒素检查法，中国药典1995年版二部，北京，化学工业出版社，广州，广东科技出版社，1995：附录76
3.夏振民：药品细菌内毒素检查的限值 药物分析杂志 1995；15(3)：54, http://www.100md.com
单位：广西壮族自治区药品检验所
关键词：
中国药典1995年版二部规定盐酸林可霉素注射液的热原检查法为家兔法 中国药典1995年版二部规定盐酸林可霉素注射液的热原检查法为家兔法。美国药典1995年23版[1]已将其热原检查改为细菌内毒素检查，并规定细菌内毒素限值为0.5 EU/mg。本文参考美国药典的限值对其细菌内毒素检查法进行了研究。
1 材料
样品(S)：盐酸林可霉素注射液，批号980413，980414，980415规格2ml∶0.6 g，桂林市第二制药厂生产，鲎试剂(TAL)：批号981108，灵敏度(λ)0.5 EU/ml；批号980218，λ＝0.125 EU/ml；批号980302，λ＝0.25 EU/ml，规格均为0.1 ml/支，福州东方鲎试剂厂提供；细菌内毒素工作标准品，规格60 EU/支，批号9801，中国药品生物制品检定所提供；细菌内毒素检查用水(WBET)，规格5 ml/支，批号980226，湛江安度斯生物有限公司提供。
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2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核 按中国药典1995年版二部附录XIE[2]鲎试剂灵敏度复核项下进行。结果，981108批TALλc＝0.5 EU/ml，980302批TALλc＝0.125 EU/ml，980218批TALλc＝0.25 EU/ml，均符合规定。
2.2 样品内毒素限值(L)的确定[3] 按公式L＝K/M计算样品内毒素限值，K为按规定的给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阀剂量，以EU/kg表示，静脉注射的药品规定为5 EU/kg；M为热原检查时家兔的剂量，以ml/kg表示。本品家兔注射剂量为1 ml/kg(5mg/ml)，则本品L值为5 EU/ml(1 EU/mg)。而美国药典23版该品种规定为0.5 EU/mg，为严格起见，本文选用L值0.5 EU/mg。
2.3 干扰试验最大有效稀释倍数(MVD)计算 目前常用的TAL灵敏度一般在0.125～0.5 EU/ml之间，按公式MVD＝L/λ，可算出MVD值为300～1280倍，对λ＝0.5 EU/ml，MVC＝1 mg/ml，因此，MVD＝产品效价/MVC＝300倍。当λ＝0.125 EU/ml时，MVD＝1280倍。
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2.4 最高非干扰浓度预测 以检查用水将样品分别作1，5，10，20……1280倍稀释，稀释溶液记为Sw。分别做两个反应系列：一是阳性产品对照(PPC)系列，用各个稀释度的Sw 0.1 ml复溶TAL，然后加入2 λ浓度的内毒素溶液0.1 ml与之反应；二是阴性产品对照(NPC)系列，用检查用水复溶TAL，然后与Sw反应。用λ＝0.5 EU/ml，λ＝0.125 EU/ml的TAL两种不同灵敏度进行试验。结果(见表1)。
表1 最高非干扰浓度预测结果
TAL批号
样品稀释倍数
1
5
10
20
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40
80
160
320
640
1280
981108
样品3批
PPC
-
-
+
+
, 百拇医药 +
+
+
+
+
+
λ＝0.5 EU/ml
NPC
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
980302
样品3批
PPC
-
-
-
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
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λ＝0.125 EU/ml
NPC
-
-
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-
-
-
-
-
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2.5 干扰试验 从预试验结果可见，样品最高非干扰浓度为15 mg/ml(即稀释20倍)，为使其干扰得到确切的排除，将3批样品稀释至40倍，按中国药典1995年版二部附录XIE进行干扰试验。结果(见表2)。
表2 干 扰 试 验 结 果(样品浓度7.5 mg/ml)
TAL批号
样品批号
细 菌 内 毒 素 浓 度(EU/ml)
1.0
0.5
0.25
0.125
, 百拇医药
0.06
0.03
NC
981108
980413
++++
++++------------
980414
++++
++++------------
980415
++++
, 百拇医药
++++------------
WBET
++++
++++------------
980302
980413
++++
++++------------
980414
++++
++++------------
980415
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++++
++++------------
WBET
++++
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从表2可见，细菌内毒素与TAL的反应在水溶液和在样品溶液中进行无差异，表明盐酸林可霉素注射液经稀释40倍后不再干扰细菌内毒素试验。
2.6 样品细菌内毒素检查 2.6.1 样品不加内毒素的检查 将3批样品分别用检查用水作300倍稀释(根据本品内毒素限值L＝0.5 EU/mg而定)，使用λ＝0.5 EU/ml的TAL，按中国药典1995年版二部细菌内毒素检查法进行检查，同时增加PPC管，结果，3批样品管和阴性管均为阴性，阳性管和PPC管均为阳性。样品检查均符合规定。2.6.2 样品加入内毒素的检查 分别将3批样品原液溶解、稀释细菌内毒素，使样品原液污染内毒素达到限值(即污染样品)150 EU/ml，以不同λ值的TAL分别进行检查，检查方法同试验2.6.1，结果(见表3)。
, 百拇医药
表3 阳 性 样 品 的 细 菌 内 毒 素 检 查 结 果
TAL批号
样品3批
NC
PC
PPC
981108(λ＝0.5 EU/ml)
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980218(λ＝0.25 EU/ml)
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980302(λ＝0.125 EU/ml)
++
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从表3结果可见，采用不同灵敏度的TAL，3批样品均呈阳性反应，说明对样品作排除干扰处理不会影响其内毒素的检出。
3 讨论
盐酸林可霉素对鲎试剂与内毒素的反应有抑制作用，但可通过简便的稀释方法加以排除。干扰试验结果证实，盐酸林可霉素注射液经稀释40倍(7.5 mg/ml)后即可排除干扰，在作样品细菌内毒素检查时，由于常用的TAL灵敏度值为0.5 EU/ml或以下，对应的稀释倍数在300倍以上，这大大降低了样品对试验干扰的可能性，因而本品可采用细菌内毒素检查法控制热原。在作细菌内毒素检查时，可取本品以检用水稀释至300倍(1 mg/ml)按中国药典细菌内毒素检查法进行检查，每ml稀释液细菌内毒素含量应小于0.5 EU/ml。
参考文献
1.Lincomycin Hydrochloride Injection：USP-NF X XⅢ 1995；891
2.卫生部药典委员会：细菌内毒素检查法，中国药典1995年版二部，北京，化学工业出版社，广州，广东科技出版社，1995：附录76
3.夏振民：药品细菌内毒素检查的限值 药物分析杂志 1995；15(3)：54, http://www.100md.com