用同步荧光光谱法测定脂质过氧化物
作者：曾伟成 袁文杰
单位：曾伟成 厦门市医药研究所；袁文杰 厦门市药品检验所
关键词：
海峡药学990423 脂质过氧化物(LPO)是游离的或结合的不饱和脂质酸受自由基作用而形成的过氧化物，可进一步断裂生成丙二醛。人体内脂质过氧化物水平与某些生理病理过程的关系极为密切，其含量的测定也越来越受到人们的重视。在LPO的测定中，用的较多的是Yagi法[1]。在酸性加热条件下，LPO分解产生的丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成红色物质，该化合物是荧光性物质，其荧光激发峰波长为532 nm，发射峰波长553 nm。由于两峰波长相近，在常规测定时采用激发波长515 nm，发射波长553 nm，使荧光产率有所损失，影响了测定灵敏度。而采用同步荧光光谱法测定时，通过选择合适的波长差Δλ，可将在普通激发和发射光谱上重叠的荧光峰分开，因而有较高的灵敏度。本文在Yagi法的基础上，用同步荧光光谱法测定LPO的含量。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
仪器：分光FP-750荧光分光光度计；标准液：称取四乙氧基丙烷(MDA)(Flka公司)110 mg，置烧瓶内加甲醇50 ml，为标准原液，再从原液吸取0.1 ml置烧瓶中，加甲醇至100 ml为应用标准液；硫代巴比妥酸(TBA)试剂：0.67%硫代巴比妥酸与冰醋酸等体积混匀。10%磷钨酸、1/12N硫酸及正丁醇备用；血浆样品 采自小白鼠，肝素抗凝，常规方法分离血浆。
2 方 法
2.1 标准MDA测定
取10～100 nmol/L标准MDA液各4 ml加TBA反应液1 ml，试管加盖在95℃水浴中保温1 h，取出后流水冷却。加正丁醇4 ml，旋涡混合30 s，离心10 min(3000 rpm)，取上层有机相测定。
2.2 样品测定
, 百拇医药
于50 μl血浆中分别加1/12N硫酸4 ml、10%磷钨酸0.5 ml，混匀放置5 min，离心10 min(3000 rpm)，弃上清，于沉淀中加入1/12N硫酸2 ml，10%磷钨酸0.3 ml，混匀，离心10 min，弃上清。 沉淀中加入双蒸水2 ml，TBA反应液1 ml，混匀。以后同上处理。
对标准品、样品进行测试时，使用常规荧光光度法和同步荧光光度分别测定。常规荧光光光度法测定时，激发光波长515 nm，发射光波长553 nm，带宽均为5 nm。同步荧光光度法测定时，Δλ为18 nm。空白管用双蒸水取代同量标准液及样品，减空白得相对荧光强度净值。
3 结果与讨论
3.1 荧光物质的光谱特性
使用同步扫描技术，能使谱带窄化，荧光信号增强，有利于分析工作。标准MDA、血浆样品的同步荧光光谱扫描图表明：当选择Δλ＝18 nm进行同步扫描时，所获得的同步荧光光谱只出现一个位于553 nm的同步光谱峰，标准MDA与样品有基本一致的光谱特性，表明样品中提取的LPO分解产物是相同的。
, 百拇医药
3.2 荧光效率
本文在确定的实验条件下，研究了0.1～0.5 nmol MDA的线性关系，使用同步荧光光度法测定得到的回归方程为y＝4.243+157.17x，相关系数为r＝0.9932。其中在0.1～0.4 nmol内MDA具有良好的线性关系，回归方程y＝0.755+174.61x，相关系数0.9988。本文又研究了在0.1～0.5 nmol内使用常规荧光光度法测定MDA的含量，回归方程y＝1.273+59.19x，相关系数为r＝0.9937，在0.1～0.4 nmol内MDA有较好的线性关系，回归方程y＝-0.05+65.58x，相关系数0.9991。标准曲线结果表明，在0.1～0.4 nmol MDA范围内，二线性方程的斜率比值为0.3765，常规荧光光度法得到的TBA荧光产率只是同步荧光光度法的37.65%。使用同步荧光光度法测定，增加荧光产率，可有效地提高测定灵敏度。
3.3 回收率实验 吸收不同老鼠血浆样品50 μl，分别加入0.25 nmol四乙氧基丙烷进行同步荧光测定，结果(见表1)。5个样品平均回收率为100.08%，符合实验要求范围。
, 百拇医药
表1 标准回收实验 样品号
血浆样品
测定值(nmol)
加入标准液
后测定值(nmol)
回收率
(%)
1
0.089
0.337
99.2
2
0.076
, 百拇医药
0.334
103.2
3
0.071
0.323
100.8
4
0.083
0.326
97.2
5
0.1
0.35
100
参考文献
1 Yagi KA： Simple Fluoremetric Assay for Lipoperoxide， Biochem Med 1976；15：212, 百拇医药
单位：曾伟成 厦门市医药研究所；袁文杰 厦门市药品检验所
关键词：
海峡药学990423 脂质过氧化物(LPO)是游离的或结合的不饱和脂质酸受自由基作用而形成的过氧化物，可进一步断裂生成丙二醛。人体内脂质过氧化物水平与某些生理病理过程的关系极为密切，其含量的测定也越来越受到人们的重视。在LPO的测定中，用的较多的是Yagi法[1]。在酸性加热条件下，LPO分解产生的丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成红色物质，该化合物是荧光性物质，其荧光激发峰波长为532 nm，发射峰波长553 nm。由于两峰波长相近，在常规测定时采用激发波长515 nm，发射波长553 nm，使荧光产率有所损失，影响了测定灵敏度。而采用同步荧光光谱法测定时，通过选择合适的波长差Δλ，可将在普通激发和发射光谱上重叠的荧光峰分开，因而有较高的灵敏度。本文在Yagi法的基础上，用同步荧光光谱法测定LPO的含量。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
仪器：分光FP-750荧光分光光度计；标准液：称取四乙氧基丙烷(MDA)(Flka公司)110 mg，置烧瓶内加甲醇50 ml，为标准原液，再从原液吸取0.1 ml置烧瓶中，加甲醇至100 ml为应用标准液；硫代巴比妥酸(TBA)试剂：0.67%硫代巴比妥酸与冰醋酸等体积混匀。10%磷钨酸、1/12N硫酸及正丁醇备用；血浆样品 采自小白鼠，肝素抗凝，常规方法分离血浆。
2 方 法
2.1 标准MDA测定
取10～100 nmol/L标准MDA液各4 ml加TBA反应液1 ml，试管加盖在95℃水浴中保温1 h，取出后流水冷却。加正丁醇4 ml，旋涡混合30 s，离心10 min(3000 rpm)，取上层有机相测定。
2.2 样品测定
, 百拇医药
于50 μl血浆中分别加1/12N硫酸4 ml、10%磷钨酸0.5 ml，混匀放置5 min，离心10 min(3000 rpm)，弃上清，于沉淀中加入1/12N硫酸2 ml，10%磷钨酸0.3 ml，混匀，离心10 min，弃上清。 沉淀中加入双蒸水2 ml，TBA反应液1 ml，混匀。以后同上处理。
对标准品、样品进行测试时，使用常规荧光光度法和同步荧光光度分别测定。常规荧光光光度法测定时，激发光波长515 nm，发射光波长553 nm，带宽均为5 nm。同步荧光光度法测定时，Δλ为18 nm。空白管用双蒸水取代同量标准液及样品，减空白得相对荧光强度净值。
3 结果与讨论
3.1 荧光物质的光谱特性
使用同步扫描技术，能使谱带窄化，荧光信号增强，有利于分析工作。标准MDA、血浆样品的同步荧光光谱扫描图表明：当选择Δλ＝18 nm进行同步扫描时，所获得的同步荧光光谱只出现一个位于553 nm的同步光谱峰，标准MDA与样品有基本一致的光谱特性，表明样品中提取的LPO分解产物是相同的。
, 百拇医药
3.2 荧光效率
本文在确定的实验条件下，研究了0.1～0.5 nmol MDA的线性关系，使用同步荧光光度法测定得到的回归方程为y＝4.243+157.17x，相关系数为r＝0.9932。其中在0.1～0.4 nmol内MDA具有良好的线性关系，回归方程y＝0.755+174.61x，相关系数0.9988。本文又研究了在0.1～0.5 nmol内使用常规荧光光度法测定MDA的含量，回归方程y＝1.273+59.19x，相关系数为r＝0.9937，在0.1～0.4 nmol内MDA有较好的线性关系，回归方程y＝-0.05+65.58x，相关系数0.9991。标准曲线结果表明，在0.1～0.4 nmol MDA范围内，二线性方程的斜率比值为0.3765，常规荧光光度法得到的TBA荧光产率只是同步荧光光度法的37.65%。使用同步荧光光度法测定，增加荧光产率，可有效地提高测定灵敏度。
3.3 回收率实验 吸收不同老鼠血浆样品50 μl，分别加入0.25 nmol四乙氧基丙烷进行同步荧光测定，结果(见表1)。5个样品平均回收率为100.08%，符合实验要求范围。
, 百拇医药
表1 标准回收实验 样品号
血浆样品
测定值(nmol)
加入标准液
后测定值(nmol)
回收率
(%)
1
0.089
0.337
99.2
2
0.076
, 百拇医药
0.334
103.2
3
0.071
0.323
100.8
4
0.083
0.326
97.2
5
0.1
0.35
100
参考文献
1 Yagi KA： Simple Fluoremetric Assay for Lipoperoxide， Biochem Med 1976；15：212, 百拇医药