灵芝多糖的药效学研究Ⅰ.抗恶性肿瘤、抗血栓和抗凝血作用
作者：陈建济 吴志强 王秀敏 李克华 刘广芬 王晴川 胡恩 林志伟 杨亮 王素香 林珉弘
单位：陈建济(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；吴志强(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；王秀敏(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；李克华(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；刘广芬(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；王晴川(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；胡恩(福建中医学院中药系实习生 350003)；林志伟(福建中医学院中药系实习生 350003)；
关键词：灵芝多糖；抗肿瘤；抗血栓；抗凝血
摘要 本文用1摘要 本文用1.灵芝子实体经水提、乙醇沉制得灵芝多糖(GLPS)精品，用苯酚-硫酸法测其百分含量。2.应用小鼠移植性恶性肿瘤瘤株(S180、U14、EAC)，观察GLPS对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。3.观察GLPS对小鼠全血凝血时间及出血时间和大鼠血栓及血液凝固系统的影响。实验结果1.用本方法提取GLPS得率为0.589±0.135%。2.GLPS 40 mg/(kg.d).ig×17 d对小鼠肉瘤(S-180)和宫颈癌(U-14)的平均抑瘤率分别为43%和51%，而对艾氏腹水癌(EAC)小鼠生命没有明显延长作用(P>0.05)。3.GLPS 20 mg/(kg.d).ig×10 d或20～40 mg.kg-1.iv均能明显延长小鼠的凝血时间和出血时间(P<0.01)。GLPS 40 mg/(kg.d).ig×10 d能明显抑制大鼠的血栓形成(P<0.01)，降低纤维蛋白原的含量(P<0.01)，同时能明显延长部分凝血活酶时间(KPTT)<(P<0.01)。说明GLPS具有抗肿瘤、抗血栓和抗凝血的作用。
, http://www.100md.com
Studies on the Pharmacological Effects of the Polysaccharides of Ganoderma Lucidum
Ⅰ.Anticancer，Antithrombosis and anticoagulation of blood
Chen Jianji Wu Zhiqiang，et al
(Fujian Medical University，Laboratory of Snake Venom Research 350004)
Hu En Lin Zhiwei et al
(Fujian Colloege of Traditional Chinese Medicine 350003)
, 百拇医药
Abstract Study on the anticancer activity and the effect on blood coagulation of Polysaccharides separated Ganoderma lucidum(ling zhi)was reported in this paper.Polysaccharide of Ganoderma lucidum(GLPS)was separated by water extraction and ethanol precipitation.The yield of GLPS separated from native drug was about 0.589±0.139% by phenol-sulfuric acid method.assayed. The cancer cell line of S-180 and U-14 were implanted into the axillary subcutaneous of mice for studying the anticancer effect.It indicated that Glps GLPS 40 mg.kg-1.ig.d×17 d decreased the weight of cancer by about 43%(S-180) and 51%(U-14).The clotting and bleeding time of mice blood were uses for observing the effect on coagulation.The antithrombotic effect was assayed on rats by thrombosis test ex vivo.GLPS 20 mg.kg-1.d ig×10 d and 20～40 mg.kg-1.iv into mice prolonged the blood clotting and bleeding time(P<0.01).and GLPS 40 mg.kg-1.d.ig×10 d into rats decreased thrombosis and fibrinogen level of blood plasma(P<0.01)，the kaolin partial thrombin time was prolonged(P<0.01).These can conclusion that the GLPS of Ganoderma lucidum possessed the anticancer，antithrombosis and anticoagulation effects.
, http://www.100md.com
Key words Polysaccharide of Ganoderma lucidum，Anticancer，Antithrombosis，Anticoagulation
灵芝[赤芝，Ganoderma Lucidum(Leyys.ex Fr)Karst]为一种灵芝属的真菌。中国历代医家视为滋补强壮，扶正固本，延年益寿之珍品 。灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，具有多种的生理活性。本文主要对灵芝多糖抗肿瘤、抗血栓和抗凝血方面的作用进行研究。
1 材 料
1.1 药品与试剂 灵芝子实体购自三明真菌研究所；5-氟尿嘧啶注射液(5-FU)为上海旭东海普药业有限公司产品，批号971006；环磷酰胺(CPM)为上海华联制药公司产品，批号960102；冻干凝血酶、凝血活酶及部分凝血活酶均为上海医大华山医院技协试剂公司的产品，批号99035；纤维蛋白测定酸性缓冲液为宁波市慈城生化试剂厂生产，批号980819；5-腺苷二磷酸二钠盐(ADP)为上海伯奥生物科技有限公司产品。其它试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.2 动物 昆明种小鼠体重为18～22 g，Wistar种大鼠体重为300±20 g ，雌雄兼用，均由福建医科大学实验动物中心提供。
1.3 瘤株 小鼠肉瘤(S180)、宫颈癌(U14)及艾氏腹水癌(EAC)均自上海中国科学院药物研究所引进，在福建医科大学蛇毒所传代使用。
1.4 仪器 多功能双通道血液凝聚仪，电脑血浆纤维蛋白原测定仪，MR-4型多环血栓检测仪均为上海高机应用技术研究所产品；80-2型离心机为上海手术器械厂生产；7520型分光光度计为上海分析仪器厂生产；TG729C单盘电光分析天平为上海天平仪器厂生产。
2 方法和结果
, 百拇医药
2.1 灵芝多糖的提取及含量测定
2.1.1 提取流程[1]
2.1.2 含量测定(2,3) 以葡萄糖为标准品，配制不同浓度(10～80 μg.ml-1)的标准液。分别吸取1 ml标准液置于10 ml具塞比色管中，加入1 ml 5%苯酚和5 ml浓硫酸，摇匀反应20 min，于487 nm处测其吸收值。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸收值为纵坐标，制取标准曲线并求其回归方程，结果见表1。表1 葡萄糖标准液标准曲线的制备
管号
0
1
2
, 百拇医药
3
4
5
6
葡萄糖浓度
(μg.ml-1)
0
10
20
40
50
60
80
, 百拇医药
葡萄糖标准液(ml)
0
1
1
1
1
1
1
5%苯酚(ml)
1
1
1
1
1
, 百拇医药
1
1
浓硫酸(ml)
5
5
5
5
5
5
5
A487 nm
0
0.175
, 百拇医药
0.262
0.427
0.519
0.648
0.795
称取各批灵芝多糖粗品10 mg，配成0.1 mg .ml-1的水溶液作为供试液，各取1 ml依上法测其吸收值(5批GLPS粗品的A487 nm分别为0.697，0.682，0.670，0.656，0.671)，代入回归方程，求出灵芝多糖的含量及提取率，结果(见表2)。表2 灵芝多糖粗品中灵芝多糖的含量及提取率
批号
1
, 百拇医药 2
3
4
5
灵芝子实体干重(g)
335
376
416
255
274
灵芝多糖粗品(g)
3.00
3.11
, 百拇医药
3.20
3.12
3.42
灵芝多糖含量(%)
68.0
66.3
65.0
63.4
65.1
灵芝多糖提取率(%)
0.609
0.548
0.500
, 百拇医药
0.476
0.813
葡萄糖标准液标准曲线的回归方程：
y＝0.085+0.0090x(r＝0.9978)
2.2 灵芝多糖的抗肿瘤作用(4,5)
2.2.1 灵芝多糖对实体型移植瘤小鼠瘤块生长的影响 每次实验用同一性别小鼠，随机分为3组：生理盐水(NS)组、灵芝多糖(GLPS))组和5-氟尿嘧啶(5-FU)组或环磷酰胺(CPM)组。GLPS组提前灌胃(ig)40 mg/(kg.d)1周后，给各组小鼠接种瘤块。在无菌条件下，从荷瘤10～14 d、S180或U14瘤块生长良好的小鼠采取并切成直径2 mm～3 mm的瘤块，用套管针将其种入小鼠右侧腋窝皮下。接种后GLPS组继续给药10 d，5-FU组腹腔注射(ip)5-FU 20 mg.kg-1 4次或CPM组ip CPM 50 mg.kg-1 2次，隔日一次，NS组ig同一体积的生理盐水。于停药后处死小鼠，剥下皮下瘤块并称重，按下式计算抑瘤率。灵芝多糖对小鼠S180和U14的平均抑瘤率分别为43%和51%，灵芝多糖组的平均瘤重明显轻于NS组(P<0.01)，结果(见表3及图1和表4及图2)。
表3 灵芝多糖灌胃对小鼠肉瘤(S180)生长的影响(n＝10，
±S)
, 百拇医药
药物
剂量
(mg/kg.d×d)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
P值
第一次
NS
-
1.4±0.4
-
, http://www.100md.com
-
GLPS
40×17
0.8±0.2
40
<0.01
5-FU
20×4
0.9±0.4
21
>0.05
第二次
NS
, http://www.100md.com
-
2.4±0.9
-
-
GLPS
40×17
1.2±0.7
47
<0.01
5-FU
20×4
1.8±0.6
24
, 百拇医药
>0.05
第三次
NS
-
2.8±0.8
-
-
GLPS
40×17
1.6±0.4
42
<0.01
CPM
, 百拇医药
50×2
0.2±0.2
93
<0.001
表4 灵芝多糖灌胃对小鼠宫颈癌(U14)生长的影响(n＝10，±S)
药物
剂量
(mg/kg.d×d)
瘤重
(g)
, 百拇医药
抑瘤率
(%)
P值
第一次
NS
-
3.8±1.1
-
-
GLPS
40×17
1.9±0.7
49
, 百拇医药
<0.01
5-FU
20×4
2.4±1.8
36
<0.01
第二次
NS
-
3.8±1.0
-
-
GLPS
, 百拇医药
40×17
2.4±0.9
40
<0.01
CPM
50×2
0.1±0.6
97
<0.001
第三次
NS
-
4.0±0.9
, 百拇医药
-
-
GLPS
40×17
2.3±0.9
44
<0.01
CPM
50×2
0.5±0.5
88
<0.001
第四次
, 百拇医药
NS
-
3.6±1.0
-
-
GLPSⅠ
40×17
1.8±0.5
50
<0.01
GLPSⅡ
80×17
1.7±0.4
, 百拇医药
52
<0.01
CPM
50×2
1.2±0.4
67
<0.01
图1 灵芝多糖灌胃对小鼠肉瘤(S180)生长的影响
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图2 灵芝多糖灌胃对小鼠宫颈瘤(U14)生长的影响
2.2.2 灵芝多糖对腹水型移植瘤的小鼠存活时间的影响 每次实验用同一性别 小鼠，随机分为3组：(NS)组、灵芝多糖(GLPS)组和环磷酰胺(CPM)组。GLPS组提前灌胃(ig)40 mg/(kg.d)1周后。在无菌条件下，取接种7～8 d生长良好的艾氏腹水癌(EAC)制成1∶4肿瘤细胞生理盐水混悬液，给每只小鼠接种0.2 ml。接种后GLPS组继续给药10 d，CPM组ip CPM 50 mg.kg-1 2次，隔日1次，NS组ig同一体积的生理盐水。于停药后观察每只小鼠的生存天数，按下式计算生命延长率。实验重复3次，与NS组比较40 mg.kg-1的GLPS没有明显延长小鼠的生命(P>0.05)，平均生命延长率为15%，结果(见表5)。
生命延长率＝(给药动物平均存活天数/对照动物平均存活天数-1)×100%
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表5 灵芝多糖灌胃对艾氏腹水癌(EAC)小鼠存活时间的影响(n＝10)
药物
剂量
(mg/kg.d×d)
小鼠生存
天数±S
生命延长率
(%)
P值
第一次
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NS
-
12.5±1.3
-
-
GLP
40×17
13.9±0.7
11
>0.05
CPM
50×2
15.9±1.8
, 百拇医药
28
<0.01
第二次
NS
-
11.8±1.5
-
-
GLP
40×17
13.8±1.0
17
>0.05
, http://www.100md.com
CPM
50×2
15.1±2.9
27
<0.01
第三次
NS
-
11.8±1.6
-
-
GLP
40×17
, 百拇医药
13.9±1.7
18
>0.05
CPM
50×2
16.0±1.7
36
<0.01
2.3 灵芝多糖对小鼠全血凝血时间及出血时间的影响
2.3.1 灵芝多糖对小鼠全血出血时间的影响(6) 取小鼠50只，随机分为4组，GLPS组和一组NS组。GLPS组Ⅰ GLPS 20 mg/(kg.d).ig×10 d。NS组ig同体积的生理盐水。GLPS组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别GLPS 40、30、20 mg.kg-1.iv后1 h，用利剪将小鼠距尾尖3 mm处剪断，待血自行溢出时开始计量，每隔30 S用滤纸吸去血滴一次，直至血流停止(以滤纸吸至无血迹时为准)计算出血时间，所得数据与NS组进行显著性检验。结果表明：灵芝多糖能明显延长小鼠的出血时间(P<0.01)，(见表6)。表6 灵芝多糖对小鼠凝血和出血时间的影响(n＝10，±S)
, 百拇医药
组别
药物剂量及途径
(mg/kg.d)
出血时间
(s)
凝血时间
(s)
NS组
-
185±74
75±22
GLPS组Ⅰ
40×10.ig
, 百拇医药
872±46**
172±43**
GLPS组Ⅱ
40.iv
780±50**
116±27**
GLPS组Ⅲ
30.iv
720±40**
115±15**
GLPS组Ⅳ
, 百拇医药
20.iv
720±40**
108±14**
与NS组比较，**：P<0.01
2.3.2 灵芝多糖对小鼠全血凝血时间的影响(7) 取测定出血时间的各组小鼠，用弯镊迅速摘去一侧眼球，于载玻片两端各滴1滴直径5 mm的血滴。立即用秒表记时，每隔一定时间用清洁针头自血滴边缘向里轻轻挑动1次，观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝为止，所历时间即为凝血时间。另取1滴血作为正常凝血情况判别对照。记录各小鼠的凝血时间，进行显著性检验。结果表明：灵芝多糖能显著延长小鼠的凝血时间(P<0.01)，(见表6)。
2.4 灵芝多糖对大鼠血栓形成及血液凝固系统的影响。
, 百拇医药
取大鼠20只，随机分成NS组、GLPS组。GLPS组ig GLPS 40 mg/(kg.d)×10 d，NS组ig同体积的生理盐水。给药10 d后，用20%乌拉坦按0.5 ml.100 g-1体重ip麻醉后，打开大鼠胸腔，暴露心脏采血3 ml，其中0.5 ml直接用MR-4型多环血栓测定仪测定血栓长度和湿重(Chandler氏法)。另2.5 ml血加入0.3 ml(按9∶1)枸橼酸钠(3.8%)混匀，100 RPM离心5 min，吸取0.1 ml富血小板血浆(PRP)于特制的小试管中，用多功能双通道血液凝聚仪测定血小板数目。再以3000 RPM离心10 min，吸取0.1 ml贫血小板血浆(PPP)，加入相应的酶试剂后，用多功能双通道血液凝聚仪分别检测凝血活酶时间(PT)、凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(KPTT)。另在小试管中加入2 ml纤维蛋白原酸性缓冲液和0.1 ml PPP，混匀，置入电脑血浆纤维蛋白原测定仪测定纤维蛋白原含量。结果表明：灵芝多糖能明显减少大鼠血栓的长度和湿度(P<0.01)，并降低纤维蛋白原含量(P<0.01)，明显延长KPTT时间(P<0.01)(见图3)。
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图3 灵芝多糖(40 mg/kg.d.ig×10 d)对大鼠血液凝固系统的影响
3 讨论
灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，我们用水提、醇沉法提取灵芝多糖，并经透析除去分子量1万以下的成分，得到灵芝多糖粗品。以上实验结果说明：灵芝多糖具有抗肿瘤、抗血栓及抗凝血的作用。本所实验证明GLPS对试管培养的癌细胞无直接杀伤作用，故灵芝多糖抗肿瘤作用可能是通过增强机体免疫功能而实现的[8～10]。灵芝多糖能降低纤维蛋白原含量，减弱部分凝血活酶的活性使其影响内源性凝血途径，并能抗血栓和抗凝血，其机理尚待探讨。
作者单位：杨亮(福建中医学院中药系实习生 350003)；王素香(福建中医学院中药系实习生 350003)；林珉弘(福建中医学院中药系实习生 350003)
参考文献
, 百拇医药
[1]何云庆等，灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究 北京医科大学学报 1989；21(3)：225～227
[2]Dubois M，et al：colarmetric method for defermination of sugars and related substances，Anal Chem，1956，28：350～352
[3]方积年：多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定 药学通报 1984；19(1)：622～625
[4]潘启超等：肿瘤药理学及化学治疗学，广州，广东高等教育出版社，1989；
[5]李连达：抗癌中药的药效学研究技术要求 中药新药与临床药理 1992；392)：6
[6]徐叔云等主编：药理学实验方法学，第二版，北京，人民卫生出版社，1991；1991；481
[7]陈奇主编：中药药理研究方法学，第一版，北京，人民卫生出版社，1991；481
[8]雷林生等：灵芝多糖对抗环孢霉A、氢化可的松及抗肿瘤药的免疫抑制作用 中国药理学与毒理学杂志 1993；7：183
[9]雷林生等：灵芝多糖对老年小鼠脾细胞DNA多聚酶a活性及免疫功能的影响 药学学报 1993；28(2)：577～582
[10]曹容华等：灵芝多糖抗肿瘤作用的机理研究 山东医科大学学报 1992；30(3)：203～206, http://www.100md.com
单位：陈建济(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；吴志强(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；王秀敏(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；李克华(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；刘广芬(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；王晴川(福建医科大学蛇毒研究所 350004)；胡恩(福建中医学院中药系实习生 350003)；林志伟(福建中医学院中药系实习生 350003)；
关键词：灵芝多糖；抗肿瘤；抗血栓；抗凝血
摘要 本文用1摘要 本文用1.灵芝子实体经水提、乙醇沉制得灵芝多糖(GLPS)精品，用苯酚-硫酸法测其百分含量。2.应用小鼠移植性恶性肿瘤瘤株(S180、U14、EAC)，观察GLPS对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。3.观察GLPS对小鼠全血凝血时间及出血时间和大鼠血栓及血液凝固系统的影响。实验结果1.用本方法提取GLPS得率为0.589±0.135%。2.GLPS 40 mg/(kg.d).ig×17 d对小鼠肉瘤(S-180)和宫颈癌(U-14)的平均抑瘤率分别为43%和51%，而对艾氏腹水癌(EAC)小鼠生命没有明显延长作用(P>0.05)。3.GLPS 20 mg/(kg.d).ig×10 d或20～40 mg.kg-1.iv均能明显延长小鼠的凝血时间和出血时间(P<0.01)。GLPS 40 mg/(kg.d).ig×10 d能明显抑制大鼠的血栓形成(P<0.01)，降低纤维蛋白原的含量(P<0.01)，同时能明显延长部分凝血活酶时间(KPTT)<(P<0.01)。说明GLPS具有抗肿瘤、抗血栓和抗凝血的作用。
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Studies on the Pharmacological Effects of the Polysaccharides of Ganoderma Lucidum
Ⅰ.Anticancer，Antithrombosis and anticoagulation of blood
Chen Jianji Wu Zhiqiang，et al
(Fujian Medical University，Laboratory of Snake Venom Research 350004)
Hu En Lin Zhiwei et al
(Fujian Colloege of Traditional Chinese Medicine 350003)
, 百拇医药
Abstract Study on the anticancer activity and the effect on blood coagulation of Polysaccharides separated Ganoderma lucidum(ling zhi)was reported in this paper.Polysaccharide of Ganoderma lucidum(GLPS)was separated by water extraction and ethanol precipitation.The yield of GLPS separated from native drug was about 0.589±0.139% by phenol-sulfuric acid method.assayed. The cancer cell line of S-180 and U-14 were implanted into the axillary subcutaneous of mice for studying the anticancer effect.It indicated that Glps GLPS 40 mg.kg-1.ig.d×17 d decreased the weight of cancer by about 43%(S-180) and 51%(U-14).The clotting and bleeding time of mice blood were uses for observing the effect on coagulation.The antithrombotic effect was assayed on rats by thrombosis test ex vivo.GLPS 20 mg.kg-1.d ig×10 d and 20～40 mg.kg-1.iv into mice prolonged the blood clotting and bleeding time(P<0.01).and GLPS 40 mg.kg-1.d.ig×10 d into rats decreased thrombosis and fibrinogen level of blood plasma(P<0.01)，the kaolin partial thrombin time was prolonged(P<0.01).These can conclusion that the GLPS of Ganoderma lucidum possessed the anticancer，antithrombosis and anticoagulation effects.
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Key words Polysaccharide of Ganoderma lucidum，Anticancer，Antithrombosis，Anticoagulation
灵芝[赤芝，Ganoderma Lucidum(Leyys.ex Fr)Karst]为一种灵芝属的真菌。中国历代医家视为滋补强壮，扶正固本，延年益寿之珍品 。灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，具有多种的生理活性。本文主要对灵芝多糖抗肿瘤、抗血栓和抗凝血方面的作用进行研究。
1 材 料
1.1 药品与试剂 灵芝子实体购自三明真菌研究所；5-氟尿嘧啶注射液(5-FU)为上海旭东海普药业有限公司产品，批号971006；环磷酰胺(CPM)为上海华联制药公司产品，批号960102；冻干凝血酶、凝血活酶及部分凝血活酶均为上海医大华山医院技协试剂公司的产品，批号99035；纤维蛋白测定酸性缓冲液为宁波市慈城生化试剂厂生产，批号980819；5-腺苷二磷酸二钠盐(ADP)为上海伯奥生物科技有限公司产品。其它试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.2 动物 昆明种小鼠体重为18～22 g，Wistar种大鼠体重为300±20 g ，雌雄兼用，均由福建医科大学实验动物中心提供。
1.3 瘤株 小鼠肉瘤(S180)、宫颈癌(U14)及艾氏腹水癌(EAC)均自上海中国科学院药物研究所引进，在福建医科大学蛇毒所传代使用。
1.4 仪器 多功能双通道血液凝聚仪，电脑血浆纤维蛋白原测定仪，MR-4型多环血栓检测仪均为上海高机应用技术研究所产品；80-2型离心机为上海手术器械厂生产；7520型分光光度计为上海分析仪器厂生产；TG729C单盘电光分析天平为上海天平仪器厂生产。
2 方法和结果
, 百拇医药
2.1 灵芝多糖的提取及含量测定
2.1.1 提取流程[1]
2.1.2 含量测定(2,3) 以葡萄糖为标准品，配制不同浓度(10～80 μg.ml-1)的标准液。分别吸取1 ml标准液置于10 ml具塞比色管中，加入1 ml 5%苯酚和5 ml浓硫酸，摇匀反应20 min，于487 nm处测其吸收值。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸收值为纵坐标，制取标准曲线并求其回归方程，结果见表1。表1 葡萄糖标准液标准曲线的制备
管号
0
1
2
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3
4
5
6
葡萄糖浓度
(μg.ml-1)
0
10
20
40
50
60
80
, 百拇医药
葡萄糖标准液(ml)
0
1
1
1
1
1
1
5%苯酚(ml)
1
1
1
1
1
, 百拇医药
1
1
浓硫酸(ml)
5
5
5
5
5
5
5
A487 nm
0
0.175
, 百拇医药
0.262
0.427
0.519
0.648
0.795
称取各批灵芝多糖粗品10 mg，配成0.1 mg .ml-1的水溶液作为供试液，各取1 ml依上法测其吸收值(5批GLPS粗品的A487 nm分别为0.697，0.682，0.670，0.656，0.671)，代入回归方程，求出灵芝多糖的含量及提取率，结果(见表2)。表2 灵芝多糖粗品中灵芝多糖的含量及提取率
批号
1
, 百拇医药 2
3
4
5
灵芝子实体干重(g)
335
376
416
255
274
灵芝多糖粗品(g)
3.00
3.11
, 百拇医药
3.20
3.12
3.42
灵芝多糖含量(%)
68.0
66.3
65.0
63.4
65.1
灵芝多糖提取率(%)
0.609
0.548
0.500
, 百拇医药
0.476
0.813
葡萄糖标准液标准曲线的回归方程：
y＝0.085+0.0090x(r＝0.9978)
2.2 灵芝多糖的抗肿瘤作用(4,5)
2.2.1 灵芝多糖对实体型移植瘤小鼠瘤块生长的影响 每次实验用同一性别小鼠，随机分为3组：生理盐水(NS)组、灵芝多糖(GLPS))组和5-氟尿嘧啶(5-FU)组或环磷酰胺(CPM)组。GLPS组提前灌胃(ig)40 mg/(kg.d)1周后，给各组小鼠接种瘤块。在无菌条件下，从荷瘤10～14 d、S180或U14瘤块生长良好的小鼠采取并切成直径2 mm～3 mm的瘤块，用套管针将其种入小鼠右侧腋窝皮下。接种后GLPS组继续给药10 d，5-FU组腹腔注射(ip)5-FU 20 mg.kg-1 4次或CPM组ip CPM 50 mg.kg-1 2次，隔日一次，NS组ig同一体积的生理盐水。于停药后处死小鼠，剥下皮下瘤块并称重，按下式计算抑瘤率。灵芝多糖对小鼠S180和U14的平均抑瘤率分别为43%和51%，灵芝多糖组的平均瘤重明显轻于NS组(P<0.01)，结果(见表3及图1和表4及图2)。
表3 灵芝多糖灌胃对小鼠肉瘤(S180)生长的影响(n＝10，±S), 百拇医药
药物
剂量
(mg/kg.d×d)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
P值
第一次
NS
-
1.4±0.4
-
, http://www.100md.com
-
GLPS
40×17
0.8±0.2
40
<0.01
5-FU
20×4
0.9±0.4
21
>0.05
第二次
NS
, http://www.100md.com
-
2.4±0.9
-
-
GLPS
40×17
1.2±0.7
47
<0.01
5-FU
20×4
1.8±0.6
24
, 百拇医药
>0.05
第三次
NS
-
2.8±0.8
-
-
GLPS
40×17
1.6±0.4
42
<0.01
CPM
, 百拇医药
50×2
0.2±0.2
93
<0.001
表4 灵芝多糖灌胃对小鼠宫颈癌(U14)生长的影响(n＝10，
±S)药物
剂量
(mg/kg.d×d)
瘤重
(g)
, 百拇医药
抑瘤率
(%)
P值
第一次
NS
-
3.8±1.1
-
-
GLPS
40×17
1.9±0.7
49
, 百拇医药
<0.01
5-FU
20×4
2.4±1.8
36
<0.01
第二次
NS
-
3.8±1.0
-
-
GLPS
, 百拇医药
40×17
2.4±0.9
40
<0.01
CPM
50×2
0.1±0.6
97
<0.001
第三次
NS
-
4.0±0.9
, 百拇医药
-
-
GLPS
40×17
2.3±0.9
44
<0.01
CPM
50×2
0.5±0.5
88
<0.001
第四次
, 百拇医药
NS
-
3.6±1.0
-
-
GLPSⅠ
40×17
1.8±0.5
50
<0.01
GLPSⅡ
80×17
1.7±0.4
, 百拇医药
52
<0.01
CPM
50×2
1.2±0.4
67
<0.01
图1 灵芝多糖灌胃对小鼠肉瘤(S180)生长的影响
, http://www.100md.com
图2 灵芝多糖灌胃对小鼠宫颈瘤(U14)生长的影响
2.2.2 灵芝多糖对腹水型移植瘤的小鼠存活时间的影响 每次实验用同一性别 小鼠，随机分为3组：(NS)组、灵芝多糖(GLPS)组和环磷酰胺(CPM)组。GLPS组提前灌胃(ig)40 mg/(kg.d)1周后。在无菌条件下，取接种7～8 d生长良好的艾氏腹水癌(EAC)制成1∶4肿瘤细胞生理盐水混悬液，给每只小鼠接种0.2 ml。接种后GLPS组继续给药10 d，CPM组ip CPM 50 mg.kg-1 2次，隔日1次，NS组ig同一体积的生理盐水。于停药后观察每只小鼠的生存天数，按下式计算生命延长率。实验重复3次，与NS组比较40 mg.kg-1的GLPS没有明显延长小鼠的生命(P>0.05)，平均生命延长率为15%，结果(见表5)。
生命延长率＝(给药动物平均存活天数/对照动物平均存活天数-1)×100%
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表5 灵芝多糖灌胃对艾氏腹水癌(EAC)小鼠存活时间的影响(n＝10)
药物
剂量
(mg/kg.d×d)
小鼠生存
天数
±S生命延长率
(%)
P值
第一次
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NS
-
12.5±1.3
-
-
GLP
40×17
13.9±0.7
11
>0.05
CPM
50×2
15.9±1.8
, 百拇医药
28
<0.01
第二次
NS
-
11.8±1.5
-
-
GLP
40×17
13.8±1.0
17
>0.05
, http://www.100md.com
CPM
50×2
15.1±2.9
27
<0.01
第三次
NS
-
11.8±1.6
-
-
GLP
40×17
, 百拇医药
13.9±1.7
18
>0.05
CPM
50×2
16.0±1.7
36
<0.01
2.3 灵芝多糖对小鼠全血凝血时间及出血时间的影响
2.3.1 灵芝多糖对小鼠全血出血时间的影响(6) 取小鼠50只，随机分为4组，GLPS组和一组NS组。GLPS组Ⅰ GLPS 20 mg/(kg.d).ig×10 d。NS组ig同体积的生理盐水。GLPS组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别GLPS 40、30、20 mg.kg-1.iv后1 h，用利剪将小鼠距尾尖3 mm处剪断，待血自行溢出时开始计量，每隔30 S用滤纸吸去血滴一次，直至血流停止(以滤纸吸至无血迹时为准)计算出血时间，所得数据与NS组进行显著性检验。结果表明：灵芝多糖能明显延长小鼠的出血时间(P<0.01)，(见表6)。表6 灵芝多糖对小鼠凝血和出血时间的影响(n＝10，
±S), 百拇医药
组别
药物剂量及途径
(mg/kg.d)
出血时间
(s)
凝血时间
(s)
NS组
-
185±74
75±22
GLPS组Ⅰ
40×10.ig
, 百拇医药
872±46**
172±43**
GLPS组Ⅱ
40.iv
780±50**
116±27**
GLPS组Ⅲ
30.iv
720±40**
115±15**
GLPS组Ⅳ
, 百拇医药
20.iv
720±40**
108±14**
与NS组比较，**：P<0.01
2.3.2 灵芝多糖对小鼠全血凝血时间的影响(7) 取测定出血时间的各组小鼠，用弯镊迅速摘去一侧眼球，于载玻片两端各滴1滴直径5 mm的血滴。立即用秒表记时，每隔一定时间用清洁针头自血滴边缘向里轻轻挑动1次，观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝为止，所历时间即为凝血时间。另取1滴血作为正常凝血情况判别对照。记录各小鼠的凝血时间，进行显著性检验。结果表明：灵芝多糖能显著延长小鼠的凝血时间(P<0.01)，(见表6)。
2.4 灵芝多糖对大鼠血栓形成及血液凝固系统的影响。
, 百拇医药
取大鼠20只，随机分成NS组、GLPS组。GLPS组ig GLPS 40 mg/(kg.d)×10 d，NS组ig同体积的生理盐水。给药10 d后，用20%乌拉坦按0.5 ml.100 g-1体重ip麻醉后，打开大鼠胸腔，暴露心脏采血3 ml，其中0.5 ml直接用MR-4型多环血栓测定仪测定血栓长度和湿重(Chandler氏法)。另2.5 ml血加入0.3 ml(按9∶1)枸橼酸钠(3.8%)混匀，100 RPM离心5 min，吸取0.1 ml富血小板血浆(PRP)于特制的小试管中，用多功能双通道血液凝聚仪测定血小板数目。再以3000 RPM离心10 min，吸取0.1 ml贫血小板血浆(PPP)，加入相应的酶试剂后，用多功能双通道血液凝聚仪分别检测凝血活酶时间(PT)、凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(KPTT)。另在小试管中加入2 ml纤维蛋白原酸性缓冲液和0.1 ml PPP，混匀，置入电脑血浆纤维蛋白原测定仪测定纤维蛋白原含量。结果表明：灵芝多糖能明显减少大鼠血栓的长度和湿度(P<0.01)，并降低纤维蛋白原含量(P<0.01)，明显延长KPTT时间(P<0.01)(见图3)。
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图3 灵芝多糖(40 mg/kg.d.ig×10 d)对大鼠血液凝固系统的影响
3 讨论
灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，我们用水提、醇沉法提取灵芝多糖，并经透析除去分子量1万以下的成分，得到灵芝多糖粗品。以上实验结果说明：灵芝多糖具有抗肿瘤、抗血栓及抗凝血的作用。本所实验证明GLPS对试管培养的癌细胞无直接杀伤作用，故灵芝多糖抗肿瘤作用可能是通过增强机体免疫功能而实现的[8～10]。灵芝多糖能降低纤维蛋白原含量，减弱部分凝血活酶的活性使其影响内源性凝血途径，并能抗血栓和抗凝血，其机理尚待探讨。
作者单位：杨亮(福建中医学院中药系实习生 350003)；王素香(福建中医学院中药系实习生 350003)；林珉弘(福建中医学院中药系实习生 350003)
参考文献
, 百拇医药
[1]何云庆等，灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究 北京医科大学学报 1989；21(3)：225～227
[2]Dubois M，et al：colarmetric method for defermination of sugars and related substances，Anal Chem，1956，28：350～352
[3]方积年：多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定 药学通报 1984；19(1)：622～625
[4]潘启超等：肿瘤药理学及化学治疗学，广州，广东高等教育出版社，1989；
[5]李连达：抗癌中药的药效学研究技术要求 中药新药与临床药理 1992；392)：6
[6]徐叔云等主编：药理学实验方法学，第二版，北京，人民卫生出版社，1991；1991；481
[7]陈奇主编：中药药理研究方法学，第一版，北京，人民卫生出版社，1991；481
[8]雷林生等：灵芝多糖对抗环孢霉A、氢化可的松及抗肿瘤药的免疫抑制作用 中国药理学与毒理学杂志 1993；7：183
[9]雷林生等：灵芝多糖对老年小鼠脾细胞DNA多聚酶a活性及免疫功能的影响 药学学报 1993；28(2)：577～582
[10]曹容华等：灵芝多糖抗肿瘤作用的机理研究 山东医科大学学报 1992；30(3)：203～206, http://www.100md.com