两种蚯蚓及其不同部位的酶谱研究
作者：易八贤 徐丽姗 曾漪青 李国风 何执中
单位：易八贤 李国风 何执中(中国药科大学，南京210009)；徐丽姗(浙江师范大学，金华321004)；曾漪青(江苏省淡水水产研究所，南京210017)
关键词：蚯蚓；电泳；纤溶酶；酯酶；乳酸脱氢酶
摘 要 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析赤子爱胜蚓
摘 要 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)和秉代环毛蚓(Pheretima carnosa)不同部位的纤溶酶、酯酶及乳酸脱氢酶酶谱。纤溶酶主要存在于蚯蚓的体腔内。不同蚯蚓的纤溶酶酶谱不同。酯酶酶谱在两种蚯蚓及不同部位差异很大。蚯蚓的乳酸脱氢酶较弱。
Studies on the Enzymes from Different Species
, 百拇医药
Earthworm and Different Parts of the Earthworm
Yi Baxian, Xu Lishan1， Zeng Yiqing2， Li Guofeng， He Z hizhong
(Department of Biochemistry China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,1Department of Biology,Zhejiang Normal University Jinhua， 321004，2Freshwater Fisheries Research institute of Jiangsu Province，Nanjing 210 017)
Abstract The paper reports the analysis of three enzymes(EST,LDH ,Fibrinolytic Enzyme) fro m two species earthworm and two parts of the earthworm by means of discontinuou s polyacrylamide gelelectrophoresis.The results showed that fibrinolytic enzyme exists in the earthworm body cavity,furthermore can reflect the specificity of species.The EST is different in the two species and two parts of the species.The LDH activity is lower in the earthworm.
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Key Words Earthworm, Isoenzyme, Fibrinolytic enzyme, Esterase(EST), Lactate dehydrogenase(LDH), Electrophoresis
蚯蚓俗称地龙，自古为常用中药。近年来，特别是发现了它具有纤溶活性后，对蚯蚓的实验研究和临床研究愈来愈广泛、深入[1～4]。
蚯蚓的纤溶作用受到人们的高度重视。关于该酶的分离纯化及性质研究报道很多。也有人用寡毛纲部分动物的酯酶(EST)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶来鉴定物种、研究其系统发生。本文研究了两种蚯蚓及其两个部位的蛋白电泳谱、纤溶酶谱、酯酶谱及乳酸脱氢酶谱[5～7]。
1 材料与仪器
正蚓科爱胜蚓属赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)南京农业大学饲养场；巨蚓科环毛蚓属秉氏环毛蚓(Pheretima carnosa)中国药科大学校园野生；垂直板电泳仪(Dyy-Ⅰ型)，北京六一仪器厂。
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2 方 法
2.1 样品制备
分别取成熟的赤子爱胜蚓和秉氏环毛蚓洗净、拭干，分离体壁及内容物。内容物加适量冷生理盐水研磨后离心，上清液稀释10倍备用。体壁用水洗净后，加2倍冷生理盐水研磨，离心取上清液备用。
2.2 电泳及显色
采用PAGE垂直板电泳方式，高pH不连续系统。分离胶浓度为10%，交联度2.5%，电极液为pH8.7的Tris-甘氨酸缓冲液，加样25μl/孔，电压280V，电流10mA，电泳时间3h。
蛋白质染色，EST显色，LDH显色方法参照文献[8]。纤溶酶酶谱参照文献[9]。
3 结 果
, 百拇医药 3.1 蛋白电泳。
蛋白电泳图谱见图1。图1显示样1、样3各有20多条带，且多分布在偏正极一侧，提示蚯蚓体腔内容物含可溶性蛋白种类多，相对分子质量较小，泳动快。而样3、样4各有10多条带，密集分布于负极一侧，提示蚯蚓体壁所含可溶性蛋白相对较少，相对分子质量较体腔内容物者大。
1，2.Eisenia foetida body wall and body cavity
3，4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
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Fig 1 The protein electropheregram of two species earthworm
3.2 纤溶酶酶谱
纤溶酶酶谱见图2。图2样2、样4不显纤溶酶带。提示蚯蚓体壁不含纤溶酶。样1含6条纤溶酶带。样3除含与样1相似的6条酶带外。增加了2条酶带。其中1条相当在样1全部酶带的正极一侧，可见相对分子质量偏小。另一条相当在样1之第4与第5酶带之间。
1,2.Eisenia foetida body wall and body cavity
, 百拇医药
3,4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
Fig 2 The fibrinolytic enzyme isoenzyme
electropheregram of two species earthw orm
3.3 酯酶酶谱
酯酶酶谱见图3。其中样1的酶带最多，以迁移率最高者为先，依次有A、B、C、D、E、F6条色带。而样2只有对应的B、C、D及泳动略快于F的F1共4条色带。样3除含有对应的C、F带外还具有略慢于A的A1带和略快于F的F2带共4条酶带。样4则仅含有对应的B带及略慢于F的F3带，只2条酶带。可见赤子爱胜蚓与秉氏环毛蚓酯酶酶谱差异较大。前者酯酶相对较丰富，提示二者亲缘关系较远。蚯蚓体壁中酯酶也不及体腔内容物丰富。
, 百拇医药
1,2.Eisenia foetida body wall and body cavity
3,4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
Fig 3 The EST isoenzyme electropheregram of two species earthworm
3.4 乳酸脱氢酶
电泳后显色，仅样2和样4各显1条很弱的色带。样1和样3则不显色。这与文献报道相符。LDH多存在于肌肉组织中，体腔内容物中几乎不存在。脊椎动物之LDH研究报道较多，而无脊椎动物之LDH研究较少[6，7]。
4 讨 论
蚯蚓纤溶酶的研究报道很多，但到目前为止尚未见有纤溶酶谱的描述。本文试验结果显示赤子爱胜蚓有6种纤溶酶组分，这与多数文献的有关描述相似，秉氏环毛蚓所含的纤溶酶组分达8种之多，有可能成为该类酶产品的新资源。此外，结果还提示：蚯蚓纤溶酶仅存在于蚯蚓体腔内容物中，所以在提取时可先分离出内容物。这样做不但可避免多量杂蛋白被带入，从而简化分离纯化过程，而且便于蚯蚓资源的综合利用。由于秉氏环毛蚓个体比赤子爱胜蚓大许多倍，体壁的利用较方便也更有价值。
, 百拇医药
作者简介：易八贤，中国药科大学1989届毕业生；
参考文献
1 金鸣.蚯蚓溶栓作用研究进展.中草药，1994，25(1)：45
2 路英华，金汝成，吴应文，等.钜齿远蚓纤溶酶的分离纯化及其若干性质.生物化学杂志，1988，4(2)：166
3 徐建民，张国桢，陈松鹤，等.赤子爱胜蚓纤维蛋白溶解酶的亲和层析纯化和生化特性.上海医科大学学报，1991，18(4)：252
4 Nakajima N,Mihara H，Sumi H.Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm Lumbricus rubellus.Biosci Biotech Biochem，1993，57(10)∶1726
, http://www.100md.com
5 尚雅珍，许文娜.酯酶同工酶在分析亚洲玉米螺抗药性中的应用.生物化学与生 物物理进展，1990，17(2)：131
6 谭竹钧，韩雅莉.正蚓科三属七种动物同工酶研究.内蒙古大学学报(自然科学 版)，1996，27(1)：111
7 许智芳.三种水栖寡毛纲EST、LDH和MDH同工酶电泳的研究.南京大学学报(自然 科学版)1991，27(4)：738
8 徐秀兰主编.生物化学实验与指导.北京：中国医药科技出 版社，1994.201
9 Astrup T,Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic a ctivity.Arch Biochem Biophys，1952，40∶346
收稿日期：1998-01-15, http://www.100md.com
单位：易八贤 李国风 何执中(中国药科大学，南京210009)；徐丽姗(浙江师范大学，金华321004)；曾漪青(江苏省淡水水产研究所，南京210017)
关键词：蚯蚓；电泳；纤溶酶；酯酶；乳酸脱氢酶
摘 要 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析赤子爱胜蚓
摘 要 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)和秉代环毛蚓(Pheretima carnosa)不同部位的纤溶酶、酯酶及乳酸脱氢酶酶谱。纤溶酶主要存在于蚯蚓的体腔内。不同蚯蚓的纤溶酶酶谱不同。酯酶酶谱在两种蚯蚓及不同部位差异很大。蚯蚓的乳酸脱氢酶较弱。
Studies on the Enzymes from Different Species
, 百拇医药
Earthworm and Different Parts of the Earthworm
Yi Baxian, Xu Lishan1， Zeng Yiqing2， Li Guofeng， He Z hizhong
(Department of Biochemistry China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,1Department of Biology,Zhejiang Normal University Jinhua， 321004，2Freshwater Fisheries Research institute of Jiangsu Province，Nanjing 210 017)
Abstract The paper reports the analysis of three enzymes(EST,LDH ,Fibrinolytic Enzyme) fro m two species earthworm and two parts of the earthworm by means of discontinuou s polyacrylamide gelelectrophoresis.The results showed that fibrinolytic enzyme exists in the earthworm body cavity,furthermore can reflect the specificity of species.The EST is different in the two species and two parts of the species.The LDH activity is lower in the earthworm.
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Key Words Earthworm, Isoenzyme, Fibrinolytic enzyme, Esterase(EST), Lactate dehydrogenase(LDH), Electrophoresis
蚯蚓俗称地龙，自古为常用中药。近年来，特别是发现了它具有纤溶活性后，对蚯蚓的实验研究和临床研究愈来愈广泛、深入[1～4]。
蚯蚓的纤溶作用受到人们的高度重视。关于该酶的分离纯化及性质研究报道很多。也有人用寡毛纲部分动物的酯酶(EST)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶来鉴定物种、研究其系统发生。本文研究了两种蚯蚓及其两个部位的蛋白电泳谱、纤溶酶谱、酯酶谱及乳酸脱氢酶谱[5～7]。
1 材料与仪器
正蚓科爱胜蚓属赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)南京农业大学饲养场；巨蚓科环毛蚓属秉氏环毛蚓(Pheretima carnosa)中国药科大学校园野生；垂直板电泳仪(Dyy-Ⅰ型)，北京六一仪器厂。
, http://www.100md.com
2 方 法
2.1 样品制备
分别取成熟的赤子爱胜蚓和秉氏环毛蚓洗净、拭干，分离体壁及内容物。内容物加适量冷生理盐水研磨后离心，上清液稀释10倍备用。体壁用水洗净后，加2倍冷生理盐水研磨，离心取上清液备用。
2.2 电泳及显色
采用PAGE垂直板电泳方式，高pH不连续系统。分离胶浓度为10%，交联度2.5%，电极液为pH8.7的Tris-甘氨酸缓冲液，加样25μl/孔，电压280V，电流10mA，电泳时间3h。
蛋白质染色，EST显色，LDH显色方法参照文献[8]。纤溶酶酶谱参照文献[9]。
3 结 果
, 百拇医药 3.1 蛋白电泳。
蛋白电泳图谱见图1。图1显示样1、样3各有20多条带，且多分布在偏正极一侧，提示蚯蚓体腔内容物含可溶性蛋白种类多，相对分子质量较小，泳动快。而样3、样4各有10多条带，密集分布于负极一侧，提示蚯蚓体壁所含可溶性蛋白相对较少，相对分子质量较体腔内容物者大。
1，2.Eisenia foetida body wall and body cavity
3，4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
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Fig 1 The protein electropheregram of two species earthworm
3.2 纤溶酶酶谱
纤溶酶酶谱见图2。图2样2、样4不显纤溶酶带。提示蚯蚓体壁不含纤溶酶。样1含6条纤溶酶带。样3除含与样1相似的6条酶带外。增加了2条酶带。其中1条相当在样1全部酶带的正极一侧，可见相对分子质量偏小。另一条相当在样1之第4与第5酶带之间。
1,2.Eisenia foetida body wall and body cavity
, 百拇医药
3,4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
Fig 2 The fibrinolytic enzyme isoenzyme
electropheregram of two species earthw orm
3.3 酯酶酶谱
酯酶酶谱见图3。其中样1的酶带最多，以迁移率最高者为先，依次有A、B、C、D、E、F6条色带。而样2只有对应的B、C、D及泳动略快于F的F1共4条色带。样3除含有对应的C、F带外还具有略慢于A的A1带和略快于F的F2带共4条酶带。样4则仅含有对应的B带及略慢于F的F3带，只2条酶带。可见赤子爱胜蚓与秉氏环毛蚓酯酶酶谱差异较大。前者酯酶相对较丰富，提示二者亲缘关系较远。蚯蚓体壁中酯酶也不及体腔内容物丰富。
, 百拇医药
1,2.Eisenia foetida body wall and body cavity
3,4.Pheretima carnosa body wall and body cavity
Fig 3 The EST isoenzyme electropheregram of two species earthworm
3.4 乳酸脱氢酶
电泳后显色，仅样2和样4各显1条很弱的色带。样1和样3则不显色。这与文献报道相符。LDH多存在于肌肉组织中，体腔内容物中几乎不存在。脊椎动物之LDH研究报道较多，而无脊椎动物之LDH研究较少[6，7]。
4 讨 论
蚯蚓纤溶酶的研究报道很多，但到目前为止尚未见有纤溶酶谱的描述。本文试验结果显示赤子爱胜蚓有6种纤溶酶组分，这与多数文献的有关描述相似，秉氏环毛蚓所含的纤溶酶组分达8种之多，有可能成为该类酶产品的新资源。此外，结果还提示：蚯蚓纤溶酶仅存在于蚯蚓体腔内容物中，所以在提取时可先分离出内容物。这样做不但可避免多量杂蛋白被带入，从而简化分离纯化过程，而且便于蚯蚓资源的综合利用。由于秉氏环毛蚓个体比赤子爱胜蚓大许多倍，体壁的利用较方便也更有价值。
, 百拇医药
作者简介：易八贤，中国药科大学1989届毕业生；
参考文献
1 金鸣.蚯蚓溶栓作用研究进展.中草药，1994，25(1)：45
2 路英华，金汝成，吴应文，等.钜齿远蚓纤溶酶的分离纯化及其若干性质.生物化学杂志，1988，4(2)：166
3 徐建民，张国桢，陈松鹤，等.赤子爱胜蚓纤维蛋白溶解酶的亲和层析纯化和生化特性.上海医科大学学报，1991，18(4)：252
4 Nakajima N,Mihara H，Sumi H.Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm Lumbricus rubellus.Biosci Biotech Biochem，1993，57(10)∶1726
, http://www.100md.com
5 尚雅珍，许文娜.酯酶同工酶在分析亚洲玉米螺抗药性中的应用.生物化学与生 物物理进展，1990，17(2)：131
6 谭竹钧，韩雅莉.正蚓科三属七种动物同工酶研究.内蒙古大学学报(自然科学 版)，1996，27(1)：111
7 许智芳.三种水栖寡毛纲EST、LDH和MDH同工酶电泳的研究.南京大学学报(自然 科学版)1991，27(4)：738
8 徐秀兰主编.生物化学实验与指导.北京：中国医药科技出 版社，1994.201
9 Astrup T,Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic a ctivity.Arch Biochem Biophys，1952，40∶346
收稿日期：1998-01-15, http://www.100md.com