离子对红细胞流变特性的影响及其微观机制分析
作者：姚伟娟 谢利德 喀蔚波 文宗曜
单位：北京医科大学物理教研室(北京 100083)
关键词：
北京生物医学工程990415 在人体的各种组织细胞中，钙离子都发挥着重要的作用。在正常情况下，人的红细胞通过钙泵(Ca2+-Mg2+)ATP酶使细胞内的Ca2+保持在0.1～1μM的低浓度[1]。在血液循环中产生的剪切应力会造成Ca2+的内流使胞内钙浓度增加，在红细胞的衰老过程中也会产生Ca2+的聚集：使用预先形成的梯度，并在取消粘度影响的情况下对Percoll密度梯度方法分离的最上部和最下部的7%～10%红细胞亚群(subpopulation)作分析，发现最轻的(认为是“年轻”红细胞)和最重的细胞(认为是“年老”红细胞)中自由Ca2+浓度分别为8.4±2.82nM和31.2±13.0nM[2]，这种钙的随年龄的聚集会对红细胞的流变特性产生影响。在实验中，利用CaCl2和钙离子载体A23187处理可以使红细胞内钙浓度增加[3-9]，进而研究Ca2+引起的一系列复杂的生物化学变化，来揭示钙对红细胞流变特性影响的微观机制。本文将综述近年来钙离子对红细胞流变特性的影响及机制分析的研究情况。
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1 钙离子对红细胞流变特性的影响
当介质Ca2+浓度高于200μM并用A23187处理红细胞时，增加了的胞内Ca2+浓度会使红细胞从双凹圆盘形向棘状改变[6]，同时细胞的表面积也减小[7]。当细胞内Ca2+浓度在0～10μM之间时，红细胞表面的剪切弹性模量(μ)和表面粘度(η)分别增加20%和70%[8]，并且红细胞在剪切力下变形部分的恢复时间有所减慢[9]。
许多学者用不同的方法研究了Ca2+引起的红细胞变形能力的改变。Shiga等人[3]利用流变仪(rheoscope)测量了人的红细胞的变形能力，它可作为ATP没有完全衰竭和没有完全棘状变形的红细胞的胞内Ca2+浓度的一个函数。他们发现：(1)用Ca2+处理完整红细胞(钙含量：16.8μmol/l packed cells)，红细胞的体积和表面电荷逐渐减少，膜脂流动性降低，但是没有膜蛋白的交联(cross-linking)。(2)用流变仪观察了红细胞的变形性受其Ca2+含量的影响：在140dyn/cm2的剪切力下，当红细胞Ca2+含量为40～50μmol/l packed cells时，约有50%的红细胞发生明显的变形，而当Ca2+含量为100μmol/l packed cells时，大于90%的红细胞不能变形。(3)在用Ca2+处理之后，用密度梯度离心把不可变形细胞作为高密度细胞分离出来，它们比低密度的可变形细胞表现出较低的G6PD活性。因此，胞内Ca2+浓度高的不可变形红细胞可能在体内是衰老细胞。(4)用密度梯度离心将年轻细胞和衰老细胞分离，并用Ca2+处理时，发现年轻细胞能较好地保持它们的体积和变形能力。另外，有的学者利用激光衍射法(ektacytometer)[10，11]也发现红细胞内Ca2+浓度增加后它们的变形能力下降这一事实。
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在1992年，Friederichs和他的同事[4]通过细胞过滤分析仪(Cell Transit Analyzer, CTA)来测定红细胞和血影对5μm直径孔的滤过时间，由此确定它们的变形能力。他们用10μMA23187和自体血浆来提高红细胞内的Ca2+浓度，研究了Ca2+的通透性与膜连接的血红蛋白(Hbm)的关系以及对红细胞变形能力的影响。突出的结果包括：(1)在离子载体A23187处理后或随着溶血介质中Ca2+浓度的增加，红细胞和血影的Hbm水平显著升高，同时它们的变形能力下降，Hbm与红细胞或血影的滤过时间之间显著线性相关(P<0.2或更好)，(2)对应于CTA滤过时间分布直方图中较高百分率的红细胞(即滤过时间较长的红细胞)，它们对离子载体处理/膜连结血红蛋白敏感性增加。Friederichs和Meiselman[5]在1994年又用相同的方法进行了研究，结果表明：Hbm和红细胞平均硬度之间呈正线性相关，使用不同浓度的Ca2+介质处理红细胞，发现不同亚群红细胞的Hbm水平和流变特性受Ca2+的影响显著不同：“年轻”的细胞不被A23187的处理所影响，而“年老”的细胞却表现出细胞硬度的增加。这些发现证明了血红蛋白-膜相互作用作为红细胞变形能力的一个决定因素的重要性，而且它可能与红细胞衰老有关，也可能与镰刀形细胞贫血、遗传性球形红细胞症和地中海贫血有关。
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Sumihare Noji等人[1]使用电子顺磁共振(EPR)自旋标记的方法研究了Ca2+引起的红细胞变形能力的丢失。由于已证明了悬浮介质流动前后电子顺磁共振谱的变化与细胞变形和取向的能力紧密相关[1]，因此可以用标准强度差Δh/h来估计细胞的变形和取向(h,Δh分别为静态时EPR谱中央峰的高度和流动时它的改变量)。当细胞在Ca2+(30μM)介质中孵育时，在加入A23187后35min，Δh/h在0.1ml/s的流速下下降到0.11，表明细胞变得变形减少也相应地较少取向。Tadahiro oonishi等人[13]使用一种镍网过滤法(nickel mesh filtration method)研究了红细胞在含有Ca2+的介质中受机械剪切后变形能力(滤过能力)的变化。他们发现在形态和体积不发生变化的情况下红细胞变形能力的降低表现出一种依赖细胞外Ca2+浓度的V状曲线，并且在～50μM处变形能力减少得最多。并且Ca2+通道抑制剂nifedipine和felodipine可以抑制由机械剪切力引起的红细胞滤过能力的降低。这表明：滤过能力的改变可以归因于红细胞膜特性的改变。
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2 钙离子对红细胞流变特性影响的微观机制
从上述现象可以看出，钙离子对红细胞的流变特性有复杂的影响，其中最主要的影响是使红细胞的变形能力或滤过能力下降，而研究Ca2+引起的红细胞变形能力的下降对于研究在体内红细胞衰老后的清除具有重要的意义。红细胞的变形能力一般由下列因素决定：(a)膜和细胞膜骨架的物理特性，如弹性；(b)胞浆的状态，如粘度，血红蛋白的浓度和聚集；(c)细胞的几何特性，如形态，细胞表面积与体积之比(s/v)[1]。Chien Shu曾指出，Ca2+是通过影响许多变形的决定因素而对红细胞变形能力产生复杂的影响[7]，也即：Ca2+通过与红细胞的膜脂、膜蛋白相互作用使细胞的膜特性、胞浆状态和细胞形态发生变化，引起红细胞变形能力等流变特性的改变。
2.1 钙离子对红细胞胞浆的影响
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有许多研究者认为Ca2+引起的红细胞变形能力的下降主要是由于Gardos效应造成的，即：Ca2+激活了红细胞膜上的K+通道，使K+和水外流，红细胞脱水从而内粘度增加[1，3，7]，并且他们为此作了实验来证明。Sumihare Noji等人[1]用EPR自旋标记得到随Ca2+处理时间的增加Δh/h降低的结果，同时发现平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)与Δh/h呈反相变化(即：MCHC逐渐增加)，并且在高K+介质(140mM，存在Na+)中，当存在Ca2+载体时并没有观察到Δh/h的减少，也没看到MCHC的增加，因此对于Ca2+聚集的红细胞变形能力的损失可以由Gardos效应来解释。Takeshi Shiga等人[3]也发现了红细胞内Ca2+的聚集引起的平均细胞体积的减小和血红蛋白的浓缩(即MCHC的增加)，他们将这归于Ca2+引起的细胞脱水。
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2.2 钙离子对红细胞膜脂的影响
许多学者都证明了Ca2+的进入(loading)确实引起红细胞形态和膜脂组成的变化。Chandra和他的同事[14]使用bee venom、胰腺磷脂酶A2，以Merocyamine 540和fluorescamine作为外部的膜探针来分析增加的胞浆Ca2+水平对膜脂组成的影响。在对照细胞中大约20%的磷脂酰乙醇胺(PE)和0%的磷脂酰丝氨酸(PS)被磷脂酶水解，然而在Ca2+处理后的红细胞中这种酶依赖于胞浆Ca2+浓度很容易降解20%～30%PE和7%～30%PS，而且Merocyamine 540不能染对照的红细胞，但却能标记Ca2+处理的细胞，同时fluorescamine在对照细胞中标记了大约20%PE，而在Ca2+处理的细胞中被修饰的PE量显著增加。Sansan Lin等人[15]研究了在Ca2+-钝锯齿形和恢复的红细胞中磷脂分布与形状改变的关系。对于细胞内Ca2+引起的细胞钝锯齿化，使用放射性标记的二月桂酸磷脂的类似物(DLPL)，他们观察到了红细胞膜上PS和PE的外翻，同时有磷脂酰胆碱(PC)的向内叶扩散，在EGTA除去Ca2+之后，暴露的PS又重新分布到膜的内叶，但随机化分布的PC和PE并没有重新恢复到它们原来的状态。Ute Henseleit等人[16]用10μMA23187和0.05～0.5mMCa2+处理红细胞，结果使插在膜外叶的探针MPPC和palmitoylcamitine向内叶翻转(flip-flop)，并依赖于Ca2+和A23187的浓度而加速。若用EDTA除去Ca2+，它们可以被逆转回来。用磷脂酶A2检测到在Ca2+处理之后的5min，内叶的PS就迅速暴露在外叶。这些结果都说明：Ca2+会引起红细胞跨双层膜磷脂不对称性的丢失。Ca2+改变膜脂双层的原因主要有：(i)Ca2+可能通过与脂双层的直接作用来引起磷脂的重新分布：Sansan Lin[15]证明：Ca2+引起的红细胞钝锯齿化的恢复独立于膜骨架和PI的代谢，其它Ca2+介导的生物化学变化如二酰基甘油和脂肪酸的产生对于Ca2+钝锯齿形或它的恢复后任何磷脂的跨膜分布没有影响。(ii)Ca2+引起膜骨架的不稳定，并减弱了磷脂与膜骨架的相互作用[14]。(iii)目前最新发现红细胞膜上有一种分子量为35KDa的膜蛋白phospholipid scramblase可以激活重组的蛋白脂囊泡中PS和其它磷脂的依赖Ca2+的跨膜运动[17，18]。另外，Ca2+引起红细胞膜变形为棘状后，进一步会使红细胞释放微囊泡，使细胞的表面积减小[16，19]。
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2.3 钙离子对红细胞膜蛋白的影响
众所周知，红细胞的骨架蛋白在调节膜的物理特性中发挥着重要的作用。蛋白分子间或分子内变化了的相互作用可能对细胞膜变形能力产生深刻的影响。胞内Ca2+浓度增加也会使红细胞膜蛋白发生许多变化：(i)膜蛋白的聚集增加。Anderson等人[20]早在1977年就发现，在Ca2+浓度高的介质中分离出的红细胞膜的多肽发生许多显著的变化，包括：多肽聚集的形成，分子量为85，000(Ⅳa)成分的丢失，分子量180，000(Ⅱ)成分的形成，并且用酶的激活剂或抑制剂的实验证明了聚集的形成与Ⅳa的丢失与胞浆的酶：转谷胱酰胺酶的活性紧密相关，Ⅱ的形成发生是膜连结蛋白酶的活化或释放的结果，另外，还发现Ca2+处理后，红细胞收缩蛋白的一部分不能用EDTA从膜中提取出来，而未处理过的细胞膜的收缩蛋白几乎全部被提取。(ii)Ca2+使某些酶如转谷胱酰胺酶和蛋白酶激活，进而水解一些膜蛋白[12，21].Laszlo Lorand等人[22]通过交叉的免疫电泳技术检测发现，除了引起γ-glutamyl-ε-lysine交联的多聚体形成之外，A23187和Ca2+(1.5，2μM)会引起人红细胞的两个主要跨膜蛋白：阴离子通道带3蛋白和血型糖蛋白的明显的蛋白水解现象。带3裂解的主要产物为一个重量约为55，000的链，而且表现出与抗完整蛋白的抗体很好的沉淀反应。血型糖蛋白的降解更加迅速，而且当结束时，产生小的片段，这些小片段很少与抗血型糖蛋白的抗体发生沉淀反应。将细胞在Ca2+处理之前和过程中与pepstain或N-ethylmaleimide孵育可以阻止两种跨膜蛋白的分解，组胺也有一些保护作用，这表明两种跨膜蛋白的分解可能在某些方式上与依赖转谷胱酰胺酶的聚合作用过程有关。另外他们还指出，这种蛋白水解可以干扰膜蛋白与骨架的正常的相互作用。Jacauelline 等人[23]研究了在Ca2+引起的人的红细胞形态改变过程中的细胞骨架的蛋白水解作用，特别是锚蛋白(ankyrin)和带4.1蛋白水解的速度和程度，并且发现它们并不影响形态改变的速度。
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Wallis等人[24]研究了收缩蛋白与Ca2+的相互作用。在作SDS-PAGE之后发现：红细胞的收缩蛋白二聚体和分离的α-，β-收缩蛋白链都结合45Ca2+。流动透析和平衡透析揭示出收缩蛋白有Ca2+特异的高亲和力结合位点(Kd=4×10-7M，每个二聚体有n=100±20个)和一个低亲和力的二价阳离子结合位点。除了可能的收缩蛋白与依赖Ca2+的蛋白酶和肌动蛋白(actin)之间的相互作用，红细胞收缩蛋白的每个重复部分的大约两个高亲和力位点似乎可以稳定它的折叠构象。自旋标记研究表明：Ca2+减少收缩蛋白的表面电荷，引起分子的收缩，圆二色谱(CD)实验进一步说明：收缩蛋白二级结构的改变与Ca2+与该蛋白的连接有关，特别是它获得了转折结构(turns)，这样增加了分子的折叠和收缩，提高了内部张力，使得红细胞对形变和损伤更有抵抗力。至于在Ca2+介质中受机械剪切力后引起的红细胞滤过能力的降低，可能是由于机械剪切激活了红细胞膜上的Ca2+通道而使胞内Ca2+浓度瞬间增高[13]，也可能是Ca2+通过高亲和力结合位点与收缩蛋白结合，而这通过增加收缩蛋白“弹簧”的内部张力来对抗生理变形[24]。
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另外，人们很久以来就推测红细胞变形能力由两个主要的胞内信号传导系统来调节。Tadahiro oonishi等人[13]对此进行了验证：他们发现前列腺素PGE1和pentoxifylline改善红细胞在Ca2+介质中受机械剪切力而减小的滤过能力，PGE2却加剧滤过能力的减小，肾上腺素(epinephrine)对于减少的滤过能力有一种双相影响。PGE1，PGE2，epinephrine和pentoxifylline被认为可调节cAMP的水平，根据它们对红细胞的cAMP水平的预期作用，以及它们改善或加剧滤过能力的减少，这些结果有力地证明了调节红细胞变形能力的膜特性被信号系统：包括依赖Ca2+和cAMP-介导的信号通路所影响。而这些通路可能激活相互作用的激酶和磷酸酶，这引起膜骨架中关键蛋白的磷酸化和去磷酸化，并调节红细胞的滤过能力。Giampaolo Minetti与他的同事[25]确实观察到了带3蛋白的tyrosine的磷酸化。
综上所述，Ca2+引起的红细胞变形能力的下降的主要原因是：(i)由于Ca2+引起红细胞膜骨架网络的结构改变和脂双层组成的改变，使膜脂流动性减小；(ii)红细胞表面积与体积比的改变(膜成分的减少，细胞形态的改变)；(iii)Gardos效应和Hb的聚集使细胞内粘度增加；(iv)Ca2+引起膜蛋白的水解、聚集、交叉连接等结构改变使红细胞膜机械特性发生变化[3]。
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作者简介：姚伟娟(1976-)，女，硕士研究生。
参考文献
1 Sumihare Noji, Shigehiko Taniguchi and Hideo Kon.Spin label stydy of erythrocyte deformability Ca2+-induced loss of deformability and the effects of stomatocytogenic reagents on the deformability loss in human erythrocytes in shear flow. Biophys J, 1987, 52:221
2 Romero P J, Romero E A, Moraima D, et al. Ionic calcium content of light dense human red cells separated by peroll desity gradients. Biochem Biophys Acta, 1997,1323:23
, http://www.100md.com
3 Takeshi Shiga, Misuzu Sekiya, et al. Cell age-dependent changes in deformability and calcium accumulation of human erythrocytes. Biochem Biophys Acta, 1985,814:289
4 Friederichs E, Farley R A and Meiselman H J. Influence of calcium permeabilization and membrane-attached hemoglobin on erythrocyte deformability. Am J Hemato, 1992,41:170
5 Friederichs E and Meiselman H J. Effects of calcium permeabilization on RBC rheologic behaviro. Biorheology, 1994,31(2):207
, http://www.100md.com
6 Anderson RA and Lovrien R E. Erythrocyte membrane sideness in lectin cotrol of the Ca2+-A23187-mediated discocyte
echinocyte conversion. Nature, 1981,292:158
7 Shu Chien. Red cell deformability and its relevance to blood flow. Ann Rev Physiol, 1987,49:177
8 Shields M,Lacelle P, et al. Effects of intracellular Ca2+ and proteolytic of the membrane skeleton on mechanical properties of the red blood cell membrane. Biochem Biophys Acta, 1987, 943:181
, 百拇医药
9 Eaton J W, et al. Anion channel blockade: Effects upon erythrocyte membrane calcium response. Am J Heatol, 1980,9:391
10 Clark M R, Mohandas N, Shohet S B. Separate mechanisms of deformability loss in ATP-depleted and caloaded erythrocytes. J Clin Invest, 1981, 67:531
11 Heath B P, Mohandas N, Wyatt J L, et al. Deformability of isolated red blood cell membranes. Biochem Biophys Acta, 1982,691:211
, 百拇医药
12 Dorothy E, et al. Limited proteolysis of the erythrocyte membrane skeleton by calcium-dependent proteinases. Biochem Biophys Acta, 1986,882:287
13 Tadahiro Oonishi, Kanako Sakashita, and Nobuhiro Uyesaka. Regulation of red blood cell filterability by Ca2+ influx and cAMP-mediated signaling pathways. Am J Physiol, 1997,273:C1828
14 Chandra R, et al. Membrane phospholipid organization in calcium-loaded human erythrocytes. Biochem Biophys Acta, 1987,902:253
, 百拇医药
15 Sansan Lin ,Eungyeong Yang and Huestis WH. Relationship of phospholipid distribution to shape change in Ca2+-crenated and recovered human erythrocytes. Biochemistry, 1994,33:7337
16 Ute Henseleit, Gisela Plasa and Cees Hest. Effects of divalent cations on lipid flip-flop in the human erythrocyte membrane. Biochem Biophys Acta, 1990,1029:127
17 Zhao J,et al. Level of expression of phospholipid scramblase rugulates induced movement of phosphatidylserine to cell surface. J Biol Chem, 1988,273:6603
, 百拇医药
18 Zhou Q, et al. Identity of a conserved motif in phospholipid scramblase that is required for Ca2+ accelerated transbilayer movement of membrane phospholipids. Biochemistry, 1998,37(8):2356
19 Allan D and Michell RH. Accumulation of 1,2-diacylglycerol in the plasma membrane may lead to echinocyte transformation of erythrocytes. Nature,1975,258：348
20 Anderson D R, Davis J L, and Carraway K L. Calcium-promoted changes of the human erythrocyte membrane. J Biolo Chemi, 1977,19:6617
, 百拇医药
21 King L E Jr and Martin Morrison. Calcium effects on human erythrocyte membrane proteins. Biochem Biophys Acta, 1977,471:162
22 Laszlo Lorand, et al. Degradation of transmembrane proteins in Ca2+-enriched human erythrocytes. J Biolo Chemi, 1983,258:5300
23 Jacaueline L, et al. Cytoskeletal proteolysis during Ca2+-induced morphological transition of human erythrocytes. Exp cell, 1992,200:316
, http://www.100md.com
24 Wallis C J, Babitch J A, and Wenegieme E F. Divalent cation binding to erythrocyte spectrin. Biochemistry, 1993,32:5045
25 Giampaolo Minetti, et al. Tryosine phosphorylation of band 3 protein Ca2+/A23187-treated human erythrocytes. Biochem J, 1996,320:445
(1998-10-14收稿，1998-11-16修回), http://www.100md.com
单位：北京医科大学物理教研室(北京 100083)
关键词：
北京生物医学工程990415 在人体的各种组织细胞中，钙离子都发挥着重要的作用。在正常情况下，人的红细胞通过钙泵(Ca2+-Mg2+)ATP酶使细胞内的Ca2+保持在0.1～1μM的低浓度[1]。在血液循环中产生的剪切应力会造成Ca2+的内流使胞内钙浓度增加，在红细胞的衰老过程中也会产生Ca2+的聚集：使用预先形成的梯度，并在取消粘度影响的情况下对Percoll密度梯度方法分离的最上部和最下部的7%～10%红细胞亚群(subpopulation)作分析，发现最轻的(认为是“年轻”红细胞)和最重的细胞(认为是“年老”红细胞)中自由Ca2+浓度分别为8.4±2.82nM和31.2±13.0nM[2]，这种钙的随年龄的聚集会对红细胞的流变特性产生影响。在实验中，利用CaCl2和钙离子载体A23187处理可以使红细胞内钙浓度增加[3-9]，进而研究Ca2+引起的一系列复杂的生物化学变化，来揭示钙对红细胞流变特性影响的微观机制。本文将综述近年来钙离子对红细胞流变特性的影响及机制分析的研究情况。
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1 钙离子对红细胞流变特性的影响
当介质Ca2+浓度高于200μM并用A23187处理红细胞时，增加了的胞内Ca2+浓度会使红细胞从双凹圆盘形向棘状改变[6]，同时细胞的表面积也减小[7]。当细胞内Ca2+浓度在0～10μM之间时，红细胞表面的剪切弹性模量(μ)和表面粘度(η)分别增加20%和70%[8]，并且红细胞在剪切力下变形部分的恢复时间有所减慢[9]。
许多学者用不同的方法研究了Ca2+引起的红细胞变形能力的改变。Shiga等人[3]利用流变仪(rheoscope)测量了人的红细胞的变形能力，它可作为ATP没有完全衰竭和没有完全棘状变形的红细胞的胞内Ca2+浓度的一个函数。他们发现：(1)用Ca2+处理完整红细胞(钙含量：16.8μmol/l packed cells)，红细胞的体积和表面电荷逐渐减少，膜脂流动性降低，但是没有膜蛋白的交联(cross-linking)。(2)用流变仪观察了红细胞的变形性受其Ca2+含量的影响：在140dyn/cm2的剪切力下，当红细胞Ca2+含量为40～50μmol/l packed cells时，约有50%的红细胞发生明显的变形，而当Ca2+含量为100μmol/l packed cells时，大于90%的红细胞不能变形。(3)在用Ca2+处理之后，用密度梯度离心把不可变形细胞作为高密度细胞分离出来，它们比低密度的可变形细胞表现出较低的G6PD活性。因此，胞内Ca2+浓度高的不可变形红细胞可能在体内是衰老细胞。(4)用密度梯度离心将年轻细胞和衰老细胞分离，并用Ca2+处理时，发现年轻细胞能较好地保持它们的体积和变形能力。另外，有的学者利用激光衍射法(ektacytometer)[10，11]也发现红细胞内Ca2+浓度增加后它们的变形能力下降这一事实。
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在1992年，Friederichs和他的同事[4]通过细胞过滤分析仪(Cell Transit Analyzer, CTA)来测定红细胞和血影对5μm直径孔的滤过时间，由此确定它们的变形能力。他们用10μMA23187和自体血浆来提高红细胞内的Ca2+浓度，研究了Ca2+的通透性与膜连接的血红蛋白(Hbm)的关系以及对红细胞变形能力的影响。突出的结果包括：(1)在离子载体A23187处理后或随着溶血介质中Ca2+浓度的增加，红细胞和血影的Hbm水平显著升高，同时它们的变形能力下降，Hbm与红细胞或血影的滤过时间之间显著线性相关(P<0.2或更好)，(2)对应于CTA滤过时间分布直方图中较高百分率的红细胞(即滤过时间较长的红细胞)，它们对离子载体处理/膜连结血红蛋白敏感性增加。Friederichs和Meiselman[5]在1994年又用相同的方法进行了研究，结果表明：Hbm和红细胞平均硬度之间呈正线性相关，使用不同浓度的Ca2+介质处理红细胞，发现不同亚群红细胞的Hbm水平和流变特性受Ca2+的影响显著不同：“年轻”的细胞不被A23187的处理所影响，而“年老”的细胞却表现出细胞硬度的增加。这些发现证明了血红蛋白-膜相互作用作为红细胞变形能力的一个决定因素的重要性，而且它可能与红细胞衰老有关，也可能与镰刀形细胞贫血、遗传性球形红细胞症和地中海贫血有关。
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Sumihare Noji等人[1]使用电子顺磁共振(EPR)自旋标记的方法研究了Ca2+引起的红细胞变形能力的丢失。由于已证明了悬浮介质流动前后电子顺磁共振谱的变化与细胞变形和取向的能力紧密相关[1]，因此可以用标准强度差Δh/h来估计细胞的变形和取向(h,Δh分别为静态时EPR谱中央峰的高度和流动时它的改变量)。当细胞在Ca2+(30μM)介质中孵育时，在加入A23187后35min，Δh/h在0.1ml/s的流速下下降到0.11，表明细胞变得变形减少也相应地较少取向。Tadahiro oonishi等人[13]使用一种镍网过滤法(nickel mesh filtration method)研究了红细胞在含有Ca2+的介质中受机械剪切后变形能力(滤过能力)的变化。他们发现在形态和体积不发生变化的情况下红细胞变形能力的降低表现出一种依赖细胞外Ca2+浓度的V状曲线，并且在～50μM处变形能力减少得最多。并且Ca2+通道抑制剂nifedipine和felodipine可以抑制由机械剪切力引起的红细胞滤过能力的降低。这表明：滤过能力的改变可以归因于红细胞膜特性的改变。
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2 钙离子对红细胞流变特性影响的微观机制
从上述现象可以看出，钙离子对红细胞的流变特性有复杂的影响，其中最主要的影响是使红细胞的变形能力或滤过能力下降，而研究Ca2+引起的红细胞变形能力的下降对于研究在体内红细胞衰老后的清除具有重要的意义。红细胞的变形能力一般由下列因素决定：(a)膜和细胞膜骨架的物理特性，如弹性；(b)胞浆的状态，如粘度，血红蛋白的浓度和聚集；(c)细胞的几何特性，如形态，细胞表面积与体积之比(s/v)[1]。Chien Shu曾指出，Ca2+是通过影响许多变形的决定因素而对红细胞变形能力产生复杂的影响[7]，也即：Ca2+通过与红细胞的膜脂、膜蛋白相互作用使细胞的膜特性、胞浆状态和细胞形态发生变化，引起红细胞变形能力等流变特性的改变。
2.1 钙离子对红细胞胞浆的影响
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有许多研究者认为Ca2+引起的红细胞变形能力的下降主要是由于Gardos效应造成的，即：Ca2+激活了红细胞膜上的K+通道，使K+和水外流，红细胞脱水从而内粘度增加[1，3，7]，并且他们为此作了实验来证明。Sumihare Noji等人[1]用EPR自旋标记得到随Ca2+处理时间的增加Δh/h降低的结果，同时发现平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)与Δh/h呈反相变化(即：MCHC逐渐增加)，并且在高K+介质(140mM，存在Na+)中，当存在Ca2+载体时并没有观察到Δh/h的减少，也没看到MCHC的增加，因此对于Ca2+聚集的红细胞变形能力的损失可以由Gardos效应来解释。Takeshi Shiga等人[3]也发现了红细胞内Ca2+的聚集引起的平均细胞体积的减小和血红蛋白的浓缩(即MCHC的增加)，他们将这归于Ca2+引起的细胞脱水。
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2.2 钙离子对红细胞膜脂的影响
许多学者都证明了Ca2+的进入(loading)确实引起红细胞形态和膜脂组成的变化。Chandra和他的同事[14]使用bee venom、胰腺磷脂酶A2，以Merocyamine 540和fluorescamine作为外部的膜探针来分析增加的胞浆Ca2+水平对膜脂组成的影响。在对照细胞中大约20%的磷脂酰乙醇胺(PE)和0%的磷脂酰丝氨酸(PS)被磷脂酶水解，然而在Ca2+处理后的红细胞中这种酶依赖于胞浆Ca2+浓度很容易降解20%～30%PE和7%～30%PS，而且Merocyamine 540不能染对照的红细胞，但却能标记Ca2+处理的细胞，同时fluorescamine在对照细胞中标记了大约20%PE，而在Ca2+处理的细胞中被修饰的PE量显著增加。Sansan Lin等人[15]研究了在Ca2+-钝锯齿形和恢复的红细胞中磷脂分布与形状改变的关系。对于细胞内Ca2+引起的细胞钝锯齿化，使用放射性标记的二月桂酸磷脂的类似物(DLPL)，他们观察到了红细胞膜上PS和PE的外翻，同时有磷脂酰胆碱(PC)的向内叶扩散，在EGTA除去Ca2+之后，暴露的PS又重新分布到膜的内叶，但随机化分布的PC和PE并没有重新恢复到它们原来的状态。Ute Henseleit等人[16]用10μMA23187和0.05～0.5mMCa2+处理红细胞，结果使插在膜外叶的探针MPPC和palmitoylcamitine向内叶翻转(flip-flop)，并依赖于Ca2+和A23187的浓度而加速。若用EDTA除去Ca2+，它们可以被逆转回来。用磷脂酶A2检测到在Ca2+处理之后的5min，内叶的PS就迅速暴露在外叶。这些结果都说明：Ca2+会引起红细胞跨双层膜磷脂不对称性的丢失。Ca2+改变膜脂双层的原因主要有：(i)Ca2+可能通过与脂双层的直接作用来引起磷脂的重新分布：Sansan Lin[15]证明：Ca2+引起的红细胞钝锯齿化的恢复独立于膜骨架和PI的代谢，其它Ca2+介导的生物化学变化如二酰基甘油和脂肪酸的产生对于Ca2+钝锯齿形或它的恢复后任何磷脂的跨膜分布没有影响。(ii)Ca2+引起膜骨架的不稳定，并减弱了磷脂与膜骨架的相互作用[14]。(iii)目前最新发现红细胞膜上有一种分子量为35KDa的膜蛋白phospholipid scramblase可以激活重组的蛋白脂囊泡中PS和其它磷脂的依赖Ca2+的跨膜运动[17，18]。另外，Ca2+引起红细胞膜变形为棘状后，进一步会使红细胞释放微囊泡，使细胞的表面积减小[16，19]。
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2.3 钙离子对红细胞膜蛋白的影响
众所周知，红细胞的骨架蛋白在调节膜的物理特性中发挥着重要的作用。蛋白分子间或分子内变化了的相互作用可能对细胞膜变形能力产生深刻的影响。胞内Ca2+浓度增加也会使红细胞膜蛋白发生许多变化：(i)膜蛋白的聚集增加。Anderson等人[20]早在1977年就发现，在Ca2+浓度高的介质中分离出的红细胞膜的多肽发生许多显著的变化，包括：多肽聚集的形成，分子量为85，000(Ⅳa)成分的丢失，分子量180，000(Ⅱ)成分的形成，并且用酶的激活剂或抑制剂的实验证明了聚集的形成与Ⅳa的丢失与胞浆的酶：转谷胱酰胺酶的活性紧密相关，Ⅱ的形成发生是膜连结蛋白酶的活化或释放的结果，另外，还发现Ca2+处理后，红细胞收缩蛋白的一部分不能用EDTA从膜中提取出来，而未处理过的细胞膜的收缩蛋白几乎全部被提取。(ii)Ca2+使某些酶如转谷胱酰胺酶和蛋白酶激活，进而水解一些膜蛋白[12，21].Laszlo Lorand等人[22]通过交叉的免疫电泳技术检测发现，除了引起γ-glutamyl-ε-lysine交联的多聚体形成之外，A23187和Ca2+(1.5，2μM)会引起人红细胞的两个主要跨膜蛋白：阴离子通道带3蛋白和血型糖蛋白的明显的蛋白水解现象。带3裂解的主要产物为一个重量约为55，000的链，而且表现出与抗完整蛋白的抗体很好的沉淀反应。血型糖蛋白的降解更加迅速，而且当结束时，产生小的片段，这些小片段很少与抗血型糖蛋白的抗体发生沉淀反应。将细胞在Ca2+处理之前和过程中与pepstain或N-ethylmaleimide孵育可以阻止两种跨膜蛋白的分解，组胺也有一些保护作用，这表明两种跨膜蛋白的分解可能在某些方式上与依赖转谷胱酰胺酶的聚合作用过程有关。另外他们还指出，这种蛋白水解可以干扰膜蛋白与骨架的正常的相互作用。Jacauelline 等人[23]研究了在Ca2+引起的人的红细胞形态改变过程中的细胞骨架的蛋白水解作用，特别是锚蛋白(ankyrin)和带4.1蛋白水解的速度和程度，并且发现它们并不影响形态改变的速度。
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Wallis等人[24]研究了收缩蛋白与Ca2+的相互作用。在作SDS-PAGE之后发现：红细胞的收缩蛋白二聚体和分离的α-，β-收缩蛋白链都结合45Ca2+。流动透析和平衡透析揭示出收缩蛋白有Ca2+特异的高亲和力结合位点(Kd=4×10-7M，每个二聚体有n=100±20个)和一个低亲和力的二价阳离子结合位点。除了可能的收缩蛋白与依赖Ca2+的蛋白酶和肌动蛋白(actin)之间的相互作用，红细胞收缩蛋白的每个重复部分的大约两个高亲和力位点似乎可以稳定它的折叠构象。自旋标记研究表明：Ca2+减少收缩蛋白的表面电荷，引起分子的收缩，圆二色谱(CD)实验进一步说明：收缩蛋白二级结构的改变与Ca2+与该蛋白的连接有关，特别是它获得了转折结构(turns)，这样增加了分子的折叠和收缩，提高了内部张力，使得红细胞对形变和损伤更有抵抗力。至于在Ca2+介质中受机械剪切力后引起的红细胞滤过能力的降低，可能是由于机械剪切激活了红细胞膜上的Ca2+通道而使胞内Ca2+浓度瞬间增高[13]，也可能是Ca2+通过高亲和力结合位点与收缩蛋白结合，而这通过增加收缩蛋白“弹簧”的内部张力来对抗生理变形[24]。
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另外，人们很久以来就推测红细胞变形能力由两个主要的胞内信号传导系统来调节。Tadahiro oonishi等人[13]对此进行了验证：他们发现前列腺素PGE1和pentoxifylline改善红细胞在Ca2+介质中受机械剪切力而减小的滤过能力，PGE2却加剧滤过能力的减小，肾上腺素(epinephrine)对于减少的滤过能力有一种双相影响。PGE1，PGE2，epinephrine和pentoxifylline被认为可调节cAMP的水平，根据它们对红细胞的cAMP水平的预期作用，以及它们改善或加剧滤过能力的减少，这些结果有力地证明了调节红细胞变形能力的膜特性被信号系统：包括依赖Ca2+和cAMP-介导的信号通路所影响。而这些通路可能激活相互作用的激酶和磷酸酶，这引起膜骨架中关键蛋白的磷酸化和去磷酸化，并调节红细胞的滤过能力。Giampaolo Minetti与他的同事[25]确实观察到了带3蛋白的tyrosine的磷酸化。
综上所述，Ca2+引起的红细胞变形能力的下降的主要原因是：(i)由于Ca2+引起红细胞膜骨架网络的结构改变和脂双层组成的改变，使膜脂流动性减小；(ii)红细胞表面积与体积比的改变(膜成分的减少，细胞形态的改变)；(iii)Gardos效应和Hb的聚集使细胞内粘度增加；(iv)Ca2+引起膜蛋白的水解、聚集、交叉连接等结构改变使红细胞膜机械特性发生变化[3]。
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作者简介：姚伟娟(1976-)，女，硕士研究生。
参考文献
1 Sumihare Noji, Shigehiko Taniguchi and Hideo Kon.Spin label stydy of erythrocyte deformability Ca2+-induced loss of deformability and the effects of stomatocytogenic reagents on the deformability loss in human erythrocytes in shear flow. Biophys J, 1987, 52:221
2 Romero P J, Romero E A, Moraima D, et al. Ionic calcium content of light dense human red cells separated by peroll desity gradients. Biochem Biophys Acta, 1997,1323:23
, http://www.100md.com
3 Takeshi Shiga, Misuzu Sekiya, et al. Cell age-dependent changes in deformability and calcium accumulation of human erythrocytes. Biochem Biophys Acta, 1985,814:289
4 Friederichs E, Farley R A and Meiselman H J. Influence of calcium permeabilization and membrane-attached hemoglobin on erythrocyte deformability. Am J Hemato, 1992,41:170
5 Friederichs E and Meiselman H J. Effects of calcium permeabilization on RBC rheologic behaviro. Biorheology, 1994,31(2):207
, http://www.100md.com
6 Anderson RA and Lovrien R E. Erythrocyte membrane sideness in lectin cotrol of the Ca2+-A23187-mediated discocyte
echinocyte conversion. Nature, 1981,292:1587 Shu Chien. Red cell deformability and its relevance to blood flow. Ann Rev Physiol, 1987,49:177
8 Shields M,Lacelle P, et al. Effects of intracellular Ca2+ and proteolytic of the membrane skeleton on mechanical properties of the red blood cell membrane. Biochem Biophys Acta, 1987, 943:181
, 百拇医药
9 Eaton J W, et al. Anion channel blockade: Effects upon erythrocyte membrane calcium response. Am J Heatol, 1980,9:391
10 Clark M R, Mohandas N, Shohet S B. Separate mechanisms of deformability loss in ATP-depleted and caloaded erythrocytes. J Clin Invest, 1981, 67:531
11 Heath B P, Mohandas N, Wyatt J L, et al. Deformability of isolated red blood cell membranes. Biochem Biophys Acta, 1982,691:211
, 百拇医药
12 Dorothy E, et al. Limited proteolysis of the erythrocyte membrane skeleton by calcium-dependent proteinases. Biochem Biophys Acta, 1986,882:287
13 Tadahiro Oonishi, Kanako Sakashita, and Nobuhiro Uyesaka. Regulation of red blood cell filterability by Ca2+ influx and cAMP-mediated signaling pathways. Am J Physiol, 1997,273:C1828
14 Chandra R, et al. Membrane phospholipid organization in calcium-loaded human erythrocytes. Biochem Biophys Acta, 1987,902:253
, 百拇医药
15 Sansan Lin ,Eungyeong Yang and Huestis WH. Relationship of phospholipid distribution to shape change in Ca2+-crenated and recovered human erythrocytes. Biochemistry, 1994,33:7337
16 Ute Henseleit, Gisela Plasa and Cees Hest. Effects of divalent cations on lipid flip-flop in the human erythrocyte membrane. Biochem Biophys Acta, 1990,1029:127
17 Zhao J,et al. Level of expression of phospholipid scramblase rugulates induced movement of phosphatidylserine to cell surface. J Biol Chem, 1988,273:6603
, 百拇医药
18 Zhou Q, et al. Identity of a conserved motif in phospholipid scramblase that is required for Ca2+ accelerated transbilayer movement of membrane phospholipids. Biochemistry, 1998,37(8):2356
19 Allan D and Michell RH. Accumulation of 1,2-diacylglycerol in the plasma membrane may lead to echinocyte transformation of erythrocytes. Nature,1975,258：348
20 Anderson D R, Davis J L, and Carraway K L. Calcium-promoted changes of the human erythrocyte membrane. J Biolo Chemi, 1977,19:6617
, 百拇医药
21 King L E Jr and Martin Morrison. Calcium effects on human erythrocyte membrane proteins. Biochem Biophys Acta, 1977,471:162
22 Laszlo Lorand, et al. Degradation of transmembrane proteins in Ca2+-enriched human erythrocytes. J Biolo Chemi, 1983,258:5300
23 Jacaueline L, et al. Cytoskeletal proteolysis during Ca2+-induced morphological transition of human erythrocytes. Exp cell, 1992,200:316
, http://www.100md.com
24 Wallis C J, Babitch J A, and Wenegieme E F. Divalent cation binding to erythrocyte spectrin. Biochemistry, 1993,32:5045
25 Giampaolo Minetti, et al. Tryosine phosphorylation of band 3 protein Ca2+/A23187-treated human erythrocytes. Biochem J, 1996,320:445
(1998-10-14收稿，1998-11-16修回), http://www.100md.com