新疆维、汉两民族载脂蛋白E基因多态性及其与血脂关系的研究
作者：王新利 王国荃 徐臻荣 肖碧玉 张桂芝 姜瑞
单位：王新利 王国荃 肖碧玉(830054乌鲁木齐，新疆医学院环境卫生学教研室)；徐臻荣(新疆医学院营养卫生学教研室)；张栏芝 姜瑞(新疆医学院保健科)
关键词：
中华医学遗传学杂志990219 载脂蛋白E(ApoE)是血浆中乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)及中间密度脂蛋白(IDL)与肝脏ApoE受体或ApoB.E受体结合的连接物，在调节血脂和脂蛋白在体内代谢方面起着非常重要的作用[1]。ApoE是由人类第19号染色体长臂上的1个基因位点的3个常见等位基因所编码，由于具有共显性遗传的特点，人群中有6种不同的基因型，相对应的也有6种表型，3种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和3种杂合子(E2/4,E2/3,E3/4)[2]。编码ApoE的3种常见等位基因的相对频率存在明显的种族差异。新疆是多民族聚集区，已有研究表明新疆不同民族间血脂水平存在一定差异[3]，但不同民族间ApoE等位基因相对频率的分布差异及其与血脂的关系均尚无报道。为此我们对新疆维族及汉族人群的ApoE基因多态性采用聚合酶连反应结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法进行了测定，并对两民族ApoE基因多态性与血脂的关系进行了对比分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 对象 新疆乌鲁木齐市健康献血员，年龄20～35岁，维吾尔族163名，男81名，女82名；汉族150名，男女各半。全部受检者均进行了ApoE基因分型，其中101名维吾尔族，140名汉族作了血脂测定。
1.2 方法
1.2.1 ApoE基因型检测 全部受试者采早晨空腹肘静血，ACD抗凝血0.5ml，非抗凝血3ml(用于测量血脂)。(1)取ACD抗凝血，采用蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，异丙醇沉淀DNA。75%乙醇漂洗2遍，DNA溶于200μl TE(pH=8.0)中。(2)引物按Emi等[4]报道设计。F4为5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGCTACA-C-3′，F6为5′-TAAGCTTGGCACGGCT-GTCCAAGGA-3′。(3)DNA扩增：PCR反应体积50μl，含10×Buffer5μl，4×dNTP200μmol，引物各25pmol，基因组DNA约0.5μg及10%DMSO。首先96℃预变性10分钟，而后加入2U Taq酶(华美公司提供)，按94℃变性40秒，复性61℃40秒，延伸71℃1分钟，循环30次(DNA Amplier, BoiRad GenecyclerTM)，最后1个循环72℃延伸5分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射灯下进行检测，在244bp处出现荧光带，为特异性PCR产物(图1)。(4)限制性内切酶酶切PCR产物：PCR扩增产物中加入10UHhaⅠ(Promega公司产品)，37℃酶切4小时，酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶浓度为8%，于200V恒压下垂直电泳3小时(电泳仪为BioRad Power/DAC3000)，0.5μg/ml溴乙啶中染色30分钟。紫外线透射灯下观察结果(图2)。纯合子E2/2在91bp和83bp出现荧光条带；E3/3在91bp和48bp出现荧光条带；E4/4在72bp和48bp出现荧光条带。杂合子E4/2出现91bp、83bp、72bp和48bp条带；E3/2出现91bp、83bp和48bp条带；E4/3出现91bp，72bp和48bp条带。
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图1 PCR扩增ApoE 第4外显子中的部分片段 1～6是PCR产物；M是PCR marker 图2 Hha Ⅰ酶切ApoE PCR产物的实验图 1～6分别代表基因型E4/4、E4/2、E4/2、E3/2、E2/2、E3/3；M为PGEM-72f(+)/Hae111DNA参数
1.2.2 血脂测定按WHO“Monica”方案统一要求标准化方法。用Boehringer Mannheim公司提供的标准酶试剂盒，分别测定TC、TG及HDL-C，LDL-C按Friedewald公式计算(LDL-C=TC-HDL-C-1/5TG)。全部测定工作使用美国TECHNTON RA-2000全自动生化分析仪，由新疆自治区临床检验中心完成。该中心血脂测定质控检验合格。
1.2.3 统计分析 基因频率的计算，按Hardy-Weinberg equilibrium计算，等位基因频率比较采用χ2检验，不同基因型间血脂的比较用方差分析。所有统计工作均在COMPAQ586计算机上用SAS软件分析完成。
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2 结果
2.1 维、汉两民族ApoE基因型和等位基因频率分布见表1。
表1 维吾尔族和汉族ApoE基因型及等位基因频率分布比较 基因型
汉 族
(n=150)
维 族
(n=163)
4/4
2
1
4/3
16
, 百拇医药
42
4/2
3
1
3/3
109
104
3/2
18
14
2/2
2
1
等位基因频率
, 百拇医药
ε4
0.077
0.138
ε3
0.840
0.810
ε2
0.083
0.052
注：基因型分布情况进行χ2检验时，将含有ε4的E4/4、E4/3、E4/2合并为一组，含有ε2的E3/2与E/2合并为一组。基因型χ2=8.661，df=2，P=0.013，基因频率χ2=7.979，df=2，P=0.019
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如表1所示在基因型分析中两民族均以E3/3型最常见，但在维吾尔族中E3/4次之，而在汉族为E3/2次之，两组比较存在统计学差异。在3种等位基因频率分布上维、汉两民族也存在统计学差异，其中维吾尔族ε4等位基因频率高于汉族(χ2=6.296,P<0.05)。
2.2 将维、汉两民族血脂检测值按ApoE不同等位基因分为ε2携带组(E2/2、E3/2)、ε3纯合组(E3/3)、ε4携带组(E4/4、E4/3)进行分析，其结果见表2、表3，不论维吾尔族还是汉族均以ε4携带组TC及LDL-C最高，ε3携带组居中，ε2携带组最低。三组比较存在统计学差异，其他测定值无明显差异。
表2 维吾尔族ApoE不同等位基因血脂、脂蛋白比较
ε2
n=8
, 百拇医药 ε3
n=68
ε4
n=25
F
P
TG
1.29±0.40
1.21±0.50
1.27±0.53
0.19
0.828
TC
, 百拇医药
4.10±0.89
4.31±0.70
4.73±0.80
3.55
0.032
HDL-C
1.32±0.27
1.26±0.30
1.23±0.30
0.27
0.760
LDL-C
, http://www.100md.com
2.50±0.89
2.81±0.68
3.18±0.84
3.36
0.039
表3 汉族ApoE不同等位基因血脂、脂蛋白比较
ε2
n=20
ε3
n=99
ε4
n=18
, http://www.100md.com
F
P
TG
1.20±0.36
1.12±0.38
1.18±0.35
0.503
0.606
TC
4.07±0.69
4.22±0.74
4.75±0.61
, http://www.100md.com 5.041
0.007
HDL-C
1.30±0.27
1.24±0.24
1.33±0.30
1.25
0.290
LDL-C
2.53±0.66
2.80±0.60
3.17±0.66
, 百拇医药
5.14
0.007
3 讨论
正常人群中ApoE的6种基因型分布不匀等，以 E3/3 发生频率最高，超过50%，含ε3的杂合子(E4/3，E3/2)居中，E2/2、E4/4和E2/4发生频率最低。因此一般认为等位基因ε3为野生型，ε2，ε4是发生在两个不同部位单一核苷酸突变的结果[4，5]。近年来，世界范围内大样本群体调查发现ApoE基因型分布在欧美高加索人种以E3/3为最常见，其次为E3/4。而亚洲蒙古人种虽以E3/3为最常见，但其次为E2/3[1，2]。我们的研究结果显示，150名汉族ApoE基因型分布与亚洲蒙古人种相似，而163名维吾尔族ApoE基因型分布与高加索人相似，以E3/3为最常见，其次为E3/4。
等位基因频率分布也存在明显种族差异，ε3等位基因的相对频率高加索一般低于0.79，亚洲(蒙古人种)多高于0.82。而ε4等位基因的相对频率高加索人则高于亚洲蒙古人种[1，2]。我们的研究结果显示，维吾尔 族的ApoE基因多态性介于高加索人种和蒙古人种(汉族)之间。
, 百拇医药
近年来，对来自不同国家、不同人群的研究发现[2，6-8]，在血脂正常的人群中，不同ApoE表型者的血浆TC、LDL-C水平高低依次是E4E4>E4E3>E3E3>E3E2>E2E2。这种ApoE表型影响个体间血浆TC、LDL-C的作用并不受环境和其他遗传背景的干扰。我们的研究结果显示尽管维、汉两民族在ApoE 3种等位基因频率分布上存在明显差异，但是由3种等位基因所编码出的3种主要异构体对血脂的影响，维、汉两民族表现出相同的趋势，也证实ApoE表型对血脂的影响不受环境和其它遗传背景的干扰这一结论。
关于不同ApoE表型间体内血脂差异的原因，目前认为可能与ApoE不同异构体间它们的受体结合活性及自身在体内代谢速率存在明显差异有关[1，5]。不仅如此，近年来研究还发现ApoE表型不同对肠道的胆固醇吸收率也存在明显差异[9，10]。ApoE 4携带者，小肠吸收胆固醇增加。所以，ApoE 4携带者采用饮食疗法治疗高脂血症获益最明显。
, 百拇医药
本课题由新疆科委重点科研基金(95908)资助
参考文献
[1] Davignon J, Greegg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphsim and atherosclerosis. Atherosclerosis 1988, 8∶21.
[2] Hallmann DM, Boerminkle E, Saha N, et al. A comparison of allele frequencies and effects in nine population. Am J Hum Genet, 1991, 49∶338-349.
[3] Emi M, Wu LL, Robertson MA, et al. Genotyping and sequence analysis of apolipoprotein E isoforms. Genomics,1988, 3∶373-379.
, 百拇医药
[4] 何秉贤，赵新国，李新立，等.新疆维哈汉三民族血脂含量及有关影响因素的研究.中华心血管病杂志，1994，22(1)∶67-70.
[5] Walden CC, Hegele RA. Apolipoprotein E in hyperlipidemia. An Int Med, 1994, 120(12)∶1026-1036.
[6] Tsukamoto K, Watanabe T, Matsushima T, et al. Determination by PCR-RFLP of ApoE genotype in a Japanese population. J Lab Clin Med, 1993,121(4)∶598-602.
[7] Scheer WD, Budreall DA, Malcon GT, et al. ApoE and atherosclerosis in Alaska. Natives Atherosclerosis, 1995, 111(2)∶197-202.
, 百拇医药
[8] Kao JJ, Tsai KS, Chang CJ. The effects of ApoE polymorphism on the distribution of lipids and lipoproteins in the Chinese population. Atherosclerosis, 1996, 114(1)∶55-59.
[9] Manttari M,Koskinen P, Ehnholn C, et al. Apolipoprotein E polymorphism influences the serum cholesterol response to dietary intervention. Metabolism, 1991, 40∶217-221.
[10] Daniel A, Ros E, Casals E, et al. Effect of apolipoprotein E polymorphism on the serum lipid response to a hypolipidemic diet rich in monounsaturated fatty acids in patients with hypercholesterolemia and combined hyperlipidemia.Am J Clin Nutr,1995,61(1)∶141-148.
(收稿：1998-04-12 修回：1998-08-26), http://www.100md.com
单位：王新利 王国荃 肖碧玉(830054乌鲁木齐，新疆医学院环境卫生学教研室)；徐臻荣(新疆医学院营养卫生学教研室)；张栏芝 姜瑞(新疆医学院保健科)
关键词：
中华医学遗传学杂志990219 载脂蛋白E(ApoE)是血浆中乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)及中间密度脂蛋白(IDL)与肝脏ApoE受体或ApoB.E受体结合的连接物，在调节血脂和脂蛋白在体内代谢方面起着非常重要的作用[1]。ApoE是由人类第19号染色体长臂上的1个基因位点的3个常见等位基因所编码，由于具有共显性遗传的特点，人群中有6种不同的基因型，相对应的也有6种表型，3种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和3种杂合子(E2/4,E2/3,E3/4)[2]。编码ApoE的3种常见等位基因的相对频率存在明显的种族差异。新疆是多民族聚集区，已有研究表明新疆不同民族间血脂水平存在一定差异[3]，但不同民族间ApoE等位基因相对频率的分布差异及其与血脂的关系均尚无报道。为此我们对新疆维族及汉族人群的ApoE基因多态性采用聚合酶连反应结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法进行了测定，并对两民族ApoE基因多态性与血脂的关系进行了对比分析。
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1 材料与方法
1.1 对象 新疆乌鲁木齐市健康献血员，年龄20～35岁，维吾尔族163名，男81名，女82名；汉族150名，男女各半。全部受检者均进行了ApoE基因分型，其中101名维吾尔族，140名汉族作了血脂测定。
1.2 方法
1.2.1 ApoE基因型检测 全部受试者采早晨空腹肘静血，ACD抗凝血0.5ml，非抗凝血3ml(用于测量血脂)。(1)取ACD抗凝血，采用蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，异丙醇沉淀DNA。75%乙醇漂洗2遍，DNA溶于200μl TE(pH=8.0)中。(2)引物按Emi等[4]报道设计。F4为5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGCTACA-C-3′，F6为5′-TAAGCTTGGCACGGCT-GTCCAAGGA-3′。(3)DNA扩增：PCR反应体积50μl，含10×Buffer5μl，4×dNTP200μmol，引物各25pmol，基因组DNA约0.5μg及10%DMSO。首先96℃预变性10分钟，而后加入2U Taq酶(华美公司提供)，按94℃变性40秒，复性61℃40秒，延伸71℃1分钟，循环30次(DNA Amplier, BoiRad GenecyclerTM)，最后1个循环72℃延伸5分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射灯下进行检测，在244bp处出现荧光带，为特异性PCR产物(图1)。(4)限制性内切酶酶切PCR产物：PCR扩增产物中加入10UHhaⅠ(Promega公司产品)，37℃酶切4小时，酶切产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶浓度为8%，于200V恒压下垂直电泳3小时(电泳仪为BioRad Power/DAC3000)，0.5μg/ml溴乙啶中染色30分钟。紫外线透射灯下观察结果(图2)。纯合子E2/2在91bp和83bp出现荧光条带；E3/3在91bp和48bp出现荧光条带；E4/4在72bp和48bp出现荧光条带。杂合子E4/2出现91bp、83bp、72bp和48bp条带；E3/2出现91bp、83bp和48bp条带；E4/3出现91bp，72bp和48bp条带。
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图1 PCR扩增ApoE 第4外显子中的部分片段 1～6是PCR产物；M是PCR marker 图2 Hha Ⅰ酶切ApoE PCR产物的实验图 1～6分别代表基因型E4/4、E4/2、E4/2、E3/2、E2/2、E3/3；M为PGEM-72f(+)/Hae111DNA参数
1.2.2 血脂测定按WHO“Monica”方案统一要求标准化方法。用Boehringer Mannheim公司提供的标准酶试剂盒，分别测定TC、TG及HDL-C，LDL-C按Friedewald公式计算(LDL-C=TC-HDL-C-1/5TG)。全部测定工作使用美国TECHNTON RA-2000全自动生化分析仪，由新疆自治区临床检验中心完成。该中心血脂测定质控检验合格。
1.2.3 统计分析 基因频率的计算，按Hardy-Weinberg equilibrium计算，等位基因频率比较采用χ2检验，不同基因型间血脂的比较用方差分析。所有统计工作均在COMPAQ586计算机上用SAS软件分析完成。
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2 结果
2.1 维、汉两民族ApoE基因型和等位基因频率分布见表1。
表1 维吾尔族和汉族ApoE基因型及等位基因频率分布比较 基因型
汉 族
(n=150)
维 族
(n=163)
4/4
2
1
4/3
16
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42
4/2
3
1
3/3
109
104
3/2
18
14
2/2
2
1
等位基因频率
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ε4
0.077
0.138
ε3
0.840
0.810
ε2
0.083
0.052
注：基因型分布情况进行χ2检验时，将含有ε4的E4/4、E4/3、E4/2合并为一组，含有ε2的E3/2与E/2合并为一组。基因型χ2=8.661，df=2，P=0.013，基因频率χ2=7.979，df=2，P=0.019
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如表1所示在基因型分析中两民族均以E3/3型最常见，但在维吾尔族中E3/4次之，而在汉族为E3/2次之，两组比较存在统计学差异。在3种等位基因频率分布上维、汉两民族也存在统计学差异，其中维吾尔族ε4等位基因频率高于汉族(χ2=6.296,P<0.05)。
2.2 将维、汉两民族血脂检测值按ApoE不同等位基因分为ε2携带组(E2/2、E3/2)、ε3纯合组(E3/3)、ε4携带组(E4/4、E4/3)进行分析，其结果见表2、表3，不论维吾尔族还是汉族均以ε4携带组TC及LDL-C最高，ε3携带组居中，ε2携带组最低。三组比较存在统计学差异，其他测定值无明显差异。
表2 维吾尔族ApoE不同等位基因血脂、脂蛋白比较
ε2
n=8
, 百拇医药 ε3
n=68
ε4
n=25
F
P
TG
1.29±0.40
1.21±0.50
1.27±0.53
0.19
0.828
TC
, 百拇医药
4.10±0.89
4.31±0.70
4.73±0.80
3.55
0.032
HDL-C
1.32±0.27
1.26±0.30
1.23±0.30
0.27
0.760
LDL-C
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2.50±0.89
2.81±0.68
3.18±0.84
3.36
0.039
表3 汉族ApoE不同等位基因血脂、脂蛋白比较
ε2
n=20
ε3
n=99
ε4
n=18
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F
P
TG
1.20±0.36
1.12±0.38
1.18±0.35
0.503
0.606
TC
4.07±0.69
4.22±0.74
4.75±0.61
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0.007
HDL-C
1.30±0.27
1.24±0.24
1.33±0.30
1.25
0.290
LDL-C
2.53±0.66
2.80±0.60
3.17±0.66
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5.14
0.007
3 讨论
正常人群中ApoE的6种基因型分布不匀等，以 E3/3 发生频率最高，超过50%，含ε3的杂合子(E4/3，E3/2)居中，E2/2、E4/4和E2/4发生频率最低。因此一般认为等位基因ε3为野生型，ε2，ε4是发生在两个不同部位单一核苷酸突变的结果[4，5]。近年来，世界范围内大样本群体调查发现ApoE基因型分布在欧美高加索人种以E3/3为最常见，其次为E3/4。而亚洲蒙古人种虽以E3/3为最常见，但其次为E2/3[1，2]。我们的研究结果显示，150名汉族ApoE基因型分布与亚洲蒙古人种相似，而163名维吾尔族ApoE基因型分布与高加索人相似，以E3/3为最常见，其次为E3/4。
等位基因频率分布也存在明显种族差异，ε3等位基因的相对频率高加索一般低于0.79，亚洲(蒙古人种)多高于0.82。而ε4等位基因的相对频率高加索人则高于亚洲蒙古人种[1，2]。我们的研究结果显示，维吾尔 族的ApoE基因多态性介于高加索人种和蒙古人种(汉族)之间。
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近年来，对来自不同国家、不同人群的研究发现[2，6-8]，在血脂正常的人群中，不同ApoE表型者的血浆TC、LDL-C水平高低依次是E4E4>E4E3>E3E3>E3E2>E2E2。这种ApoE表型影响个体间血浆TC、LDL-C的作用并不受环境和其他遗传背景的干扰。我们的研究结果显示尽管维、汉两民族在ApoE 3种等位基因频率分布上存在明显差异，但是由3种等位基因所编码出的3种主要异构体对血脂的影响，维、汉两民族表现出相同的趋势，也证实ApoE表型对血脂的影响不受环境和其它遗传背景的干扰这一结论。
关于不同ApoE表型间体内血脂差异的原因，目前认为可能与ApoE不同异构体间它们的受体结合活性及自身在体内代谢速率存在明显差异有关[1，5]。不仅如此，近年来研究还发现ApoE表型不同对肠道的胆固醇吸收率也存在明显差异[9，10]。ApoE 4携带者，小肠吸收胆固醇增加。所以，ApoE 4携带者采用饮食疗法治疗高脂血症获益最明显。
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本课题由新疆科委重点科研基金(95908)资助
参考文献
[1] Davignon J, Greegg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphsim and atherosclerosis. Atherosclerosis 1988, 8∶21.
[2] Hallmann DM, Boerminkle E, Saha N, et al. A comparison of allele frequencies and effects in nine population. Am J Hum Genet, 1991, 49∶338-349.
[3] Emi M, Wu LL, Robertson MA, et al. Genotyping and sequence analysis of apolipoprotein E isoforms. Genomics,1988, 3∶373-379.
, 百拇医药
[4] 何秉贤，赵新国，李新立，等.新疆维哈汉三民族血脂含量及有关影响因素的研究.中华心血管病杂志，1994，22(1)∶67-70.
[5] Walden CC, Hegele RA. Apolipoprotein E in hyperlipidemia. An Int Med, 1994, 120(12)∶1026-1036.
[6] Tsukamoto K, Watanabe T, Matsushima T, et al. Determination by PCR-RFLP of ApoE genotype in a Japanese population. J Lab Clin Med, 1993,121(4)∶598-602.
[7] Scheer WD, Budreall DA, Malcon GT, et al. ApoE and atherosclerosis in Alaska. Natives Atherosclerosis, 1995, 111(2)∶197-202.
, 百拇医药
[8] Kao JJ, Tsai KS, Chang CJ. The effects of ApoE polymorphism on the distribution of lipids and lipoproteins in the Chinese population. Atherosclerosis, 1996, 114(1)∶55-59.
[9] Manttari M,Koskinen P, Ehnholn C, et al. Apolipoprotein E polymorphism influences the serum cholesterol response to dietary intervention. Metabolism, 1991, 40∶217-221.
[10] Daniel A, Ros E, Casals E, et al. Effect of apolipoprotein E polymorphism on the serum lipid response to a hypolipidemic diet rich in monounsaturated fatty acids in patients with hypercholesterolemia and combined hyperlipidemia.Am J Clin Nutr,1995,61(1)∶141-148.
(收稿：1998-04-12 修回：1998-08-26), http://www.100md.com