中国人WD基因第14和18号外显子的错义突变
作者：吴志英 王柠 慕容慎行 林珉婷
单位：吴志英 王柠 慕容慎行 林珉婷(350005福州，福建医科大学附属第一医院神经内科)
关键词：肝豆状核变性基因；错义突变；DNA序列测定
中国人WD基因第14和18号外显子的 错义突变 【摘要】 目的 了解中国人肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)基因第14和18号外显子的突变情况，与国外报道的这两个外显子的高突变频率进行比较。方法 应用聚合酶链反应-单链构像多态(PCR-SSCP)结合DNA测序技术，对44例无亲缘关系的WD患者及60例正常对照进行突变检测。结果 一例患者在14号外显子发生了Arg1041Pro(3121G→C)纯合错义突变，另一例患者在18号外显子发生了Asn1270Ser(3809A→G)杂合错义突变。结论 Arg1041Pro为未报道过的新型错义突变，Asn1270Ser突变与国外报道一致。但均未呈热区分布。
, http://www.100md.com
Missense mutations of exons 14 and 18 of Wilson's
disease gene in Chinese patients
WU Zhiying*, WANG Ning, MURONG Shenxing, LIN Minting
*Institute of Neurological Sciences, Department of Neurology, First Affiliated Hospital
of Fujian Medical University, Fuzhou,350005 P.R.China E-mail:zhiying wu@ 163.net
【Abstract】 Objective To investigate the characteristics of mutations of exons 14 and 18 of Wilson's disease (WD) gene in Chinese patients.Methods The subjects of study included 60 unrelated normal controls and 44 unrelated WD patients. Genomic DNA was prepared from peripheral blood leukocytes by a salt-out method.Mutations of exons 14 and 18 in these subjects were screened by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and further confirmed by sequencing.Results One patient was homozygous for Arg1041Pro mutation of exon 14 and another patient was heterozygous for Asn1270Ser mutation of exons 18.Conclusion The mutations of exon 14 and 18 of WD gene in Chinese patients were confirmed by sequencing for the first time in China.Arg1041Pro was identified as a novel missense mutation. In addition, an Asn1270Ser, previously described mutation, was detected in this study. But exons 14 and 18 are not the hot point mutations of WD gene in Chinese patients.
, 百拇医药
【Key words】 Wilson's disease gene Missense mutation DNA sequencing
肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)是一种可有效对症治疗的常染色体隐性遗传病。基因定位于13q14.3，跨度大于80kb，有21个外显子，cDNA长约4395kb，编码1 465个氨基酸的P型ATP酶，参与铜跨膜转运的代谢过程，故该基因又称ATP7B基因[1]。WD基因突变形式具有异质性，欧洲人以14号外显子(His1069Gln)和18号外显子(Gly1266Arg)错义突变最为常见，分别达28%和10%，据此可对1/3以上的WD患者进行直接基因诊断[2]。我们对中国患者的WD基因第14号和18号外显子进行分析，发现了一些罕见的错义突变，但未呈热区分布，现报道如下。
1 材料与方法
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1.1 研究对象 无亲缘关系的正常对照60名，男女各半，无遗传病家族史。无亲缘关系的WD确诊患者44例，男25例，女19例，发病年龄5～39岁，分别来自福建、山东、上海、浙江等地。所有病例均由我院神经内科确诊。诊断标准为：(1)有典型的临床症状；(2)血清铜蓝蛋白<200mg/L；(3)裂隙灯下检查角膜K-F环阳性。
1.2 人基因组DNA制备 抽取上述研究对象外周静脉血10ml，分离白细胞后常规盐析法抽提基因组DNA。
1.3 PCR扩增 2对PCR引物(上海生工公司合成)，分别扩增WD基因第14和18号外显子(表1)。50μl PCR反应体系中，基因组DNA 0.25μg，dNTPs各200μmol/L，上、下游引物各25pmol，Taq DNA聚合酶2.5U。采用美国MJ公司自动扩增仪扩增。条件均为94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分钟，30次循环。
表1 PCR扩增所用的2对引物
, 百拇医药
Tab 1 Primer sequences for PCR
Exon
(外显子)
Primer
(引物)
Primer sequences
(引物序列)
Size(bp)
(片段长度)
14
14F
5′-TCCATCTGTATTGTGGTCAG-3′
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301
14R
5′-CAGCTAGGAGAGAAGGACAT-3′
18
18F
5′-ACCTTTTGCCAACACTAGCAT-3′
275
18R
5′-TCCCAGCACCCACAGCC-3′
1.4 单链构象多态分析(SSCP)和银染 PCR扩增产物5μl与等体积加样缓冲液混合，变性后冰浴骤冷，8%非变性胶，20℃，200V电压电泳16小时。银染显色，拍照分析结果。
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1.5 PCR产物测序 待测PCR产物经Qiaquick Spin柱(Qiagen Inc.)纯化。取纯化后的PCR产物1.0μg为模板，单侧PCR引物为测序引物。采用USB2.0版测序试剂盒(USB公司)、α-32P-dATP(北京亚辉公司)以及8%测序胶进行DNA测序，操作步骤按USB公司介绍的操作指南并加以改良。凝胶真空抽干，-70℃放射自显影18～36小时。
2 结果
2.1 14号外显子的新型错义突变 60例正常对照呈现相同的SSCP带型。44例患者中，有3例表现异常的单链构象(图1)，经DNA测序证实其中1例(图1-P1)发生了Arg1041Pro(3121G→C)纯合突变(图2-P4)，按染色体计算的突变发生率为2.27%(2/88)。该突变国际上尚未见报道。另两例SSCP带型相同(图1)，经DNA测序证实为内含子区碱基置换形成的多态。
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图1 ATP7B基因14号外显子SSCP电泳分析 N：正常对照；P1-P4：WD患者；S1-S3：正常单链条带；B1-B3：泳动变位单链条带
Fig 1 SSCP analysis of exon 14 of ATP7B gene N:normal control;P1-P4:WD patients; S1-S3:normal SSCP bands;B1-B3:shift SSCP bands
图2 ATP7B基因14号外显子的序列分析结果 第1041密码子由CGG→CCG，导致发生Arg1041Pro纯合错义突变
Fig 2 Sequence of exon 14 from the WD patient and a control
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Arrow indicates CGG (Arg) to CCG (Pro) mutation at codon 1041 in exon 14
2.2 18号外显子的突变 60例正常对照呈现3种SSCP带型，44例患者中，发现1例患者具有独特的单链构象条带。经DNA测序证实为Asn1270Ser(3809A→G)杂合错义突变(图3)，按染色体计算的突变发生率为1.14%(1/88)。
图3 ATP7B基因18号外显子的序列分析结果 第1271密码子由AAT→AGT，导致发生Asn1270Ser杂合错义突变
Fig 3 Sequence of exon 18 from the WD patient and a control Arrow indicates AAT (Asn) to AGT (Ser) mutation at codon 1270 in exon 18
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3 讨论
1993年以来，随着WD基因克隆和分子结构阐明，国外研究热点集中于基因突变特征及其蛋白功能的探讨。1995年，Thomas等[2]曾报道了23种不同的突变类型，包括11个插入或缺失突变、7个错义突变、3个拼接点突变及2个无义突变，其中以14号外显子的His1069Gln和18号外显子的Gly1266Arg错义突变最常见，提示这两点为欧洲WD患者基因突变的“热区”。除此之外，发生于14和18号外显子的突变形式尚有3085delAC、3147delC、3083delAGA→G、Glu1064Lys、Leu1043Pro、3601-1G→A、Asn1270Ser、Pro1273Leu及3852del24等[2-4]。但国内迄今未见到有关WD基因14和18号外显子突变的DNA测序报道。
我们应用PCR-SSCP技术对44例无亲缘关系WD患者进行14和18号外显子筛查，并经DNA测序证实，分别发现了Arg1021Pro和Asn1270Ser错义突变，前者为未曾报道过的新型错义突变，其发生率占本组染色体数的2.27%，后者与Thomas等[2]报道一致，为罕见的错义突变。Arg1021Pro突变位于P型ATP酶第6跨膜区(Tm6)，由于小分子量中性氨基酸(Pro)代替了碱性氨基酸(Arg)，破坏了ATP酶跨膜区的形成。临床上，该例患者9岁即有肝损害表现，14岁时因出现锥体外系症状才得以确诊，经驱铜治疗明显好转，该例临床表型属肝-脑型[5]。Asn1270Ser突变位于ATP酶结合位点的铰链区，Asn基团在该酶中高度保守，当它发生突变被Ser基团替代时，可导致铜转运水平降低。故上述两种错义突变均导致ATP7B基因表达蛋白功能不同程度的减弱，从而致病。本研究结果亦表明，中国人ATP7B基因的突变分布与西方人明显不同，突变热区不在14和18号外显子上。另据我们的研究[6]，8号外显子为我国WD患者基因突变热区。
, 百拇医药
本课题受卫生部优秀青年科技人材专项基金(97082)和福建省卫生厅科研基金(96A032)资助
参考文献
[1] Bull PC, Thomas GR, Rommens JM, et al.The Wilson's disease is a putative copper p-type ATPase similar to the Menkes gene. Nature Genet, 1993,5∶327-337.
[2] Thomas GR, Forbes JR, Roberts EA, et al.The Wilson disease gene:spectrum of mutations and their consequences. Nature Genet, 1995,9∶210-217.
[3] Figus A, Angius A, Loudianos G,et al.Molecular pathology and haplotype analysis of Wilson disease in Mediterranean population. Am J Hum Genet, 1995,57∶1318-1324.
, 百拇医药
[4] Loudianos G, Dessi V, Angius A,et al.Wilson disease mutations associated with uncommon haplotypes in Mediterranean patients. Hum Genet, 1996,98∶640-642.
[5] 杨任民主编.肝豆状核变性.第1版.合肥：安徽科学技术出版社，1995.188.
[6] 王柠，吴志英，慕容慎行，等.经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究.中华神经科杂志，1998，31(1)∶20-23.
(收稿：1998-04-28 修回：1998-06-24), 百拇医药
单位：吴志英 王柠 慕容慎行 林珉婷(350005福州，福建医科大学附属第一医院神经内科)
关键词：肝豆状核变性基因；错义突变；DNA序列测定
中国人WD基因第14和18号外显子的 错义突变 【摘要】 目的 了解中国人肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)基因第14和18号外显子的突变情况，与国外报道的这两个外显子的高突变频率进行比较。方法 应用聚合酶链反应-单链构像多态(PCR-SSCP)结合DNA测序技术，对44例无亲缘关系的WD患者及60例正常对照进行突变检测。结果 一例患者在14号外显子发生了Arg1041Pro(3121G→C)纯合错义突变，另一例患者在18号外显子发生了Asn1270Ser(3809A→G)杂合错义突变。结论 Arg1041Pro为未报道过的新型错义突变，Asn1270Ser突变与国外报道一致。但均未呈热区分布。
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Missense mutations of exons 14 and 18 of Wilson's
disease gene in Chinese patients
WU Zhiying*, WANG Ning, MURONG Shenxing, LIN Minting
*Institute of Neurological Sciences, Department of Neurology, First Affiliated Hospital
of Fujian Medical University, Fuzhou,350005 P.R.China E-mail:zhiying wu@ 163.net
【Abstract】 Objective To investigate the characteristics of mutations of exons 14 and 18 of Wilson's disease (WD) gene in Chinese patients.Methods The subjects of study included 60 unrelated normal controls and 44 unrelated WD patients. Genomic DNA was prepared from peripheral blood leukocytes by a salt-out method.Mutations of exons 14 and 18 in these subjects were screened by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and further confirmed by sequencing.Results One patient was homozygous for Arg1041Pro mutation of exon 14 and another patient was heterozygous for Asn1270Ser mutation of exons 18.Conclusion The mutations of exon 14 and 18 of WD gene in Chinese patients were confirmed by sequencing for the first time in China.Arg1041Pro was identified as a novel missense mutation. In addition, an Asn1270Ser, previously described mutation, was detected in this study. But exons 14 and 18 are not the hot point mutations of WD gene in Chinese patients.
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【Key words】 Wilson's disease gene Missense mutation DNA sequencing
肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)是一种可有效对症治疗的常染色体隐性遗传病。基因定位于13q14.3，跨度大于80kb，有21个外显子，cDNA长约4395kb，编码1 465个氨基酸的P型ATP酶，参与铜跨膜转运的代谢过程，故该基因又称ATP7B基因[1]。WD基因突变形式具有异质性，欧洲人以14号外显子(His1069Gln)和18号外显子(Gly1266Arg)错义突变最为常见，分别达28%和10%，据此可对1/3以上的WD患者进行直接基因诊断[2]。我们对中国患者的WD基因第14号和18号外显子进行分析，发现了一些罕见的错义突变，但未呈热区分布，现报道如下。
1 材料与方法
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1.1 研究对象 无亲缘关系的正常对照60名，男女各半，无遗传病家族史。无亲缘关系的WD确诊患者44例，男25例，女19例，发病年龄5～39岁，分别来自福建、山东、上海、浙江等地。所有病例均由我院神经内科确诊。诊断标准为：(1)有典型的临床症状；(2)血清铜蓝蛋白<200mg/L；(3)裂隙灯下检查角膜K-F环阳性。
1.2 人基因组DNA制备 抽取上述研究对象外周静脉血10ml，分离白细胞后常规盐析法抽提基因组DNA。
1.3 PCR扩增 2对PCR引物(上海生工公司合成)，分别扩增WD基因第14和18号外显子(表1)。50μl PCR反应体系中，基因组DNA 0.25μg，dNTPs各200μmol/L，上、下游引物各25pmol，Taq DNA聚合酶2.5U。采用美国MJ公司自动扩增仪扩增。条件均为94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分钟，30次循环。
表1 PCR扩增所用的2对引物
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Tab 1 Primer sequences for PCR
Exon
(外显子)
Primer
(引物)
Primer sequences
(引物序列)
Size(bp)
(片段长度)
14
14F
5′-TCCATCTGTATTGTGGTCAG-3′
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301
14R
5′-CAGCTAGGAGAGAAGGACAT-3′
18
18F
5′-ACCTTTTGCCAACACTAGCAT-3′
275
18R
5′-TCCCAGCACCCACAGCC-3′
1.4 单链构象多态分析(SSCP)和银染 PCR扩增产物5μl与等体积加样缓冲液混合，变性后冰浴骤冷，8%非变性胶，20℃，200V电压电泳16小时。银染显色，拍照分析结果。
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1.5 PCR产物测序 待测PCR产物经Qiaquick Spin柱(Qiagen Inc.)纯化。取纯化后的PCR产物1.0μg为模板，单侧PCR引物为测序引物。采用USB2.0版测序试剂盒(USB公司)、α-32P-dATP(北京亚辉公司)以及8%测序胶进行DNA测序，操作步骤按USB公司介绍的操作指南并加以改良。凝胶真空抽干，-70℃放射自显影18～36小时。
2 结果
2.1 14号外显子的新型错义突变 60例正常对照呈现相同的SSCP带型。44例患者中，有3例表现异常的单链构象(图1)，经DNA测序证实其中1例(图1-P1)发生了Arg1041Pro(3121G→C)纯合突变(图2-P4)，按染色体计算的突变发生率为2.27%(2/88)。该突变国际上尚未见报道。另两例SSCP带型相同(图1)，经DNA测序证实为内含子区碱基置换形成的多态。
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图1 ATP7B基因14号外显子SSCP电泳分析 N：正常对照；P1-P4：WD患者；S1-S3：正常单链条带；B1-B3：泳动变位单链条带
Fig 1 SSCP analysis of exon 14 of ATP7B gene N:normal control;P1-P4:WD patients; S1-S3:normal SSCP bands;B1-B3:shift SSCP bands
图2 ATP7B基因14号外显子的序列分析结果 第1041密码子由CGG→CCG，导致发生Arg1041Pro纯合错义突变
Fig 2 Sequence of exon 14 from the WD patient and a control
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Arrow indicates CGG (Arg) to CCG (Pro) mutation at codon 1041 in exon 14
2.2 18号外显子的突变 60例正常对照呈现3种SSCP带型，44例患者中，发现1例患者具有独特的单链构象条带。经DNA测序证实为Asn1270Ser(3809A→G)杂合错义突变(图3)，按染色体计算的突变发生率为1.14%(1/88)。
图3 ATP7B基因18号外显子的序列分析结果 第1271密码子由AAT→AGT，导致发生Asn1270Ser杂合错义突变
Fig 3 Sequence of exon 18 from the WD patient and a control Arrow indicates AAT (Asn) to AGT (Ser) mutation at codon 1270 in exon 18
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3 讨论
1993年以来，随着WD基因克隆和分子结构阐明，国外研究热点集中于基因突变特征及其蛋白功能的探讨。1995年，Thomas等[2]曾报道了23种不同的突变类型，包括11个插入或缺失突变、7个错义突变、3个拼接点突变及2个无义突变，其中以14号外显子的His1069Gln和18号外显子的Gly1266Arg错义突变最常见，提示这两点为欧洲WD患者基因突变的“热区”。除此之外，发生于14和18号外显子的突变形式尚有3085delAC、3147delC、3083delAGA→G、Glu1064Lys、Leu1043Pro、3601-1G→A、Asn1270Ser、Pro1273Leu及3852del24等[2-4]。但国内迄今未见到有关WD基因14和18号外显子突变的DNA测序报道。
我们应用PCR-SSCP技术对44例无亲缘关系WD患者进行14和18号外显子筛查，并经DNA测序证实，分别发现了Arg1021Pro和Asn1270Ser错义突变，前者为未曾报道过的新型错义突变，其发生率占本组染色体数的2.27%，后者与Thomas等[2]报道一致，为罕见的错义突变。Arg1021Pro突变位于P型ATP酶第6跨膜区(Tm6)，由于小分子量中性氨基酸(Pro)代替了碱性氨基酸(Arg)，破坏了ATP酶跨膜区的形成。临床上，该例患者9岁即有肝损害表现，14岁时因出现锥体外系症状才得以确诊，经驱铜治疗明显好转，该例临床表型属肝-脑型[5]。Asn1270Ser突变位于ATP酶结合位点的铰链区，Asn基团在该酶中高度保守，当它发生突变被Ser基团替代时，可导致铜转运水平降低。故上述两种错义突变均导致ATP7B基因表达蛋白功能不同程度的减弱，从而致病。本研究结果亦表明，中国人ATP7B基因的突变分布与西方人明显不同，突变热区不在14和18号外显子上。另据我们的研究[6]，8号外显子为我国WD患者基因突变热区。
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参考文献
[1] Bull PC, Thomas GR, Rommens JM, et al.The Wilson's disease is a putative copper p-type ATPase similar to the Menkes gene. Nature Genet, 1993,5∶327-337.
[2] Thomas GR, Forbes JR, Roberts EA, et al.The Wilson disease gene:spectrum of mutations and their consequences. Nature Genet, 1995,9∶210-217.
[3] Figus A, Angius A, Loudianos G,et al.Molecular pathology and haplotype analysis of Wilson disease in Mediterranean population. Am J Hum Genet, 1995,57∶1318-1324.
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[4] Loudianos G, Dessi V, Angius A,et al.Wilson disease mutations associated with uncommon haplotypes in Mediterranean patients. Hum Genet, 1996,98∶640-642.
[5] 杨任民主编.肝豆状核变性.第1版.合肥：安徽科学技术出版社，1995.188.
[6] 王柠，吴志英，慕容慎行，等.经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究.中华神经科杂志，1998，31(1)∶20-23.
(收稿：1998-04-28 修回：1998-06-24), 百拇医药