武汉地区十二指肠溃疡患者和HLA-DQA1基因关联的初步研究
作者：杜意平* 邓长生 鲁德银 黄梅芳 郭淑芳 侯伟
单位：邓长生 鲁德银 黄梅芳 郭淑芳 侯伟(430071 武汉，湖北医科大学第二医院消化内科)；杜意平(现在深圳市中心医院消化内科)
关键词：十二指肠溃疡；HAL-DQA1基因；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性
武汉地区十二指肠溃疡患者和HLA 【摘要】 目的 探讨武汉地区汉族人HLA-DQA1基因与十二指肠溃疡的遗传关联。方法 应用HLA基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性核苷酸分型技术，以等位基因特异性的限制性内切酶(Apal Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Hph Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ、Mnl Ⅰ)消化DQA1座位特异的PCR扩增产物，对70例十二指肠溃疡患者、50例正常人的HLA-DQA1等位基因进行分析。结果 十二指肠溃疡患者DQA1*0301等位基因频率与正常对照组明显增高，差异有显著性(P＝0.003，RR=3.20，Pc=0.024)。结论 DQA1*0301与十二指肠溃疡有一定关联，十二指肠溃疡患者与正常人之间存在着免疫遗传异质性的差异。
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HLA-DQA1 genes involved in the genetic susceptibility
to duodenal ulcer in Wuhan Hans
DU Yiping*, DENG Changsheng, LU Deyin, HUANG Meifang, GUO Shufang, HOU Wei
* Digestive Department of the Second Hospital of Hubei Medical University,Wuhan, 430071 P.R.China
【Abstract】 Objective To study the genetic susceptibility of HLA-DQA1 alleles to duodenal ulcer in Chinese Hans from Wuhan and its nearby regions.Methods Seventy patients with duodenal ulcer and fifty healthy controls were examined for HLA-DQA1 genotypes. HLA-DQA1 typing was carried out by digesting the locus specific polymerase chain reaction amplified products with alleles specific restriction enzymes (PCR-RFLP),Apal Ⅰ,Basj Ⅰ,Hph Ⅰ,Fok Ⅰ,Mbo Ⅱ and Mnl Ⅰ.Results The allele frequency of DQA1 0301 in patients with duodenal ulcer(64.3%) was significantly higher than that in healthy controls (36%). In contrast, the allele frequency of DQA1 0102 in patients with duodenal ulcer (8.6%) was significantly lower than that in healthy controls(26%).Conclusion These findings suggest that DQA1 0301 is a susceptibic gene for duodenal ulcer in Wuhan Hans while DQA1 0102 is its resistant gene, and there are immunogenetic differences in HLA-DQA1 locus between duodenal ulcer patients and healthy controls.
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【Key words】 Duodenal ulcer HLA-DQA1 gene Polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism
十二指肠溃疡(duodenal ulcer, DU)是一组广泛的遗传异质性疾病，其病因及发病机理都是多方面的[1]。其中，部分DU患者的某些免疫学方面的改变[2-4]，提示本病可能存在着免疫发病机理。已知人类的主要组织相容性复合物(MHC)和某些疾病的发生密切相类，因此研究其基因产物HLA与DU的相关性，能为揭示DU发病机理提供有意义的线索。
DQA1基因具有多态性，而且不能用血清学方法鉴定。我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism，PCR-RFLP)核苷酸分型技术，研究了武汉地区汉族人与DU关联的HLA-DQA1基因。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 病例组：DU70例，由本科胃镜室经电子胃镜检查确诊(复合性溃疡和/或长期服药致溃疡者不包括在内)，其中男53例，女17例，年龄17～62岁，平均38岁，均为武汉地区汉族人。健康对照组：50例来自病例同一群体、身体健康、年龄相当、无消化性溃疡及其它特殊病史或家族史，其中男38名，女12名，均行电子胃镜检查未见消化性溃疡，胃粘膜组织学检查显示正常。
1.2 主要设备及试剂 PCR扩增仪Perkin Elmer Cetus Gene Amp9600。HLA-DQA1位点特异性的PCR扩增引物根据猪子英俊[5]文献，引物1：5′-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3′，引物2：5′-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3′，引物由加拿大Sangon上海分公司合成。限制性内切酶为New England Biolabs公司产品，DQA1分型用以下6种：Apal Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Hph Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ和MnlⅠ。耐热DNA多聚酶和脱氧核糖核苷酸dNTP为加拿大Sangon公司产品。蛋白酶K、pBR322/Hae Ⅲ Mark为华美生物工程公司产品。丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺等均为Sigma产品。
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1.3 实验步骤
1.3.1 白细胞DNA提取 取抗凝血，低渗溶血法裂解红细胞，常规酚-氯仿提取DNA。
1.3.2 HLA-DQA1第2外显子的PCR扩增 反应体系为100μl，含10×缓冲液10μl，dNTP各200μmol/L，引物1和引物2各50pmol，2.5μl模板DNA，用去离子水加至100μl。94℃预变性5分钟，加入2.5U Taq DNA聚合酶，混匀后用液体石腊覆盖，放入PCR仪内。94℃变性1分钟、62℃退火2分钟、72℃延伸2分钟，共循环30次，于72℃再延伸5分钟终止扩增。由于DQA1位点某些等位基因在第2外显子的PCR扩增反应中有3bp缺失，所以经电泳分析获得239或242bp的条带(图1)。
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图1 HLA-DQA1第2外显子的PCR扩增产物图谱 见242bp条带，M：pBR322/Hae Ⅲ Mark (12%PAGE电泳)
Fig 1 The size of the amplified region of the HLA-DQA1 exon 2 is 242bp as indicated
1.3.3 等位基因特异性的内切酶Apal Ⅰ、Hph Ⅰ、BsajⅠ、FokⅠ和MboⅡ分别消化扩增产物 反应体系20μl，含10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl(5U)，PCR扩增产物7μl，加双蒸水至20μl。用Apal Ⅰ、HphⅠ、Fok Ⅰ和Mbo Ⅱ消化时置于37℃水浴1小时。Bsaj Ⅰ消化时置于60℃水浴1小时。
1.3.4 12%丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析酶切产物判断结果 其中DQA1*0101/0102再用Mnl Ⅰ消化，15%PAGE电泳区分。本方法可检出HLA-DQA1座位的8个等位基因[5]，见图2。
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图2 HLA-DQA1第2外显子扩增产物的RFLP酶切图谱(12%PAGE电泳)
Fig 2 Cleavage patterns of polymorphic restriction fragments in the PCR-amplified DQA1 genes obtained with restriction enzymes M:pBR322/Hae Ⅲ Mark; 1:Apal Ⅰ;2:Hph Ⅰ; 3:Bsaj Ⅰ;4:Fok Ⅰ;5:Mbo Ⅱ; a:0301/0501；b:0103/0501；c:0102/0601
1.4 统计学分析 卡方检验或Yate's校正法。等位基因检出率用直接计数法，基因频率按Hardy-Weinberg定理，用公式AF＝1-1-f计算(f为等位基因检出率)。各组间等位基因分布的差异用四格表Fisher确切概率P值检验，相对风险率(RR)按Wolf公式计算，P值校正(Pc)用P乘以所比较的等位基因数[6]。
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2 结果
DU患者及正常对照组HLA-DQA1等位基因分布频率见表1。其中DQA1*0301在正常对照组是常见的等位基因，检出率36%，等位基因频率(AF)为0.20；而患者组检出率64%，AF为0.40；两组比较患者组DQA1*0301明显升高，相对风险率RR＝3.20，P＝0.003，Pc=0.024，差异有显著性。DQA1*0102在正常对照组检出率26%，AF为0.14；患者组检出率9%，AF为0.05；两组比较患者组DQA1*0102明显下降，RR＝0.27，P＝0.012，差异有显著性，但Pc>0.05。其它等位基因的频率两组间比较差异无显著性。
表1 武汉地区汉族人HLA-DAQ1等位基因频率在DU患者和健康对照人群中的分布
Tab 1 Distribution of DQA1 alleles frequency in DU patients and healthy controls from Wuhan Hans
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HLA-DQA1
alleles
(等位基因)
Controls
(对照组n＝50)
DU
(患者组n=70)
PN
PF
AF
PN
PF
AF
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0101
10
0.20
0.11
9
0.13
0.07
0102
13
0.26
0.14
6
0.09*
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0.05
0103
8
0.16
0.08
12
0.17
0.09
0201
7
0.14
0.07
10
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0.14
0.07
0301
18
0.36
0.20
45
0.64**
0.40
0401
2
0.04
0.02
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1
0.01
0.01
0501
12
0.24
0.13
22
0.31
0.17
0601
7
0.14
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0.07
12
0.17
0.09
PN：positive number(阳性数);PF:phenotype frequency(等位基因检出率);AF:alleles frequency(等位基因频率);compared with control(与正常对照组比较)：*P＝0.012，RR=0.27,Pc>0.05；**P＝0.003，RR=3.20，Pc<0.05 3 讨论
60年代就已开始HLA与消化性溃疡的相关性研究，发现HLA-B5抗原与消化性溃疡有关
联[7-10]。然而大部分研究是采用传统的血清学方法，此法陈旧、误差较大。HLA的个体遗传学差异的本质是在编码基因产物的DNA水平上[11]。另外，HLA Ⅱ类基因往往是更重要的。为进一步探讨免疫遗传因素与DU的关系，我们应用HLA基因的PCR-RFLP核苷酸分型技术，以等位基因特异性的限制性内切酶(Apal Ⅰ、Hph Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ、MnlⅠ)消化DQA1座位特异的PCR扩增产物，研究了武汉地区汉族人HLA-DQA1基因与DU的遗传关联，发现DU患者DQA1*0301基因频率明显增高，RR值为3.20，确切概率P值为0.003，校正P值为0.024，均小于0.05。我们的结果显示DQA1*0301和十二指肠溃疡有一定的关联性。然而DQA链在整个MHC区并非孤立存在，而是和DR、DQB座位基因紧密连锁的。现在的结果可能是一条线索，说明HLA Class Ⅱ基因可能比Class Ⅰ基因与本病有更密切的关系，但尚不能肯定在HLA Ⅱ类基因中究竟哪个座位的基因更为关键。这有待于进一步对DRB1基因和DQB1基因的研究。
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参考文献
[1] Lam SK. Etiology and pathogenesis of peptic ulcer. J Gastroenterol, 1994,29 Suppl 7∶39-54.
[2] De Lazari F, Mancin O, Plebani M, et al.High lgE serum levels and peptic ulcer clinical and functional approach. Ital J Gastroenterol, 1994,96(17)∶7-11.
[3] Negrini R, Lisato LI, Zanelia IS, et al.Helicobacter pylori infection induces antibodies crossreacting with human gastric mucosa. Gastroenterol, 1991,101(2)∶437-445.
, 百拇医药
[4] Cionchettic P, Vaira D, Campieri M, et al. Mucosal interleukin 6 and 8 in helicobacter pylori positive patients. Gastroenterology, 1993,104(Pt4)∶A87.
[5] Ota M, Seki T, Nomura N, et al.Modified PCR-RFLP method for HLA-DPB1 and DQA1 genotyping. Tissue Antigens, 1991,38(1)∶60-71.
[6] 赵桐茂.HLA与疾病的关联.见：赵桐茂主编.HLA分型和应用.第1版.上海：科学技术出版社，1984.187-220.
[7] Rotter JI, Rimoin DL, Jason P,et al.HLA-B5 associated with duodenal ulcer. Gastroenterol, 1977,73(3)∶438-440.
, 百拇医药
[8] O'brien BD. HLA and peptic ulcer. Dig Dis Sci, 1979,24(4)∶314-316.
[9] Potashov LV, Savranskii VM, Berkos AS, et al.HLA antigens with gastric and duodenal peptic ulcer. Vestn Khir, 1994,152(1-2)∶14-17.
[10] 王良绪，陈萍生，许惠玲，等.HLA与消化性溃疡相关性研究.中华内科杂志，1986，25(7)∶409-411.
[11] Benacerraf B. Role of MHC gene products in immunic regulation. Science，1981，212(4500)∶1229-1238.
(收稿：1998-04-23 修回：1998-12-02), 百拇医药(杜意平* 邓长生 鲁德银 黄梅芳 郭淑芳 侯伟)
单位：邓长生 鲁德银 黄梅芳 郭淑芳 侯伟(430071 武汉，湖北医科大学第二医院消化内科)；杜意平(现在深圳市中心医院消化内科)
关键词：十二指肠溃疡；HAL-DQA1基因；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性
武汉地区十二指肠溃疡患者和HLA 【摘要】 目的 探讨武汉地区汉族人HLA-DQA1基因与十二指肠溃疡的遗传关联。方法 应用HLA基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性核苷酸分型技术，以等位基因特异性的限制性内切酶(Apal Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Hph Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ、Mnl Ⅰ)消化DQA1座位特异的PCR扩增产物，对70例十二指肠溃疡患者、50例正常人的HLA-DQA1等位基因进行分析。结果 十二指肠溃疡患者DQA1*0301等位基因频率与正常对照组明显增高，差异有显著性(P＝0.003，RR=3.20，Pc=0.024)。结论 DQA1*0301与十二指肠溃疡有一定关联，十二指肠溃疡患者与正常人之间存在着免疫遗传异质性的差异。
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HLA-DQA1 genes involved in the genetic susceptibility
to duodenal ulcer in Wuhan Hans
DU Yiping*, DENG Changsheng, LU Deyin, HUANG Meifang, GUO Shufang, HOU Wei
* Digestive Department of the Second Hospital of Hubei Medical University,Wuhan, 430071 P.R.China
【Abstract】 Objective To study the genetic susceptibility of HLA-DQA1 alleles to duodenal ulcer in Chinese Hans from Wuhan and its nearby regions.Methods Seventy patients with duodenal ulcer and fifty healthy controls were examined for HLA-DQA1 genotypes. HLA-DQA1 typing was carried out by digesting the locus specific polymerase chain reaction amplified products with alleles specific restriction enzymes (PCR-RFLP),Apal Ⅰ,Basj Ⅰ,Hph Ⅰ,Fok Ⅰ,Mbo Ⅱ and Mnl Ⅰ.Results The allele frequency of DQA1 0301 in patients with duodenal ulcer(64.3%) was significantly higher than that in healthy controls (36%). In contrast, the allele frequency of DQA1 0102 in patients with duodenal ulcer (8.6%) was significantly lower than that in healthy controls(26%).Conclusion These findings suggest that DQA1 0301 is a susceptibic gene for duodenal ulcer in Wuhan Hans while DQA1 0102 is its resistant gene, and there are immunogenetic differences in HLA-DQA1 locus between duodenal ulcer patients and healthy controls.
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【Key words】 Duodenal ulcer HLA-DQA1 gene Polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism
十二指肠溃疡(duodenal ulcer, DU)是一组广泛的遗传异质性疾病，其病因及发病机理都是多方面的[1]。其中，部分DU患者的某些免疫学方面的改变[2-4]，提示本病可能存在着免疫发病机理。已知人类的主要组织相容性复合物(MHC)和某些疾病的发生密切相类，因此研究其基因产物HLA与DU的相关性，能为揭示DU发病机理提供有意义的线索。
DQA1基因具有多态性，而且不能用血清学方法鉴定。我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism，PCR-RFLP)核苷酸分型技术，研究了武汉地区汉族人与DU关联的HLA-DQA1基因。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 病例组：DU70例，由本科胃镜室经电子胃镜检查确诊(复合性溃疡和/或长期服药致溃疡者不包括在内)，其中男53例，女17例，年龄17～62岁，平均38岁，均为武汉地区汉族人。健康对照组：50例来自病例同一群体、身体健康、年龄相当、无消化性溃疡及其它特殊病史或家族史，其中男38名，女12名，均行电子胃镜检查未见消化性溃疡，胃粘膜组织学检查显示正常。
1.2 主要设备及试剂 PCR扩增仪Perkin Elmer Cetus Gene Amp9600。HLA-DQA1位点特异性的PCR扩增引物根据猪子英俊[5]文献，引物1：5′-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3′，引物2：5′-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3′，引物由加拿大Sangon上海分公司合成。限制性内切酶为New England Biolabs公司产品，DQA1分型用以下6种：Apal Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Hph Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ和MnlⅠ。耐热DNA多聚酶和脱氧核糖核苷酸dNTP为加拿大Sangon公司产品。蛋白酶K、pBR322/Hae Ⅲ Mark为华美生物工程公司产品。丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺等均为Sigma产品。
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1.3 实验步骤
1.3.1 白细胞DNA提取 取抗凝血，低渗溶血法裂解红细胞，常规酚-氯仿提取DNA。
1.3.2 HLA-DQA1第2外显子的PCR扩增 反应体系为100μl，含10×缓冲液10μl，dNTP各200μmol/L，引物1和引物2各50pmol，2.5μl模板DNA，用去离子水加至100μl。94℃预变性5分钟，加入2.5U Taq DNA聚合酶，混匀后用液体石腊覆盖，放入PCR仪内。94℃变性1分钟、62℃退火2分钟、72℃延伸2分钟，共循环30次，于72℃再延伸5分钟终止扩增。由于DQA1位点某些等位基因在第2外显子的PCR扩增反应中有3bp缺失，所以经电泳分析获得239或242bp的条带(图1)。
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图1 HLA-DQA1第2外显子的PCR扩增产物图谱 见242bp条带，M：pBR322/Hae Ⅲ Mark (12%PAGE电泳)
Fig 1 The size of the amplified region of the HLA-DQA1 exon 2 is 242bp as indicated
1.3.3 等位基因特异性的内切酶Apal Ⅰ、Hph Ⅰ、BsajⅠ、FokⅠ和MboⅡ分别消化扩增产物 反应体系20μl，含10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl(5U)，PCR扩增产物7μl，加双蒸水至20μl。用Apal Ⅰ、HphⅠ、Fok Ⅰ和Mbo Ⅱ消化时置于37℃水浴1小时。Bsaj Ⅰ消化时置于60℃水浴1小时。
1.3.4 12%丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析酶切产物判断结果 其中DQA1*0101/0102再用Mnl Ⅰ消化，15%PAGE电泳区分。本方法可检出HLA-DQA1座位的8个等位基因[5]，见图2。
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图2 HLA-DQA1第2外显子扩增产物的RFLP酶切图谱(12%PAGE电泳)
Fig 2 Cleavage patterns of polymorphic restriction fragments in the PCR-amplified DQA1 genes obtained with restriction enzymes M:pBR322/Hae Ⅲ Mark; 1:Apal Ⅰ;2:Hph Ⅰ; 3:Bsaj Ⅰ;4:Fok Ⅰ;5:Mbo Ⅱ; a:0301/0501；b:0103/0501；c:0102/0601
1.4 统计学分析 卡方检验或Yate's校正法。等位基因检出率用直接计数法，基因频率按Hardy-Weinberg定理，用公式AF＝1-1-f计算(f为等位基因检出率)。各组间等位基因分布的差异用四格表Fisher确切概率P值检验，相对风险率(RR)按Wolf公式计算，P值校正(Pc)用P乘以所比较的等位基因数[6]。
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2 结果
DU患者及正常对照组HLA-DQA1等位基因分布频率见表1。其中DQA1*0301在正常对照组是常见的等位基因，检出率36%，等位基因频率(AF)为0.20；而患者组检出率64%，AF为0.40；两组比较患者组DQA1*0301明显升高，相对风险率RR＝3.20，P＝0.003，Pc=0.024，差异有显著性。DQA1*0102在正常对照组检出率26%，AF为0.14；患者组检出率9%，AF为0.05；两组比较患者组DQA1*0102明显下降，RR＝0.27，P＝0.012，差异有显著性，但Pc>0.05。其它等位基因的频率两组间比较差异无显著性。
表1 武汉地区汉族人HLA-DAQ1等位基因频率在DU患者和健康对照人群中的分布
Tab 1 Distribution of DQA1 alleles frequency in DU patients and healthy controls from Wuhan Hans
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HLA-DQA1
alleles
(等位基因)
Controls
(对照组n＝50)
DU
(患者组n=70)
PN
PF
AF
PN
PF
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0101
10
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PN：positive number(阳性数);PF:phenotype frequency(等位基因检出率);AF:alleles frequency(等位基因频率);compared with control(与正常对照组比较)：*P＝0.012，RR=0.27,Pc>0.05；**P＝0.003，RR=3.20，Pc<0.05 3 讨论
60年代就已开始HLA与消化性溃疡的相关性研究，发现HLA-B5抗原与消化性溃疡有关
联[7-10]。然而大部分研究是采用传统的血清学方法，此法陈旧、误差较大。HLA的个体遗传学差异的本质是在编码基因产物的DNA水平上[11]。另外，HLA Ⅱ类基因往往是更重要的。为进一步探讨免疫遗传因素与DU的关系，我们应用HLA基因的PCR-RFLP核苷酸分型技术，以等位基因特异性的限制性内切酶(Apal Ⅰ、Hph Ⅰ、Bsaj Ⅰ、Fok Ⅰ、Mbo Ⅱ、MnlⅠ)消化DQA1座位特异的PCR扩增产物，研究了武汉地区汉族人HLA-DQA1基因与DU的遗传关联，发现DU患者DQA1*0301基因频率明显增高，RR值为3.20，确切概率P值为0.003，校正P值为0.024，均小于0.05。我们的结果显示DQA1*0301和十二指肠溃疡有一定的关联性。然而DQA链在整个MHC区并非孤立存在，而是和DR、DQB座位基因紧密连锁的。现在的结果可能是一条线索，说明HLA Class Ⅱ基因可能比Class Ⅰ基因与本病有更密切的关系，但尚不能肯定在HLA Ⅱ类基因中究竟哪个座位的基因更为关键。这有待于进一步对DRB1基因和DQB1基因的研究。
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参考文献
[1] Lam SK. Etiology and pathogenesis of peptic ulcer. J Gastroenterol, 1994,29 Suppl 7∶39-54.
[2] De Lazari F, Mancin O, Plebani M, et al.High lgE serum levels and peptic ulcer clinical and functional approach. Ital J Gastroenterol, 1994,96(17)∶7-11.
[3] Negrini R, Lisato LI, Zanelia IS, et al.Helicobacter pylori infection induces antibodies crossreacting with human gastric mucosa. Gastroenterol, 1991,101(2)∶437-445.
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[6] 赵桐茂.HLA与疾病的关联.见：赵桐茂主编.HLA分型和应用.第1版.上海：科学技术出版社，1984.187-220.
[7] Rotter JI, Rimoin DL, Jason P,et al.HLA-B5 associated with duodenal ulcer. Gastroenterol, 1977,73(3)∶438-440.
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[8] O'brien BD. HLA and peptic ulcer. Dig Dis Sci, 1979,24(4)∶314-316.
[9] Potashov LV, Savranskii VM, Berkos AS, et al.HLA antigens with gastric and duodenal peptic ulcer. Vestn Khir, 1994,152(1-2)∶14-17.
[10] 王良绪，陈萍生，许惠玲，等.HLA与消化性溃疡相关性研究.中华内科杂志，1986，25(7)∶409-411.
[11] Benacerraf B. Role of MHC gene products in immunic regulation. Science，1981，212(4500)∶1229-1238.
(收稿：1998-04-23 修回：1998-12-02), 百拇医药(杜意平* 邓长生 鲁德银 黄梅芳 郭淑芳 侯伟)