血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因3′端CA重复多态性及与汉族人高血压病的关系
作者：胡爱华 周宪梁 任晓庆 崔兆强 惠汝太 刘力生
单位：胡爱华 周宪梁 崔兆强 惠汝太 刘力生(100037北京，中国协和医科大学 中国医学科学院 心血管病研究所 阜外心血管病医院)；任晓庆(现在上海第二医科大学)
关键词：原发性高血压；血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因；CA重复多态性
血管紧张素 【摘要】 目的 研究血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因(AT1R)3′端CA重复序列多态性在中国汉族人分布规律及与高血压病的关系。方法 应用扩增片段长度多态性方法，对来自山东和西安两地的汉族人群进行血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因3′端重复多态性分析。结果 在所研究人群中AT1R基因3′端重复序列存在9种等位基因(A1～A9)，扩增长度为130bp～146bp，其频率介于0.01～0.38，以扩增长度为140bp的A4等位基因最为常见，其次为A3和A7，分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，CA重复多态杂合率为0.789，多态信息量(PIC)为0.746。与白种人相比等位基因分布趋势无显著性差异，但个别等位基因相对频率存在不同程度的差异，白种人A4等位基因频率高于中国人。原发性高血压人群AT1R基因CA重复多态分布与正常人群有显著性差异(P<0.01)。结论AT1R基因3′端CA重复多态性标志与中国汉族人高血压病相关。
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Genetic linkage of polymorphisms of type Ⅰ angiotensin
Ⅱ receptor gene to Chinese Han hypertension
HU Aihua*, ZHOU Xianliang,REN Xiaoqing, CUI Zaoqiang, HUI Rutai, LIU Lisheng
*Fuwai Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of
Medical Sciences, P.R.China E-mail:aihuacn @ hot mail.com
【Abstract】 Objective To observe the CA repeat polymorphism of the type Ⅰ angiotensin Ⅱ receptor gene on Chinese Han people, and evaluate the genetic linking to hypertension.Methods The CA repeat polymorphism at 3′-flanking region of AT1R gene was studied by amplified fragment length polymorphism (Amp-FLP) in Chinese Han people from Shandong and Xi'an.Results There were 9 alleles ranging from 130bp to 146bp in all subjects. The allele frequencies were 0.01 to 0.38, and allele A4 was more frequent in the control.The heterozygosity of CA repeat locus was 0.789,the polymorphic information content, 0.746. There was no significant difference in distribution of CA repeat polymorphism genotype between different regions in same ethnic(P>0.05),but the allele frequency of CA repeat polymorphism in hypertensive group was significantly different from that of control (P<0.05).There was no detectable distortion from Hardy-Weinberg equilibrium in both groups.Conclusion The results suggest that CA repeat polymorphism of AT1R gene be associated with Chinese Han hypertensive people.
, 百拇医药
【Key words】 Essential hypertension Angiotensin Ⅱreceptor gene type Ⅰ CA repeat polymorphism
血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型(AT1R)是肾素-血管紧张素系统重要组成成分，介导血管舒缩、水盐代谢以及血管平滑肌增生和功能调节等生理学效应，是RAS系统作用于效应器的关键步骤，因而其基因被认为是高血压遗传学的致病候选基因(candidate gene)之一[1]。1994年Davies等[2]筛选出该基因位于3′端的CA重复序列多态性标记，对遗传学研究和原发性高血压(essential hypertension,EH)发病的预测具有一定的价值。EH是一种多基因疾病，有明显的种族异质性。
为研究我国汉族人AT1R基因3′端的CA重复序列多态性的分布特点，我们对山东和西安两地汉族人群进行了多态性分析，报告如下。
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1 对象及方法
1.1 对象 正常对照组：健康成人共95人(男64人，女31人)，年龄46±13岁，其中山东34人，西安61人。入选标准：年龄>40岁；收缩压<100mmHg(1mmHg=0.133kPa)和/或舒张压<80mmHg者；无EH治疗史，无EH家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病病史。EH组：共121人(男72人，女49人)，年龄48±11岁，其中山东、西安分别为52和69人。均符合WHO制定的EH诊断标准；发病年龄<60岁；EH长期治疗或收缩压>160mmHg和/或舒张压≥95mmHg者；有EH家族史即双亲至少一方和至少有一个同胞患有EH；排除继发性高血压、过度饮酒、服避孕药、糖尿病和肝肾疾病史。以上研究对象均为汉族，无血缘关系，无异族通婚家族史，生活在山东和西安两地。高血压家系：先证者，男，57岁，高血压病史20余年，家系调查3代15人中5人为高血压患者。所有成员均多次测量血压，并采集血液标本。其EH家系诊断标准为：先证者发病年龄<60岁；父母至少有一方为EH患者；同胞中至少有一位EH患者。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 AT1R 3′端重复序列体外PCR扩增 从外周血白细胞中，经蛋白酶K消化和酚/氯仿提取DNA。参照文献[2]合成5′端和3′端引物分别为5′AGGAG-
AAATGTTCCAAGGGACAA3′，5′GTATTCCATG-
TGAAACAGCTCCA3′，以γ-32PATP末端标记5′端引物。PCR反应体系为25μl。含2mmol/L dNTP，Taq聚合酶1U和1×Taq聚合酶缓冲液，7.5pmol上述标记的5′引物和7.5pmol未标记的3′引物，基因组DNA 50ng。PCR反应循环中95℃变性30，退火和延伸合并其温度为56℃ 20秒，进行30个循环周期结束后加入5μl终止液。
1.2.2 重复序列DNA等位基因测定 PCR产物经热变性后，使用含8mol尿素的6%变性聚丙烯酰胺凝胶，以1×TBE缓冲液，45W恒定功率，在Pharmacia公司生产的垂直测序凝胶电泳装置电泳3小时，然后将凝胶放置-70℃放射自显影数小时至过夜。同时采用PUC18载体进行DNA测序作为PCR产物长度标准，其产物与检测标本同时进行凝胶电泳，依据PUC18顺序梯级标志确认检测标本PCR扩增产物的bp长度，读出其基因型。
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1.2.3 DNA序列测定 PUC18载体DNA序列测定，采用Gibco-BRL公司的双链循环测序试剂盒，按其提供的操作程序进行PCR循环测序。以γ-32PATP末端标记5′端引物(1pmol)，测序每个循环的条件为：95℃，55℃，72℃，均为30秒，共30个循环周期，与检测标本共同行测序凝胶电泳。
1.2.4 临床生化测定 所有研究对象均进行病史、体检、实验室检查，检测身高、体重、收缩压和舒张压。并应用全自动生化测定仪测定血胆固醇(Ch)、甘油三酯(TG)和血糖(Glu)水平。
1.2.5 资料分析 计算各组基因型及等位基因频率，按Hardy-Weinberg平衡法确定各样本该基因的群体代表性。用χ2或有关校正法检验各组基因型及等位基因频率的差异，P<0.05为有显著性差异，并计算基因杂合度(H)和多态信息量(PIC)。
2 结果
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2.1 EH组和对照组临床特点 临床资料由表1显示：EH组的收缩压、舒张压显著高于对照组(P<0.05)，两组间性别构成无统计学差异(χ2＝1.09，P>0.05)，年龄、体重指数(BMI)[BMI＝体重(kg)/身高(m2)]相匹配无显著性差异(P>0.05)。两组间临床生化资料均无显著性差异(P>0.05)。
表1 EH组和对照组临床资料比较(
±s)
Tab 1 Comparison of clinical data between EH and control groups(±s)
, 百拇医药
Hypertension(高血压组)
(n=121)
Control(对照组)
(n=95)
Sex(male/female)
72/49
64/31
Age(year)
48±
11
46±
13
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BMI(kg/m2)
24±
3.5
23±
4.6
SBP(mmHg)
158±
17*
15.2±
1.73
DBP(mmHg)
98±
, 百拇医药
8*
10.14±
0.94
Ch(mmol/L)
4.71±
1.2
4.68±
1.0
TG(mmol/L)
1.41±
0.63
1.38±
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0.52
Glu
4.9±
0.64
4.5±
0.71
*P<0.05 compared with control(*P<0.05与对照组比较)
2.2 健康群体AT1R基因3′重复序列等位基因多态性 用同位素32P标记PCR扩增AT1R基因3′端重复序列，产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影(见图1部分等位基因)，产物长度用已知的PUC18质粒DNA序列界定，在汉族健康人中共检出9种等位基因，片段大小在130～146bp，由大到小命名为A1～A9(A为allele的缩写)。表2显示：在对照组AT1R基因(CA)n重复序列存在9种等位基因，PCR扩增长度介于130～146bp之间，频率分布在0.01～0.38，以含140bp的等位基因A4为多见，频率约占0.38，其次为等位基因A3、A7及A6，其余均少见。山东和西安两地健康群体间的等位基因频率分布趋势相似，经χ2检验无显著性差异(χ2＝1.97，df=6，P＝0.92)。故将两地合并成一组进行分析。鉴于我们的分析方法同在法国白种人一致[2]，故列出作一比较，白种人AT1R微卫星等位基因频率与中国人对照组比较无统计学差异(χ2＝9.8，P＝0.20)。两种族均以等位基因A4多见，但中国人A4频率显著低于白种人(χ2yates=23，P<0.01)。此外，中国人中可见等位基因A9。经检验基因型分布观察值与期望值相吻合均符合Hardy-Weinberg平衡。其杂合度为0.789，多态信息量(PIC)为0.746。
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表2 对照组AT1R基因3′端重复序列等位基因分布
Tab 2 Distribution of allele frequencies for the AT1R CA repeat polymorphism in control group
Allele
(等位基因)
Allele length(bp)
(等位片段长度)
Allele frequency(等位基因频率)
Shandong(n=34)
(山东人)
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Xi′an(n=61)
(西安人)
Total(n=95)
(总计)
French(n＝112)
(法国白种人)
A1
146
0.01
0.01
0.01
0.01
, 百拇医药 A2
144
0.09
0.09
0.09
0.10
A3
142
0.12
0.17
0.15
0.18
A4
, 百拇医药
140
0.38
0.38
0.38
0.46
A5
138
0.10
0.07
0.08
0.04
A6
136
, 百拇医药
0.09
0.11
0.10
0.09
A7
134
0.15
0.12
0.13
0.11
A8
132
0.03
, 百拇医药
0.04
0.04
0.02
A9
130
0.03
0.02
0.02
χ2=1.97
χ2=9.8
P=0.92
P＝0.20
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图1 EH组与对照组AT1R基因3′端重复序列多态性比较
Fig 1 Comparison of CA repeat polymorphism between EH and control groups
2.3 EH组AT1R基因3′端重复序列多态性 由表3显示：山东、西安两地EH人群AT1R微卫星等位基因分布无显著性差异(χ2＝3.45，df=7，P＝0.84)。其等位基因频率分布在0.01～0.33，以等位基因A4最为多见，频率为0.33，其次为A2和A3，频率均为0.20。 表3 EH组AT1R基因3′端重复序列等位基因分布
Tab 3 Distribution of allele frequencies for the AT1R CA repeat polymorphism in EH group
, 百拇医药
Allele
(等位基因)
Allele length
(bp)
(等位片
段长度)
Allele distribution(等位基因频率)
Shandong(n=52)
(山东人)
Xi′an(n=69)
(西安人)
A1
, 百拇医药
146
0.04
0.05
A2
144
0.20
0.19
A3
142
0.18
0.22
A4
140
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0.34
0.33
A5
138
0.09
0.04
A6
136
0.06
0.07
A7
134
0.08
, 百拇医药
0.07
A8
132
0.01
0.01
A9
130
0.01
0.01
χ2=3.45
P＝0.84
2.4 EH组与对照组3′端重复序列多态性分布比较 两组人群的等位基因频率分布有显著性的统计学差异(χ2＝24.15，df=8，P<0.01)，见图1。个别等位基因比较中，EH组等位基因A2频率明显高于正常对照组(20%∶9%,χ2yates=6.67，P<0.01)，优势比(OR)为2.217，95%可信限0.023～0.140。提示AT1R基因3′端重复序列多态性与EH相关联，等位基因A2可能是EH发病的易患因素。
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2.5 家系分析 从家系图2也可看出，基因型相同的个体，表现型可以不同，说明还有其它因素参与EH的发病过程，证实EH是一个复杂的多基因疾病。
图2 高血压病家系和CA重复序列放射自显影图 等位基因A2(144bp)、A3(142bp)、A4(140bp)、A5(138bp)基因型从左至右依为A3A3、A3A3、A3A3、A3A4、A3A4、A3A4、A3A3、A3A3、A3A3、A3A5、A2A3、A2A5、A3A3及A2A5分别与家系中从左至右个体相对应
Fig 2 Pedigree analysis of essential hypertension and autoradiography of CA repeat polymorphism
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3 讨论
Furuta等[3]于1992年首先克隆了人AT1R基因的cDNA。该基因定位于染色体3q21-3q25，属于单拷贝基因，长度大约5kb，至少含5个外显子[4]。Davies等[2]采用PCR扩增AT1R基因3′端CA重复序列，对法国人类多态研究中心(CEPH)人群及家系进行分析，发现该位点有8种等位基因，其长度为132～146bp，频率分布在0.01～0.46，以扩增长度为140bp的A4等位基因最为常见。该基因多态性的杂合率为0.73。家系调查发现该位点等位基因按常染色体共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。以后有人[5，6]在白种人中进行了该基因座与高血压表型的群体关联研究。
我们分析的两个不同地区的健康汉族人群的AT1R基因3′端重复序列多态性结果显示：该位点有9个等位基因，分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传定律，说明该基因已达到遗传平衡，具有群体代表性；杂合率为0.789，PIC为0.746，提示该位点能提供丰富的多态信息量，可用作遗传多态标记研究该基因与疾病的关联关系。确认该多态性在普通群体中等位基因频率分布是研究这种关联的先决条件。现有资料发现：同一种族不同地区群体该多态等位基因频率分布趋势一致，差异无显著意义(P>0.05)。不同种族群体，中国汉族人与西方白种人相比基因大小、数目和等位基因分布具有相似之处(P>0.05)，但某些等位基因频率有不同程度的差异[2]。提示该等位基因频率在种族间及不同地区间的中国汉族人无显著性差异。
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研究中发现，EH人群的AT1R基因3′重复序列等位基因频率分布趋势与对照组相比有非常显著性的差异(P<0.01)，EH组A2等位基因频率较对照组显著增加(P<0.01)，优势比为2.217，可信限(0.023～0.140)，提示AT1R 3′端CA重复序列多态性与EH表型相连锁，等位基因A2可能是EH发病的危险因素。这一结果与在西方人群中的研究结论有所不同[5-7]，推测可能是种族、地域的差异以及样本量大小的原因。
目前对AT1R基因的重复序列多态性与EH表型相关联的确切机理及意义仍不清楚，该重复序列多态性标志位于AT1R基因3′端的非编码区，推测对AT1R基因转录和翻译不会产生直接影响，有可能与AT1R基因的某一功能性核苷酸序列存在连锁不平衡，导致AT1R基因功能变化。AT1R基因3′重复序列多态性与EH相关联，但并不能完全证实AT1R就是EH发病的易感基因，也可能是紧密靠近该多态性的其它基因位点与EH表型有关，因而它也许仅能作为一种寻找EH易感基因标
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记[4]，而我们的家系研究也发现基因型相同的个体，其EH表型可以不同，说明还有其它因素参与EH的发病过程，进一步证实EH是一个复杂的多基因疾病。
本项目由国家自然科学基金(39470630)资助
参考文献
[1] Soubrier F. Search for the genes of human essential hypertension. J Hypertension, 1993,11 Suppl 5∶S20-27.
[2] Davies E, Bonnaardeaux A, Lathrop GM,et al.Human angiontensin Ⅱ(type-1) receptor locus:CA repeat polymorphism and genetic mapping. Hum Mol Genet, 1994,3(3)∶838.
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[3] Furuta H, Gao D, Inagami T. Molecular cloning and sequencing of the gene enconding human AT1R.Biochem Biophys Res Commun, 1992,183(1)∶8-13.
[4] Curnow KM, White PC, Pascoe L. Genetic analysis of the human type-1 angiontensin Ⅱ receptor. Mol Endocrinol, 1992, 6(7)∶1113-1118.
[5] Bonnardeaux A, Davies E, Jeunemaitre X,et al.Angiontensin Ⅱ type-1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension. Hypertension, 1994,24(1)∶63-69.
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[6] Badenhop RF, Wang XL, Wilcken DEL. Association between an ATG microsatellite marker in children and coronary events in their grandparents. Circulation, 1996,93(12)∶2092-2096.
[7] Jeffreys AJ, Neumann R, Wijson V. Repeat unite sequence variation in minisatellite: a novel source of DNA polymorphism for studying variation and mutation by single molecular analysis.Cell, 1990,60(3)∶473-485.
(收稿：1998-04-26 修回：1998-08-26), 百拇医药
单位：胡爱华 周宪梁 崔兆强 惠汝太 刘力生(100037北京，中国协和医科大学 中国医学科学院 心血管病研究所 阜外心血管病医院)；任晓庆(现在上海第二医科大学)
关键词：原发性高血压；血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因；CA重复多态性
血管紧张素 【摘要】 目的 研究血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因(AT1R)3′端CA重复序列多态性在中国汉族人分布规律及与高血压病的关系。方法 应用扩增片段长度多态性方法，对来自山东和西安两地的汉族人群进行血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型基因3′端重复多态性分析。结果 在所研究人群中AT1R基因3′端重复序列存在9种等位基因(A1～A9)，扩增长度为130bp～146bp，其频率介于0.01～0.38，以扩增长度为140bp的A4等位基因最为常见，其次为A3和A7，分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，CA重复多态杂合率为0.789，多态信息量(PIC)为0.746。与白种人相比等位基因分布趋势无显著性差异，但个别等位基因相对频率存在不同程度的差异，白种人A4等位基因频率高于中国人。原发性高血压人群AT1R基因CA重复多态分布与正常人群有显著性差异(P<0.01)。结论AT1R基因3′端CA重复多态性标志与中国汉族人高血压病相关。
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Genetic linkage of polymorphisms of type Ⅰ angiotensin
Ⅱ receptor gene to Chinese Han hypertension
HU Aihua*, ZHOU Xianliang,REN Xiaoqing, CUI Zaoqiang, HUI Rutai, LIU Lisheng
*Fuwai Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of
Medical Sciences, P.R.China E-mail:aihuacn @ hot mail.com
【Abstract】 Objective To observe the CA repeat polymorphism of the type Ⅰ angiotensin Ⅱ receptor gene on Chinese Han people, and evaluate the genetic linking to hypertension.Methods The CA repeat polymorphism at 3′-flanking region of AT1R gene was studied by amplified fragment length polymorphism (Amp-FLP) in Chinese Han people from Shandong and Xi'an.Results There were 9 alleles ranging from 130bp to 146bp in all subjects. The allele frequencies were 0.01 to 0.38, and allele A4 was more frequent in the control.The heterozygosity of CA repeat locus was 0.789,the polymorphic information content, 0.746. There was no significant difference in distribution of CA repeat polymorphism genotype between different regions in same ethnic(P>0.05),but the allele frequency of CA repeat polymorphism in hypertensive group was significantly different from that of control (P<0.05).There was no detectable distortion from Hardy-Weinberg equilibrium in both groups.Conclusion The results suggest that CA repeat polymorphism of AT1R gene be associated with Chinese Han hypertensive people.
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【Key words】 Essential hypertension Angiotensin Ⅱreceptor gene type Ⅰ CA repeat polymorphism
血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型(AT1R)是肾素-血管紧张素系统重要组成成分，介导血管舒缩、水盐代谢以及血管平滑肌增生和功能调节等生理学效应，是RAS系统作用于效应器的关键步骤，因而其基因被认为是高血压遗传学的致病候选基因(candidate gene)之一[1]。1994年Davies等[2]筛选出该基因位于3′端的CA重复序列多态性标记，对遗传学研究和原发性高血压(essential hypertension,EH)发病的预测具有一定的价值。EH是一种多基因疾病，有明显的种族异质性。
为研究我国汉族人AT1R基因3′端的CA重复序列多态性的分布特点，我们对山东和西安两地汉族人群进行了多态性分析，报告如下。
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1 对象及方法
1.1 对象 正常对照组：健康成人共95人(男64人，女31人)，年龄46±13岁，其中山东34人，西安61人。入选标准：年龄>40岁；收缩压<100mmHg(1mmHg=0.133kPa)和/或舒张压<80mmHg者；无EH治疗史，无EH家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病病史。EH组：共121人(男72人，女49人)，年龄48±11岁，其中山东、西安分别为52和69人。均符合WHO制定的EH诊断标准；发病年龄<60岁；EH长期治疗或收缩压>160mmHg和/或舒张压≥95mmHg者；有EH家族史即双亲至少一方和至少有一个同胞患有EH；排除继发性高血压、过度饮酒、服避孕药、糖尿病和肝肾疾病史。以上研究对象均为汉族，无血缘关系，无异族通婚家族史，生活在山东和西安两地。高血压家系：先证者，男，57岁，高血压病史20余年，家系调查3代15人中5人为高血压患者。所有成员均多次测量血压，并采集血液标本。其EH家系诊断标准为：先证者发病年龄<60岁；父母至少有一方为EH患者；同胞中至少有一位EH患者。
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1.2 方法
1.2.1 AT1R 3′端重复序列体外PCR扩增 从外周血白细胞中，经蛋白酶K消化和酚/氯仿提取DNA。参照文献[2]合成5′端和3′端引物分别为5′AGGAG-
AAATGTTCCAAGGGACAA3′，5′GTATTCCATG-
TGAAACAGCTCCA3′，以γ-32PATP末端标记5′端引物。PCR反应体系为25μl。含2mmol/L dNTP，Taq聚合酶1U和1×Taq聚合酶缓冲液，7.5pmol上述标记的5′引物和7.5pmol未标记的3′引物，基因组DNA 50ng。PCR反应循环中95℃变性30，退火和延伸合并其温度为56℃ 20秒，进行30个循环周期结束后加入5μl终止液。
1.2.2 重复序列DNA等位基因测定 PCR产物经热变性后，使用含8mol尿素的6%变性聚丙烯酰胺凝胶，以1×TBE缓冲液，45W恒定功率，在Pharmacia公司生产的垂直测序凝胶电泳装置电泳3小时，然后将凝胶放置-70℃放射自显影数小时至过夜。同时采用PUC18载体进行DNA测序作为PCR产物长度标准，其产物与检测标本同时进行凝胶电泳，依据PUC18顺序梯级标志确认检测标本PCR扩增产物的bp长度，读出其基因型。
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1.2.3 DNA序列测定 PUC18载体DNA序列测定，采用Gibco-BRL公司的双链循环测序试剂盒，按其提供的操作程序进行PCR循环测序。以γ-32PATP末端标记5′端引物(1pmol)，测序每个循环的条件为：95℃，55℃，72℃，均为30秒，共30个循环周期，与检测标本共同行测序凝胶电泳。
1.2.4 临床生化测定 所有研究对象均进行病史、体检、实验室检查，检测身高、体重、收缩压和舒张压。并应用全自动生化测定仪测定血胆固醇(Ch)、甘油三酯(TG)和血糖(Glu)水平。
1.2.5 资料分析 计算各组基因型及等位基因频率，按Hardy-Weinberg平衡法确定各样本该基因的群体代表性。用χ2或有关校正法检验各组基因型及等位基因频率的差异，P<0.05为有显著性差异，并计算基因杂合度(H)和多态信息量(PIC)。
2 结果
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2.1 EH组和对照组临床特点 临床资料由表1显示：EH组的收缩压、舒张压显著高于对照组(P<0.05)，两组间性别构成无统计学差异(χ2＝1.09，P>0.05)，年龄、体重指数(BMI)[BMI＝体重(kg)/身高(m2)]相匹配无显著性差异(P>0.05)。两组间临床生化资料均无显著性差异(P>0.05)。
表1 EH组和对照组临床资料比较(
±s)Tab 1 Comparison of clinical data between EH and control groups(
±s), 百拇医药
Hypertension(高血压组)
(n=121)
Control(对照组)
(n=95)
Sex(male/female)
72/49
64/31
Age(year)
48±
11
46±
13
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BMI(kg/m2)
24±
3.5
23±
4.6
SBP(mmHg)
158±
17*
15.2±
1.73
DBP(mmHg)
98±
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8*
10.14±
0.94
Ch(mmol/L)
4.71±
1.2
4.68±
1.0
TG(mmol/L)
1.41±
0.63
1.38±
, http://www.100md.com
0.52
Glu
4.9±
0.64
4.5±
0.71
*P<0.05 compared with control(*P<0.05与对照组比较)
2.2 健康群体AT1R基因3′重复序列等位基因多态性 用同位素32P标记PCR扩增AT1R基因3′端重复序列，产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影(见图1部分等位基因)，产物长度用已知的PUC18质粒DNA序列界定，在汉族健康人中共检出9种等位基因，片段大小在130～146bp，由大到小命名为A1～A9(A为allele的缩写)。表2显示：在对照组AT1R基因(CA)n重复序列存在9种等位基因，PCR扩增长度介于130～146bp之间，频率分布在0.01～0.38，以含140bp的等位基因A4为多见，频率约占0.38，其次为等位基因A3、A7及A6，其余均少见。山东和西安两地健康群体间的等位基因频率分布趋势相似，经χ2检验无显著性差异(χ2＝1.97，df=6，P＝0.92)。故将两地合并成一组进行分析。鉴于我们的分析方法同在法国白种人一致[2]，故列出作一比较，白种人AT1R微卫星等位基因频率与中国人对照组比较无统计学差异(χ2＝9.8，P＝0.20)。两种族均以等位基因A4多见，但中国人A4频率显著低于白种人(χ2yates=23，P<0.01)。此外，中国人中可见等位基因A9。经检验基因型分布观察值与期望值相吻合均符合Hardy-Weinberg平衡。其杂合度为0.789，多态信息量(PIC)为0.746。
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表2 对照组AT1R基因3′端重复序列等位基因分布
Tab 2 Distribution of allele frequencies for the AT1R CA repeat polymorphism in control group
Allele
(等位基因)
Allele length(bp)
(等位片段长度)
Allele frequency(等位基因频率)
Shandong(n=34)
(山东人)
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Xi′an(n=61)
(西安人)
Total(n=95)
(总计)
French(n＝112)
(法国白种人)
A1
146
0.01
0.01
0.01
0.01
, 百拇医药 A2
144
0.09
0.09
0.09
0.10
A3
142
0.12
0.17
0.15
0.18
A4
, 百拇医药
140
0.38
0.38
0.38
0.46
A5
138
0.10
0.07
0.08
0.04
A6
136
, 百拇医药
0.09
0.11
0.10
0.09
A7
134
0.15
0.12
0.13
0.11
A8
132
0.03
, 百拇医药
0.04
0.04
0.02
A9
130
0.03
0.02
0.02
χ2=1.97
χ2=9.8
P=0.92
P＝0.20
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图1 EH组与对照组AT1R基因3′端重复序列多态性比较
Fig 1 Comparison of CA repeat polymorphism between EH and control groups
2.3 EH组AT1R基因3′端重复序列多态性 由表3显示：山东、西安两地EH人群AT1R微卫星等位基因分布无显著性差异(χ2＝3.45，df=7，P＝0.84)。其等位基因频率分布在0.01～0.33，以等位基因A4最为多见，频率为0.33，其次为A2和A3，频率均为0.20。 表3 EH组AT1R基因3′端重复序列等位基因分布
Tab 3 Distribution of allele frequencies for the AT1R CA repeat polymorphism in EH group
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Allele
(等位基因)
Allele length
(bp)
(等位片
段长度)
Allele distribution(等位基因频率)
Shandong(n=52)
(山东人)
Xi′an(n=69)
(西安人)
A1
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146
0.04
0.05
A2
144
0.20
0.19
A3
142
0.18
0.22
A4
140
, http://www.100md.com
0.34
0.33
A5
138
0.09
0.04
A6
136
0.06
0.07
A7
134
0.08
, 百拇医药
0.07
A8
132
0.01
0.01
A9
130
0.01
0.01
χ2=3.45
P＝0.84
2.4 EH组与对照组3′端重复序列多态性分布比较 两组人群的等位基因频率分布有显著性的统计学差异(χ2＝24.15，df=8，P<0.01)，见图1。个别等位基因比较中，EH组等位基因A2频率明显高于正常对照组(20%∶9%,χ2yates=6.67，P<0.01)，优势比(OR)为2.217，95%可信限0.023～0.140。提示AT1R基因3′端重复序列多态性与EH相关联，等位基因A2可能是EH发病的易患因素。
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2.5 家系分析 从家系图2也可看出，基因型相同的个体，表现型可以不同，说明还有其它因素参与EH的发病过程，证实EH是一个复杂的多基因疾病。
图2 高血压病家系和CA重复序列放射自显影图 等位基因A2(144bp)、A3(142bp)、A4(140bp)、A5(138bp)基因型从左至右依为A3A3、A3A3、A3A3、A3A4、A3A4、A3A4、A3A3、A3A3、A3A3、A3A5、A2A3、A2A5、A3A3及A2A5分别与家系中从左至右个体相对应
Fig 2 Pedigree analysis of essential hypertension and autoradiography of CA repeat polymorphism
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3 讨论
Furuta等[3]于1992年首先克隆了人AT1R基因的cDNA。该基因定位于染色体3q21-3q25，属于单拷贝基因，长度大约5kb，至少含5个外显子[4]。Davies等[2]采用PCR扩增AT1R基因3′端CA重复序列，对法国人类多态研究中心(CEPH)人群及家系进行分析，发现该位点有8种等位基因，其长度为132～146bp，频率分布在0.01～0.46，以扩增长度为140bp的A4等位基因最为常见。该基因多态性的杂合率为0.73。家系调查发现该位点等位基因按常染色体共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。以后有人[5，6]在白种人中进行了该基因座与高血压表型的群体关联研究。
我们分析的两个不同地区的健康汉族人群的AT1R基因3′端重复序列多态性结果显示：该位点有9个等位基因，分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传定律，说明该基因已达到遗传平衡，具有群体代表性；杂合率为0.789，PIC为0.746，提示该位点能提供丰富的多态信息量，可用作遗传多态标记研究该基因与疾病的关联关系。确认该多态性在普通群体中等位基因频率分布是研究这种关联的先决条件。现有资料发现：同一种族不同地区群体该多态等位基因频率分布趋势一致，差异无显著意义(P>0.05)。不同种族群体，中国汉族人与西方白种人相比基因大小、数目和等位基因分布具有相似之处(P>0.05)，但某些等位基因频率有不同程度的差异[2]。提示该等位基因频率在种族间及不同地区间的中国汉族人无显著性差异。
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研究中发现，EH人群的AT1R基因3′重复序列等位基因频率分布趋势与对照组相比有非常显著性的差异(P<0.01)，EH组A2等位基因频率较对照组显著增加(P<0.01)，优势比为2.217，可信限(0.023～0.140)，提示AT1R 3′端CA重复序列多态性与EH表型相连锁，等位基因A2可能是EH发病的危险因素。这一结果与在西方人群中的研究结论有所不同[5-7]，推测可能是种族、地域的差异以及样本量大小的原因。
目前对AT1R基因的重复序列多态性与EH表型相关联的确切机理及意义仍不清楚，该重复序列多态性标志位于AT1R基因3′端的非编码区，推测对AT1R基因转录和翻译不会产生直接影响，有可能与AT1R基因的某一功能性核苷酸序列存在连锁不平衡，导致AT1R基因功能变化。AT1R基因3′重复序列多态性与EH相关联，但并不能完全证实AT1R就是EH发病的易感基因，也可能是紧密靠近该多态性的其它基因位点与EH表型有关，因而它也许仅能作为一种寻找EH易感基因标
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记[4]，而我们的家系研究也发现基因型相同的个体，其EH表型可以不同，说明还有其它因素参与EH的发病过程，进一步证实EH是一个复杂的多基因疾病。
本项目由国家自然科学基金(39470630)资助
参考文献
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, 百拇医药
[3] Furuta H, Gao D, Inagami T. Molecular cloning and sequencing of the gene enconding human AT1R.Biochem Biophys Res Commun, 1992,183(1)∶8-13.
[4] Curnow KM, White PC, Pascoe L. Genetic analysis of the human type-1 angiontensin Ⅱ receptor. Mol Endocrinol, 1992, 6(7)∶1113-1118.
[5] Bonnardeaux A, Davies E, Jeunemaitre X,et al.Angiontensin Ⅱ type-1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension. Hypertension, 1994,24(1)∶63-69.
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[6] Badenhop RF, Wang XL, Wilcken DEL. Association between an ATG microsatellite marker in children and coronary events in their grandparents. Circulation, 1996,93(12)∶2092-2096.
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(收稿：1998-04-26 修回：1998-08-26), 百拇医药