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编号:10257755
Y染色体特异短串联重复序列初步研究
http://www.100md.com 《中华医学遗传学杂志》 1999年第2期
     作者:侯一平* 吴谨 李英碧 张霁 张思仲 褚嘉佑 M.Prinz

    单位:侯一平 吴谨 李英碧 张霁(610041 成都,华西医科大学法医学系),张思仲(医学遗传学教研室);褚嘉佑(中国医学科学院医学生物学研究所);M.Prinz(Department of Forensic Biology, Office of Chief Medical Examiner, New York,USA)

    关键词:聚合酶链反应;遗传多态性;短串联重复序列;Y染色体

    中华医学遗传学杂志990201 【摘要】 目的 了解人类Y染色体特异短串联重复序列等位片段结构特征,揭示成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座的遗传多态性。方法 无血缘关系样本采自成都地区汉族群体。PCR扩增5个Y染色体特异STR基因座。PCR产物由非变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统水平电泳分型和自动激光荧光测序仪分析。结果 观察到人类Y染色体特异STR等位片段具有复杂的串联重复结构。制备了5个Y染色体特异STR基因座分型标准物用于分型。观察到我国人群5个Y染色体特异STR基因座均具有遗传多态性。获得了成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座的等位基因频率。结论 本研究为群体遗传亲缘关系分析提供了高效遗传标记,为研究我国人群Y染色体特异STR的群体遗传提供了具有可比性的资料,为研究人类近期进化事件提供了新的可能性。
, 百拇医药
    A preliminary study of human Y chromosome specific short tandem repeat loci

    HOU Yiping*, WU Jin, LI Yingbi, ZHANG Ji, ZHANG Sizhong, ZHU Jiayou, M.Prinz.

    *Institute of Forensic Medicine, West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041, P.R.China E-mail:rechtsme @ wucms.edu.cn

    【Abstract】 Objective To understand the allele structure and reveal genetic polymorphism of Y chromosome specific short tandem repeat (Y-specific STR) loci in Chinese Han population. Methods The authors used a set of five Y-specific STR loci which were tetrameric tandem repeat loci chosen from the Genome Database. EDTA-blood specimens were collected from the unrelated individuals. DNA was extracted by Chelex method and amplified by the polymerase chain reaction(PCR). The PCR products were analyzed using both the PAGE horizontal electrophoresis with discontinuous buffer system and the automated fluorescence detection approach. Results The authors observed that the alleles at the five Y-specific STR loci were composed of some complex repeat structures. They successfully prepared a set of human allele ladders for the typing of the five Y-specific STRs and demonstrated the polymorphisms at the five Y-specific STR loci in Chinese Han population. Conclusion Y-specific STRs are good genetic markers for the purpose of analysis of genetic relationship between populations. This preliminary study not only reveals allele frequencies and haplotype distribution of Y-specific STR in Chinese Han population, but also indicates a reference population for detecting male migration events and for reconstructing paternal history.
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    【Key words】 Short tandem repeats Polymerase chain reaction Genetic polymorphism Y chromosome

    人类Y染色体除拟常染区(pseudoautosomal region)外,大部分不与X染色体重组,这些非重组部分只能从父亲遗传给儿子,每条Y染色体非重组部分的DNA序列保存有发生在前辈的突变记录,这些突变是形成Y染色体非重组部分DNA多态性的根源。研究群体中Y染色体非重组部分DNA多态性,可以追溯过去发生的男性迁移,重构父系进化史[1,2]。现已发现了一些Y染色体特异短串联重复序列(Y chromosome specific short tandem repeat,简称Y染色体特异STR),为研究群体亲缘关系提供了新型的遗传标记来源[3-9]。我们对成都地区汉族群体DYS19、DYS389、DYS390、DYS391和DYS393等5个Y染色体特异STR基因座进行了研究,旨在了解中国人5个Y染色体特异STR基因座等位片段结构特征,揭示成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座的遗传多态性。
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    1 材料与方法

    1.1 样本DNA 82份EDTA抗凝血采自中国成都地区无血缘关系汉族个体。Chelex法提取

    DNA[10]

    1.2 PCR扩增 5个Y染色体特异STR基因座分别是DYS19、DYS389、DYS390、DYS391和DYS393。引物序列选自基因组数据库(The Genome Database, The Johns Hopkins University, Baltimore, USA,简称GDB),由GIBCOBRL合成。每一扩增样本含人类基因组DNA2 ~40ng,1×PCR缓冲液,1.5mmol/L MgCl2,150μmol/L dNTP,1U Taq聚合酶(GIBCOBRL),每一种引物0.25μmol/L,反应体积25μl,在热循环仪(PE9600)中,按表1参数循环28次。
, 百拇医药
    表1 5个Y染色体特异STR基因座及PCR条件

    Tab 1 Five Y-specific STR loci and the PCR condition Name

    (基因座)

    Denature

    (变性)

    Annealing

    (退火)

    Extension

    (延伸)

    DYS19

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    58℃/30 sec

    72℃/1 min

    DYS389

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    DYS390

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    56℃/40 sec

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    DYS391

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, 百拇医药
    56℃/40 sec

    72℃/1 min

    DYS393

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    1.3 PCR产物检测和等位基因的确定 5个Y染色体特异STR基因座PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统水平电泳分离[11],银染显示电泳谱带。样本PCR产物与等位基因分型标准物同步电泳,比较样本PCR产物的电泳谱带对应分型标准物所处的位置,确定样本表型。等位基因分型标准物由不同表型个体的DNA混合后按1.2方法进行PCR扩增制备,制备的分型标准物与测定序列的样本同步电泳,按国际法医血液遗传学会DNA委员会推荐原则[12,13]和Knijff和Roewer等的建议命名等位基因。
, 百拇医药
    1.4 每一基因座用自动激光荧光测序仪(ABI377,Department of Forensic Biology, OCME,New York, USA)重复检测20份样本,确保实验室间分型结果的可比性和可重复性。DNA序列分析采用PCR循环测序法,用自动激光荧光测序仪测定。

    2 结果

    2.1 等位基因结构及命名 为了揭示DYS19、DYS389、DYS390、DYS391和DYS393等5个Y染色体特异STR基因座等位片段结构特征,采用自动激光荧光测序仪对所选样本进行了测序。表2显示成都地区汉族群体5个Y染色体特异STR基因座最常见等位片段结构。

    表2 Y染色体特异STR基因座核心序列结构

    Tab 2 The sequence structure of the motifs of Y-specific STR loci Locus
, 百拇医药
    (基因座)

    Sequence structure of the motifs

    (核心序列结构)

    Allele with sequencing

    (按测序命名

    的等位基因)

    Allele without sequencing

    (按不测序命名

    的等位基因)

    DYS19

    5′TAGATAGATAGATAGGTAGATAGATAGATAGATA-
, 百拇医药
    GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA3′

    3-12

    15

    DYS389

    5′TCTGTCTGTCTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTA-

    TCTATCTATCTA

    3-9

    12

    DYS390

    5′TCTATCTATCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGT-
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    CTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT-

    ATCTATCTGTCTATCTATCTATCTA3′

    8-10-1-4

    23

    DYS391

    5′TCTGTCTGTCTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTA-

    TCTATCTATCTATCTATCTG3′

    10

    10

    DYS393
, 百拇医药
    5′AGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA-

    TAGATAGATAGATATGTATGT3′

    12

    12

    表2中,斜体字母代表用于计数的重复序列,画线部分代表不具有多态性的重复序列。按国际法医血液遗传学会DNA委员会推荐原则[12,13],既考虑核心序列重复次数,也包含碱基信息,Knijff和Roewer提出了新的Y染色体特异STR等位基因命名法(个人通讯),包括不测序等位基因命名法和测序等位基因命名法。DYS19含有两个GATA重复区,仅有第二个重复区具有多态性,表2中DYS19等位基因的两个GATA重复区共含有15个GATA重复结构,按Knijff和Roewer的不测序等位基因命名法称为DYS19*15,按测序等位基因命名法称为DYS19*3-12。DYS389含有两种重复结构,分别是(TCTG)n和(TCTG)n,表2中DYS389等位基因共含有3个TCTA重复和9个TCTA重复结构,按不测序等位基因命名法称为DYS389*12,按测序等位基因命名法称为DYS389*3-9。DYS390含有两个重复结构,分别是(TCTA)n和(TCTA)n,表2中DYS390等位基因的两个重复结构共含有8个TCTG重复,10个TCTA重复,1个TCTG重复和4个TCTA重复结构,按不测序等位基因命名法称为DYS390*23,按测序等位基因命名法称为DYS390*8-10-1-4。尽管DYS391含有两个重复结构,分别是(TCTG)n和(TCTA)n,仅有(TCTA)n具有多态性,表2中DYS391等位基因含有10个TCTA重复结构,按不测序等位基因命名法和测序等位基因命名法均称为DYS391*10。DYS393含有一个AGAT重复区,按不测序等位基因命名法和测序等位基因命名法均称为DYS393*12。
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    2.2 等位基因分型标准物构建及Y染色体特异STR分型 采用混合不同基因型个体DNA进行PCR扩增,PCR扩增产物与测定序列样本同步电泳的方法,制备了5个Y染色体特异STR基因座分型标准物。图1~3给出了人类等位基因分型标准物的电泳图谱以及在人类等位基因分型标准物对照下,电泳测定不同个体表型的实例。人类等位基因分型标准物按不测序等位基因命名法命名。例如,DYS393基因座在成都汉族群体样本中共有4个等位片段,其核心序列AGAT的重复次数为12~15。因此,这4个等位基因分别命名为:12、13、14、15。

    图1 自制等位基因标准物对照下不同个体DYS389电泳分型

    Fig 1 DYS389 typing with the home made allele ladder
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    图2 自制等位基因标准物对照下不同个体DYS390电泳分型

    Fig 2 DYS390 typing with the home made allele ladder

    图3 自制等位基因标准物对照下不同个体DYS393电泳分型

    Fig 3 DYS393 typing with the home made allele ladder

    2.3 成都地区汉族群体Y染色体特异STR基因座等位基因频率 5个Y染色体特异STR基因座在成都汉族群体均具有遗传多态性。DYS19基因座存在6个等位基因,DYS389基因座存在4个等位基因,DYS390基因座存在5个等位基因,DYS391基因座存在4个等位基因,DYS393基因座存在4个等位基因。5个Y染色体特异STR基因座等位基因频率见表3。表3 成都汉族群体5个Y染色体特异STR等位基因频率
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    Tab 3 The frequencies of alleles at five Y-specific STR loci in Han population in Chengdu Name

    (基因座)

    No.of samples

    (样本数)

    Allele

    (等位基因)

    DYS19

    13

    14

    15

, http://www.100md.com     16

    17

    18

    observed

    82

    3

    14

    49

    12

    3

    1

    frequency

    0.0366

, 百拇医药     0.1707

    0.5976

    0.1463

    0.0366

    0.0122

    DYS389

    11

    12

    13

    14

    observed

    82

    1
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    42

    26

    13

    frequency

    0.0122

    0.5122

    0.3171

    0.1585

    DYS390

    22

    23

    24

    25
, 百拇医药
    26

    observed

    82

    3

    40

    27

    9

    3

    frequency

    0.0366

    0.4878

    0.3292

    0.1098
, 百拇医药
    0.0366

    DYS391

    6

    9

    10

    11

    observed

    82

    2

    2

    57

    21

    frequency
, 百拇医药
    0.0244

    0.0244

    0.6951

    0.2561

    DYS393

    12

    13

    14

    15

    observed

    82

    35

    24
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    17

    6

    frequency

    0.4268

    0.2927

    0.2073

    0.0732

    2.4 成都地区汉族群体5个Y染色体特异STR基因座的单倍型构成 在成都汉族群体样本中,5个Y染色体特异STR基因座共观察到58种单倍型,其中11种单倍型至少为两名以上个体分享(表4),图4给出了全部58种单倍型频率。表4 成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座主要单倍型

    Tab 4 The main haplotypes of five Y-specific STR loci in Han population in Chengdu Haplotype No.
, 百拇医药
    (单倍型编号)

    DYS19

    DYS389

    DYS390

    DYS391

    DYS393

    1

    14

    12

    24

    10

    12

    2
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    14

    13

    24

    10

    12

    3

    15

    12

    23

    10

    12

    4

    15

    12
, 百拇医药
    23

    10

    13

    5

    15

    12

    23

    11

    13

    6

    15

    12

    24

    10
, 百拇医药
    12

    7

    15

    13

    23

    10

    12

    8

    15

    13

    23

    10

    15

    9
, 百拇医药
    15

    14

    23

    10

    13

    10

    16

    12

    24

    10

    12

    11

    16

    12
, 百拇医药
    25

    10

    12

    图4 中国成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座单倍型频率

    Fig 4 The haplotype frequency of the five Y-specific STR loci in Chinese Han population in Chengdu

    3 讨论

    众所周知Y染色体具有父系遗传特征,Y染色体多态性对重构父系进化史有重要意义。然而,人类群体遗传研究过去很少采用Y染色体遗传标记。原因在于Y染色体非重组区仅发现为数很少的两态性限制性片段长度多态性,即一个基因座上有或无该限制酶切片段。这类遗传标记需用多种限制酶与探针组合才能构成有比较价值的单倍型,很难在大规模群体分析中应用。Y染色体特异STR的发现改变了人们认为Y染色体缺乏多态性的观念,为研究人类近期进化事件提供了新的可能性,正在产生关于史前人类定居与迁移的新假设[1]。Underhill等[14]指出,Y染色体变异归因于相对较小的有效群体,Y染色体特异的多态性研究开始了标识人类地理分布的新纪元。本研究揭示我国汉族人群在DYS19、DYS389、DYS390、DYS391和DYS393等5个Y染色体特异STR基因座均具有遗传多态性,获得了成都汉族群体5个Y染色体特异STR基因座的等位基因频率。应用这些多态性Y染色体特异STR构成单倍型对中国更多群体进行研究,将增加人们对Y染色体进化规律的认识和了解。
, 百拇医药
    我们的研究结果显示,人类Y染色体特异短串联重复序列具有复杂的结构。5个基因座均含有两种以上不同核心重复单位,提示存在复杂串联重复结构是人类Y染色体特异STR基因座的普遍规律。两种以上不同核心重复单位的存在为Y染色体特异STR的突变率解释提供了结构基础。已观察到一些Y染色体特异STR具有较高的突变率[2,8,9],给追溯过去发生的男性迁移,重构父系进化史带来了正反两方面效应。较高的突变率意味着起源不同群体间等位基因数量的趋同和收敛效应,提示Y染色体特异STR不适合用于追溯年代久远的进化事件。另一方面,较高的突变率意味着起源相同的群体在近期进化过程中可产生大量不同的Y染色体特异STR单倍型,为群体遗传亲缘关系分析提供了高效遗传标记。

    群体遗传亲缘关系需要对更大的样本和更多群体进行分析,多个实验室之间数据的可比性就变得极为重要。然而,Y染色体特异STR结构的复杂性常导致等位基因命名混乱。尽管1996年在柏林召开了第一届Y染色体STR分型协调会议[9],随着对Y染色体特异STR结构认识的深入了解,现在发现旧命名法并不完全符合国际法医血液遗传学会DNA委员会提出的命名原则。因此,Knijff和Roewer等已提出了新的命名建议(个人通讯)。为了保持实验室之间数据的可比性,我们在研究中采用了他们的新命名法。新旧命名法相比,主要不同在于DYS398旧称DYS389Ⅰ和DYS389Ⅱ,新命名法称DYS389(C+D)和DYS389(A+B+C+D)。本文中所称DYS389系指DYS398(C+D),等位基因DYS389*12等于旧命名法DYS389Ⅰ*9,余此类推。本研究与大多数国外学者的命名体系相
, 百拇医药
    同[2,3,5,8,9],为研究我国人群Y染色体特异STR的群体遗传提供了具有可比性的资料。

    应当指出,Y染色体特异STR与常染色体STR数据类型不同。Y染色体特异STR不与X染色体重组,不论Y染色体特异STR基因座之间的物理距离多大,它们的等位基因都以单倍型遗传。本研究中,成都汉族群体样本中5个Y染色体特异STR基因座分别存在6、4、5、4、4个等位基因,理论上存在1920种单倍型;实际在82名个体中,观察到58种单倍型,其中11种单倍型至少为两名以上个体分享。频率最高的单倍型并非由5个Y染色体特异STR基因座具有最高频率的基因构成,单倍型并非随机分布,具有一定群体特异性。提示对群体遗传亲缘关系分析,Y染色体特异STR单倍型比等位基因频率更具有重要价值。

    志谢 研究用部分设备由德国洪堡基金会赠送

    该课题为国家自然科学基金重大项目(39993420)资助,美国纽约中华医学基金(96-636)项目,四川省科技攻关项目(97012152301)资助
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    *为通信联系人

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    (收稿:1998-12-23 修回:1999-01-22), http://www.100md.com(侯一平* 吴谨 李英碧 张霁 张思仲 褚嘉佑 M.Prinz)