脂肪组织源性肿瘤中p53基因的异常
作者：王娅兰* 丘钜世 熊敏
单位：510089广州，中山医科大学病理教研室：*现在400016 重庆医科大学病理教研室
关键词：
中华医学遗传学杂志990625 抑癌基因p53功能丧失或抑制与上皮源性恶性肿瘤的关系，国内外学者研究较多，但对其在软组织恶性肿瘤中，特别是脂肪组织恶性肿瘤中的异常则研究较少，脂肪组织恶性肿瘤中是否存在p53基因的突变，目前文献报道也不一致。我样拟从蛋白水平到基因水平观察脂肪组织源性肿瘤中p53的异常，探讨其与脂肪组织源性肿瘤之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 组织标本72例，分别选自中山医科大学病理教研室及中山医科大学附属肿瘤医院病理科。其中正常脂肪组织10例，脂肪瘤样增生10例，脂肪瘤10例，脂肪肉瘤42例(包括分化良好型12例，粘液样型13例，圆形细胞型5例，多形性12例)。组织均用10%甲醛液固定，石蜡包埋，P53(DO-7)单抗及LSAB试剂盒购自DAKO公司，p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物由中山医科大学病理教研室王连唐老师惠赠。各外显子引物序列见表1。
, http://www.100md.com
表1 p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物序列
外显子
引物寡核昔酸序列
产物片段大小(bp)
6
a
5’-GATTGCTCTTAGGTCTGGCC-3’
136
Z
5’-GCAAACCAGACCTCAGGCGG-3’
7
, 百拇医药 a
5’-TTGTCTCCTAGGTTGGCTCT-3’
130
Z
5’-GCTCCTGACCTGGAGTCTTC-3’
8
a
5’-TCCTGAGTAGTGGTAATCTA-3’
157
Z
5’-GCTTGCTTACCTCGCTTAGT-3’
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色 采用LSAB法对P53蛋白进行染色，具体步骤按说明书，每次染色以已知阳性组织切片为阳性对照，以正常血清代替Ⅰ抗为阴性对照。免疫组化结果判断标准参照Shimizu等标准稍作修定[1]。
1.2.2 石蜡组织DNA提取及聚合酶链反应(PCR) 主要步骤：石蜡切片脱蜡，蛋白酶K消化，水浴煮沸取上清液作PCR模板。PCR循环参数：p53基因第6、7、8外显子复性温度分别为56℃，54℃，51℃，其余条件为：预变性97℃7分钟，变性95℃1分钟，复性1分钟，72℃延伸1分钟，5个循环后，变性时间调为50秒，再作25个循环，最后延伸72℃10分钟。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测PCR扩增产物特异物。
1.2.3 非同位素标记单链构象多态性(SSCP)分析 SSCP：将PCR扩增产物5μl加入1×上样缓冲液(98%去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，pH8.0,0.025%二甲苯菁FF，0.025%溴酚蓝)。97℃变性10分钟，迅速置于冰浴中10分钟，在非变性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺：N，N’-亚甲基双丙烯酰胺=49∶1，甘油5%)凝胶中电泳。各外显子电泳条件见表2。
, 百拇医药
表2 p53基因第6～8外显子电泳条件 外显子
凝胶浓度(%)
电压(V)
时间(h)
6
12
200
5～6
7
12
190
6～7
8
, http://www.100md.com
12
150
9
银染主要步骤：依次用10%乙醇、1%硝酸、0.2%硝酸银(避光)、0.28mmol/L无水碳酸钠、0.05%甲醛液浸泡，条带清楚时终止，10%冰乙酸固定。同一外显子扩增产物在不同电泳条件下，其DNA单链构象有所不同，故结果的判定应在同一电泳条件才能确定，在试验中，均以正常脂肪组织(来自非肿瘤性、非遗传性疾病患者)及肿瘤患者的正常组织作对照，观察DNA单链泳动位置。
1.2.4 DNA序列分析 采用荧光标记双脱氧ddNTP法在ABIPRISOMTM，310基因分析仪上分析。
2 结果
2.1 免疫组化检测P53蛋白表达
, http://www.100md.com
2.1.1 P53蛋白表达于胞核。正常脂肪组织及脂肪组织瘤样增生、脂肪瘤P53无表达。而脂肪肉瘤P53表达明显增高，阳性率为47.62%(24/42)。与正常脂肪组织、脂肪组织瘤样增生、脂肪瘤比较，有显著差异(确切概率计算P<0.001)。
2.1.2 分化良好型和粘液样型P53蛋白表达弱，阳性率为32.00%(8/25)，圆形细胞型和多形性P53蛋白表达强，阳性率为70.59%(12/17)，有显著差异。χ2检验：χ2P53=7.2770,P<0.01)。
2.2 PCR-SSCP分析 P53第6、7、8外显PCR扩增后，均有特异性扩增产物，经SSCP分析，正常脂肪组织、脂肪组织瘤样增生及脂肪瘤p53基因第6、7、8外显子均未出现异常泳动带。42例脂肪肉瘤中，2例出现异常泳动带，分别位于第6、8外显子，此2例均为多形性脂肪肉瘤。
, 百拇医药
2.3 DNA序列分析 将p53基因第6、8外显子有异常泳动带的2例多形性脂肪肉瘤作DNA序列分析，第8外显子第268编码区出现错义突变(AAC→ATC)，第6外显子第221编码区出现可疑杂合性同义突变(GAG→GAA)。
3 讨论
突变型P53蛋白的表达见于多种恶性肿瘤。Taubert等[2]对65例MFH和脂肪肉瘤进行研究，P53异常表达见于43%脂肪肉瘤，而Kawai等[3]则报道脂肪肉瘤阳性率为13.6%，而恶性神经鞘膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤分别为100%、71.4%、50%，认为P53异常表达对恶神鞘、横纹肌及滑膜肉瘤具有判断预后的价值。我们观察到，脂肪组织源性肿瘤中，P53异常表达仅见于脂肪肉瘤，阳性率为47.62%，与Taubert结果相近，而正常脂肪组织及良性病变中均无P53蛋白表达，且分化差的类型即圆形细胞型和多形性脂肪肉瘤P53蛋白表达较强，阳性率明显高于分化较好的分化良好型和粘液样型脂肪肉瘤，差别均具统计学意义，揭示P53蛋白与脂肪肉瘤的形成有关，并与分化程度亦有关，随着分化程度降低，P53蛋白表达增强。我们认为，P53蛋白表达可作为判断脂肪肉瘤分化程度及恶性程度的参考指标之一。
, http://www.100md.com
p53基因突变是引起其蛋白异常表达的常见原因。不同类型的软组织肿瘤如平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶纤组、滑膜肉瘤均有p53基因突变[2，4-6]。Taubert等[2]对32例脂肪肉瘤检测中观察到其中5例有p53基因突变，但有研究检测19例脂肪肉瘤中却未见p53基因突变[7]。我们应用非同位素标记PCR-SSCP法，筛选出2例多形性脂肪肉瘤，分别在第6、8外显子出现异常泳动率单链DNA电泳带，DNA序列分析，证实在第8外显子268号编码区存在错义突变(AAC→ATC)，第6外显子存在一可疑的杂合性同义突变(GAG→GAA)。
从我们的结果中还可看到，多数P53蛋白表达阳性的脂肪肉瘤，第6、7、8外显子突变检测为阴性。推测其原因，可能在第6、7、8外显子以外的基因结构中尚存在着突变。此外，其它蛋白(如mdm-2基因产物、热休克蛋白、DNA肿瘤病毒蛋白等)与P53蛋白结合，亦可增加P53蛋白稳定性，使半衰期延长，从而使免疫组化出现阳性结果。因此，脂肪肉瘤中其它因素对P53蛋白异常表达的影响尚不能除外，有待进一步研究。
, http://www.100md.com
本课题受CMB(93-594)资助
参考文献
1 Shimizu M,Saiton Y,Itoh H.Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues.Hum Pathol,1990,21(6)∶607-612.
2 Taubert H,Wurl P,Meye A,et al.Molecular and immunohistochemical P53 status in liposarcoma and malignant fibrous histiocytoma.Cancer,1995,76(7)∶1187-1196.
3 Kawai A,Noguchi M,Beppu Y,et al.Nuclear immunoreaction of P53 protein in soft tissue sarcomas. A possible prognostic factor.Cancer,1994,73∶2499-2505.
, 百拇医药
4 Dc Vos S,Wilczynski SP,Flcischhacker M,et al.P53 alterations in uterine leiomyosarcomas versus leromyomas.Gynecol Oncol,1994,54(2)∶205-208.
5 Diller L,Sexsmith L,Gottliebt A,et al.Gormline P53 mutations are frequently detected in young children with rhabdomyosarcoma.J Clin Invest,1995,95(4)∶1606-1611.
6 Pollock RE,Lang A,Luo J,et al.Soft tissues sarwcoma metastasis from clonal expanoion of P53 mutated tumor cells.Oncogene,1996,12(9)∶2035-2039.
7 Florenes VA,Maelandsmo GM,Forus A,et al.MDM2 gene amplification and transcirpt levels in human sarcomas relationship to TP53 gene status.J Natl Cancer Inst,1994,86(17)∶1297-1320.
(收稿：1999-01-06 修回：1999-05-03), 百拇医药(王娅兰* 丘钜世 熊敏)
单位：510089广州，中山医科大学病理教研室：*现在400016 重庆医科大学病理教研室
关键词：
中华医学遗传学杂志990625 抑癌基因p53功能丧失或抑制与上皮源性恶性肿瘤的关系，国内外学者研究较多，但对其在软组织恶性肿瘤中，特别是脂肪组织恶性肿瘤中的异常则研究较少，脂肪组织恶性肿瘤中是否存在p53基因的突变，目前文献报道也不一致。我样拟从蛋白水平到基因水平观察脂肪组织源性肿瘤中p53的异常，探讨其与脂肪组织源性肿瘤之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 组织标本72例，分别选自中山医科大学病理教研室及中山医科大学附属肿瘤医院病理科。其中正常脂肪组织10例，脂肪瘤样增生10例，脂肪瘤10例，脂肪肉瘤42例(包括分化良好型12例，粘液样型13例，圆形细胞型5例，多形性12例)。组织均用10%甲醛液固定，石蜡包埋，P53(DO-7)单抗及LSAB试剂盒购自DAKO公司，p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物由中山医科大学病理教研室王连唐老师惠赠。各外显子引物序列见表1。
, http://www.100md.com
表1 p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物序列
外显子
引物寡核昔酸序列
产物片段大小(bp)
6
a
5’-GATTGCTCTTAGGTCTGGCC-3’
136
Z
5’-GCAAACCAGACCTCAGGCGG-3’
7
, 百拇医药 a
5’-TTGTCTCCTAGGTTGGCTCT-3’
130
Z
5’-GCTCCTGACCTGGAGTCTTC-3’
8
a
5’-TCCTGAGTAGTGGTAATCTA-3’
157
Z
5’-GCTTGCTTACCTCGCTTAGT-3’
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色 采用LSAB法对P53蛋白进行染色，具体步骤按说明书，每次染色以已知阳性组织切片为阳性对照，以正常血清代替Ⅰ抗为阴性对照。免疫组化结果判断标准参照Shimizu等标准稍作修定[1]。
1.2.2 石蜡组织DNA提取及聚合酶链反应(PCR) 主要步骤：石蜡切片脱蜡，蛋白酶K消化，水浴煮沸取上清液作PCR模板。PCR循环参数：p53基因第6、7、8外显子复性温度分别为56℃，54℃，51℃，其余条件为：预变性97℃7分钟，变性95℃1分钟，复性1分钟，72℃延伸1分钟，5个循环后，变性时间调为50秒，再作25个循环，最后延伸72℃10分钟。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测PCR扩增产物特异物。
1.2.3 非同位素标记单链构象多态性(SSCP)分析 SSCP：将PCR扩增产物5μl加入1×上样缓冲液(98%去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，pH8.0,0.025%二甲苯菁FF，0.025%溴酚蓝)。97℃变性10分钟，迅速置于冰浴中10分钟，在非变性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺：N，N’-亚甲基双丙烯酰胺=49∶1，甘油5%)凝胶中电泳。各外显子电泳条件见表2。
, 百拇医药
表2 p53基因第6～8外显子电泳条件 外显子
凝胶浓度(%)
电压(V)
时间(h)
6
12
200
5～6
7
12
190
6～7
8
, http://www.100md.com
12
150
9
银染主要步骤：依次用10%乙醇、1%硝酸、0.2%硝酸银(避光)、0.28mmol/L无水碳酸钠、0.05%甲醛液浸泡，条带清楚时终止，10%冰乙酸固定。同一外显子扩增产物在不同电泳条件下，其DNA单链构象有所不同，故结果的判定应在同一电泳条件才能确定，在试验中，均以正常脂肪组织(来自非肿瘤性、非遗传性疾病患者)及肿瘤患者的正常组织作对照，观察DNA单链泳动位置。
1.2.4 DNA序列分析 采用荧光标记双脱氧ddNTP法在ABIPRISOMTM，310基因分析仪上分析。
2 结果
2.1 免疫组化检测P53蛋白表达
, http://www.100md.com
2.1.1 P53蛋白表达于胞核。正常脂肪组织及脂肪组织瘤样增生、脂肪瘤P53无表达。而脂肪肉瘤P53表达明显增高，阳性率为47.62%(24/42)。与正常脂肪组织、脂肪组织瘤样增生、脂肪瘤比较，有显著差异(确切概率计算P<0.001)。
2.1.2 分化良好型和粘液样型P53蛋白表达弱，阳性率为32.00%(8/25)，圆形细胞型和多形性P53蛋白表达强，阳性率为70.59%(12/17)，有显著差异。χ2检验：χ2P53=7.2770,P<0.01)。
2.2 PCR-SSCP分析 P53第6、7、8外显PCR扩增后，均有特异性扩增产物，经SSCP分析，正常脂肪组织、脂肪组织瘤样增生及脂肪瘤p53基因第6、7、8外显子均未出现异常泳动带。42例脂肪肉瘤中，2例出现异常泳动带，分别位于第6、8外显子，此2例均为多形性脂肪肉瘤。
, 百拇医药
2.3 DNA序列分析 将p53基因第6、8外显子有异常泳动带的2例多形性脂肪肉瘤作DNA序列分析，第8外显子第268编码区出现错义突变(AAC→ATC)，第6外显子第221编码区出现可疑杂合性同义突变(GAG→GAA)。
3 讨论
突变型P53蛋白的表达见于多种恶性肿瘤。Taubert等[2]对65例MFH和脂肪肉瘤进行研究，P53异常表达见于43%脂肪肉瘤，而Kawai等[3]则报道脂肪肉瘤阳性率为13.6%，而恶性神经鞘膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤分别为100%、71.4%、50%，认为P53异常表达对恶神鞘、横纹肌及滑膜肉瘤具有判断预后的价值。我们观察到，脂肪组织源性肿瘤中，P53异常表达仅见于脂肪肉瘤，阳性率为47.62%，与Taubert结果相近，而正常脂肪组织及良性病变中均无P53蛋白表达，且分化差的类型即圆形细胞型和多形性脂肪肉瘤P53蛋白表达较强，阳性率明显高于分化较好的分化良好型和粘液样型脂肪肉瘤，差别均具统计学意义，揭示P53蛋白与脂肪肉瘤的形成有关，并与分化程度亦有关，随着分化程度降低，P53蛋白表达增强。我们认为，P53蛋白表达可作为判断脂肪肉瘤分化程度及恶性程度的参考指标之一。
, http://www.100md.com
p53基因突变是引起其蛋白异常表达的常见原因。不同类型的软组织肿瘤如平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶纤组、滑膜肉瘤均有p53基因突变[2，4-6]。Taubert等[2]对32例脂肪肉瘤检测中观察到其中5例有p53基因突变，但有研究检测19例脂肪肉瘤中却未见p53基因突变[7]。我们应用非同位素标记PCR-SSCP法，筛选出2例多形性脂肪肉瘤，分别在第6、8外显子出现异常泳动率单链DNA电泳带，DNA序列分析，证实在第8外显子268号编码区存在错义突变(AAC→ATC)，第6外显子存在一可疑的杂合性同义突变(GAG→GAA)。
从我们的结果中还可看到，多数P53蛋白表达阳性的脂肪肉瘤，第6、7、8外显子突变检测为阴性。推测其原因，可能在第6、7、8外显子以外的基因结构中尚存在着突变。此外，其它蛋白(如mdm-2基因产物、热休克蛋白、DNA肿瘤病毒蛋白等)与P53蛋白结合，亦可增加P53蛋白稳定性，使半衰期延长，从而使免疫组化出现阳性结果。因此，脂肪肉瘤中其它因素对P53蛋白异常表达的影响尚不能除外，有待进一步研究。
, http://www.100md.com
本课题受CMB(93-594)资助
参考文献
1 Shimizu M,Saiton Y,Itoh H.Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues.Hum Pathol,1990,21(6)∶607-612.
2 Taubert H,Wurl P,Meye A,et al.Molecular and immunohistochemical P53 status in liposarcoma and malignant fibrous histiocytoma.Cancer,1995,76(7)∶1187-1196.
3 Kawai A,Noguchi M,Beppu Y,et al.Nuclear immunoreaction of P53 protein in soft tissue sarcomas. A possible prognostic factor.Cancer,1994,73∶2499-2505.
, 百拇医药
4 Dc Vos S,Wilczynski SP,Flcischhacker M,et al.P53 alterations in uterine leiomyosarcomas versus leromyomas.Gynecol Oncol,1994,54(2)∶205-208.
5 Diller L,Sexsmith L,Gottliebt A,et al.Gormline P53 mutations are frequently detected in young children with rhabdomyosarcoma.J Clin Invest,1995,95(4)∶1606-1611.
6 Pollock RE,Lang A,Luo J,et al.Soft tissues sarwcoma metastasis from clonal expanoion of P53 mutated tumor cells.Oncogene,1996,12(9)∶2035-2039.
7 Florenes VA,Maelandsmo GM,Forus A,et al.MDM2 gene amplification and transcirpt levels in human sarcomas relationship to TP53 gene status.J Natl Cancer Inst,1994,86(17)∶1297-1320.
(收稿：1999-01-06 修回：1999-05-03), 百拇医药(王娅兰* 丘钜世 熊敏)