p16基因在肺癌中表达的研究
作者：王柏秋 高慧 傅松滨 李钰 薛雅丽 刘岸 史忠诚 张贵寅 李璞
单位：150086哈尔滨，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室
关键词：
中华医学遗传学杂志990624 癌症是一种危害人类健康的恶性疾病，目前研究表明，许多细胞周期调节因子与癌症的发生和发展有着密切的关系。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16，其编码基因为MTS1/p16CDK4I，简称p16基因，为该研究领域较引人注目的研究热点。自1994年美国的Kamb[1]和Carson首次发表了有关p16基因的研究工作以来，人们对其进行了大量的研究。p16基因编码一个相对分子质量为16×103的蛋白质，此蛋白质是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子(CDK4I)。我们应用免疫组化S-P方法测定肺鳞癌、肺腺癌和小细胞肺癌和一对具不同转移能力肺癌细胞系中的p16基因表达情况，以便了解p16基因表达程度与3种不同类型的肺癌及与转移的关系，为临床病理诊断和预后的判断提供重要的参考指标。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本采集与切片制备 我们收集了哈尔滨医科大学第一临床医学院1996～1998年肺癌切除标本31例，其中非小细胞肺癌(NSCLC)25例(腺癌11例、鳞癌14例)，小细胞肺癌(SCLC)6例；其中伴淋巴转移22例。常规制备肿瘤及正常组织的石蜡切片。低转移性肺腺癌细胞系AGZY83a及由AGZY83a母系中筛出的高转移亚系Anip973均由哈尔滨医科大学病理教研室王吾茹惠赠。
1.2 抗体、滴度及染色方法 P16蛋白多克隆抗体购自Santa Cruz公司，滴度为1∶100；S-P免疫组化染色试剂盒来自福州迈新公司。31例肺癌标本均常规甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片。切片经系列脱蜡、水化后备用。两个肺腺癌细胞系，分别接种于含载玻片的平皿中，以含15%小牛血清，1%双抗和1.2%谷氨酰胺的1640培养基于37℃，5%CO2条件下开放培养至载玻片上细胞融合率达50%～60%。取出玻片，PBS冲洗，无水乙醇固定过夜备用。
, 百拇医药
免疫组化方法过程如下：滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗后，然后依次滴加羊血清、一抗、桥抗、SP，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水、透明后封片，显微镜下观察。阳性对照选用已知的阳性片，空白对照用PBS代替一抗。
1.3 结果观察及评定 以细胞核或(和)细胞浆出现棕黄色着色为阳性。每片观察5个高倍视野(10×40)，对视野中的癌细胞进行绝对计数，并由此算出阳性表达率。癌变组及对照组观察结果采用秩和检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 P16蛋白与肺癌的发生相关 P16蛋白在对照组7例正常肺组织中都呈阳性表达，而在肺癌中的表达率较低。14例肺鳞癌中，P16蛋白平均阳性表达率为3.6%，二者有显著差异(P<0.005)。11例肺腺癌中，平均阳性表达率为0.9%，与对照组相比有显著差异(P<0.005)。6例小细胞肺癌中，P16蛋白平均阳性表达率为16.7%，与对照组相比有显著性差异(P<0.005)(表1)。P16蛋白在25例非小细胞肺癌(NSCLC)表达率为2.4%，而在6例小细胞肺癌(SCLC)中表达率为16.7%，二者有显著性差异(P<0.005)。这说明P16蛋白在这两类肺癌的发生中起着不同的作用。
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表1 p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物序列 类别
例数
完全无P16表达
最高阳性表达率(%)
平均阳性表达率(%)
正常肺
7
0
80
54.3
肺鳞癌
14
, 百拇医药
5
10
3.6
肺腺癌
11
6
4
0.9
小细胞肺癌
6
3
60
16.7
2.2 P16蛋白与肺癌的转移密切相关 我们研究的31例肺癌标本中，共有14例完全无P16蛋白表达，其中有10例发生淋巴结转移(10/14)。对两个细胞系的研究结果显示，P16蛋白在低转移细胞系AGZY83a中平均表达率为87.4%，而在高转移细胞系Anip973中平均表达率为5.2%，二者有显著性差异(P<0.005)。因此我们推测p16基因及其产物的表达参与肺癌转移，二者关系密切。
, 百拇医药
3 讨论
p16基因是一种多重肿瘤抑制基因，在许多肿瘤中其结构功能都有改变，参与肿瘤的进展和转移。p16基因在肺癌中的异常发生率是很高的。Hayashi等[2]在64例NSCLC中检出5例p16基因纯合缺失，缺失率为7.8%，且有16例存在p16基因突变，突变率为29.6%。但单从核酸水平上探讨p16基因与癌症的相关性是不充分的。郑杰等[3]对21例原发性食道癌的p16基因进行分析，6例纯合缺失，这6例中5例伴淋巴结转移，8例免疫组化染色呈P16蛋白缺失。4个食道癌细胞系的Northern和免疫组化分析表明p16基因mRNA未转录，P16蛋白不表达者为50%(2/4)，p16基因纯合缺失者为25%(1/4)。这些结果证实了p16基因缺失参与食道癌发展过程，且是晚发事件。Hirabayashi等[4]对36例胸腺癌患者用免疫组化方法进行p16基因、Rb基因表达的分析，异常表达率分别为50%(18/36)和45%(8/36)，且一部分浸润性胸腺癌表现与p16基因、Rb基因表达缺失相关，推论p16基因，Rb基因的失活在胸腺癌的进展中起一定的作用。我们对31例肺癌和7例正常肺组织进行了P16蛋白表达的免疫组化检测，结果表明：P16蛋白在正常肺组织、肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌中的表达率有显著差异。提示P16蛋白与肺癌的发生密切相关。P16蛋白在非小细胞肺癌中的表达率与小细胞肺癌中的表达率有显著性差异。这说明P16蛋白在这两类肺癌的发生中起着不同的作用。目前研究提示[5]，p16基因的表达与否同患者预后有很大关系。无P16蛋白表达的患者术后生存率明显低于有P16蛋白表达的患者。我们在对这31例肺癌中的P16蛋白进行免疫组化检测时发现的14例完全无P16蛋白表达的标本中，有10例存在淋巴结转移。同时发现高转移性肺腺癌细胞系Anip973中P16蛋白表达缺失，而低转移性细胞系AGZY83a中P16蛋白正常表达。由此可见，P16蛋白缺失可能参与肺癌转移发生过程。
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总之，我们的结果提示P16蛋白表达降低与肺鳞癌、肺腺癌和小细胞肺癌的发生有关，且NSCLC与SCLC中P16蛋白发挥着不同的作用。P16蛋白的表达与肺癌的转移过程密切相关。对肺癌患者P16蛋白表达的状态的正确评估将有助于癌症患者的治疗。
本课题受黑龙江省自然科学基金(Q98-9)资助
参考文献
1 Kamb A, Gruis N, Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157)∶436-440.
2 Hayashi N, Sugimoto Y, Tsuchiya E, et al.Somatic mutations of the MTS(multiple tumor suppressor)1/CDK4I(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small cell lung carcinomas.Biochem Biophys Res Commun,1994,202(3)∶1426-1430.
, 百拇医药
3 郑杰，侯萍，周传农，等.CDKN2(p16INK4/MTS1)基因丢失和cyclin D扩增在食管癌发生中的意义.中华肿瘤杂志，1996，18(6)∶408-411.
4 Hirabayashi H, Fuji Y, Sakaguchi M, et al.p16 INK4,pRB, p53 and cyclin D1 expression and hypermethylation of CDKN2 gene in thymoma and thymic carcinoma. Int J Cancer, 1997,73(5)∶639-644.
5 Straume O, Akslen LA. Alterations and prognostic significance of p16 and p53 protein expression in subgroups of cutaneous melanoma. Int J Cancer, 1997,74(5)∶535-539.
(收稿：1998-12-03 修回：1999-03-24), 百拇医药
单位：150086哈尔滨，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室
关键词：
中华医学遗传学杂志990624 癌症是一种危害人类健康的恶性疾病，目前研究表明，许多细胞周期调节因子与癌症的发生和发展有着密切的关系。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16，其编码基因为MTS1/p16CDK4I，简称p16基因，为该研究领域较引人注目的研究热点。自1994年美国的Kamb[1]和Carson首次发表了有关p16基因的研究工作以来，人们对其进行了大量的研究。p16基因编码一个相对分子质量为16×103的蛋白质，此蛋白质是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子(CDK4I)。我们应用免疫组化S-P方法测定肺鳞癌、肺腺癌和小细胞肺癌和一对具不同转移能力肺癌细胞系中的p16基因表达情况，以便了解p16基因表达程度与3种不同类型的肺癌及与转移的关系，为临床病理诊断和预后的判断提供重要的参考指标。
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1 材料与方法
1.1 标本采集与切片制备 我们收集了哈尔滨医科大学第一临床医学院1996～1998年肺癌切除标本31例，其中非小细胞肺癌(NSCLC)25例(腺癌11例、鳞癌14例)，小细胞肺癌(SCLC)6例；其中伴淋巴转移22例。常规制备肿瘤及正常组织的石蜡切片。低转移性肺腺癌细胞系AGZY83a及由AGZY83a母系中筛出的高转移亚系Anip973均由哈尔滨医科大学病理教研室王吾茹惠赠。
1.2 抗体、滴度及染色方法 P16蛋白多克隆抗体购自Santa Cruz公司，滴度为1∶100；S-P免疫组化染色试剂盒来自福州迈新公司。31例肺癌标本均常规甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片。切片经系列脱蜡、水化后备用。两个肺腺癌细胞系，分别接种于含载玻片的平皿中，以含15%小牛血清，1%双抗和1.2%谷氨酰胺的1640培养基于37℃，5%CO2条件下开放培养至载玻片上细胞融合率达50%～60%。取出玻片，PBS冲洗，无水乙醇固定过夜备用。
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免疫组化方法过程如下：滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗后，然后依次滴加羊血清、一抗、桥抗、SP，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水、透明后封片，显微镜下观察。阳性对照选用已知的阳性片，空白对照用PBS代替一抗。
1.3 结果观察及评定 以细胞核或(和)细胞浆出现棕黄色着色为阳性。每片观察5个高倍视野(10×40)，对视野中的癌细胞进行绝对计数，并由此算出阳性表达率。癌变组及对照组观察结果采用秩和检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 P16蛋白与肺癌的发生相关 P16蛋白在对照组7例正常肺组织中都呈阳性表达，而在肺癌中的表达率较低。14例肺鳞癌中，P16蛋白平均阳性表达率为3.6%，二者有显著差异(P<0.005)。11例肺腺癌中，平均阳性表达率为0.9%，与对照组相比有显著差异(P<0.005)。6例小细胞肺癌中，P16蛋白平均阳性表达率为16.7%，与对照组相比有显著性差异(P<0.005)(表1)。P16蛋白在25例非小细胞肺癌(NSCLC)表达率为2.4%，而在6例小细胞肺癌(SCLC)中表达率为16.7%，二者有显著性差异(P<0.005)。这说明P16蛋白在这两类肺癌的发生中起着不同的作用。
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表1 p53基因第6、7、8外显子PCR扩增引物序列 类别
例数
完全无P16表达
最高阳性表达率(%)
平均阳性表达率(%)
正常肺
7
0
80
54.3
肺鳞癌
14
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5
10
3.6
肺腺癌
11
6
4
0.9
小细胞肺癌
6
3
60
16.7
2.2 P16蛋白与肺癌的转移密切相关 我们研究的31例肺癌标本中，共有14例完全无P16蛋白表达，其中有10例发生淋巴结转移(10/14)。对两个细胞系的研究结果显示，P16蛋白在低转移细胞系AGZY83a中平均表达率为87.4%，而在高转移细胞系Anip973中平均表达率为5.2%，二者有显著性差异(P<0.005)。因此我们推测p16基因及其产物的表达参与肺癌转移，二者关系密切。
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3 讨论
p16基因是一种多重肿瘤抑制基因，在许多肿瘤中其结构功能都有改变，参与肿瘤的进展和转移。p16基因在肺癌中的异常发生率是很高的。Hayashi等[2]在64例NSCLC中检出5例p16基因纯合缺失，缺失率为7.8%，且有16例存在p16基因突变，突变率为29.6%。但单从核酸水平上探讨p16基因与癌症的相关性是不充分的。郑杰等[3]对21例原发性食道癌的p16基因进行分析，6例纯合缺失，这6例中5例伴淋巴结转移，8例免疫组化染色呈P16蛋白缺失。4个食道癌细胞系的Northern和免疫组化分析表明p16基因mRNA未转录，P16蛋白不表达者为50%(2/4)，p16基因纯合缺失者为25%(1/4)。这些结果证实了p16基因缺失参与食道癌发展过程，且是晚发事件。Hirabayashi等[4]对36例胸腺癌患者用免疫组化方法进行p16基因、Rb基因表达的分析，异常表达率分别为50%(18/36)和45%(8/36)，且一部分浸润性胸腺癌表现与p16基因、Rb基因表达缺失相关，推论p16基因，Rb基因的失活在胸腺癌的进展中起一定的作用。我们对31例肺癌和7例正常肺组织进行了P16蛋白表达的免疫组化检测，结果表明：P16蛋白在正常肺组织、肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌中的表达率有显著差异。提示P16蛋白与肺癌的发生密切相关。P16蛋白在非小细胞肺癌中的表达率与小细胞肺癌中的表达率有显著性差异。这说明P16蛋白在这两类肺癌的发生中起着不同的作用。目前研究提示[5]，p16基因的表达与否同患者预后有很大关系。无P16蛋白表达的患者术后生存率明显低于有P16蛋白表达的患者。我们在对这31例肺癌中的P16蛋白进行免疫组化检测时发现的14例完全无P16蛋白表达的标本中，有10例存在淋巴结转移。同时发现高转移性肺腺癌细胞系Anip973中P16蛋白表达缺失，而低转移性细胞系AGZY83a中P16蛋白正常表达。由此可见，P16蛋白缺失可能参与肺癌转移发生过程。
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总之，我们的结果提示P16蛋白表达降低与肺鳞癌、肺腺癌和小细胞肺癌的发生有关，且NSCLC与SCLC中P16蛋白发挥着不同的作用。P16蛋白的表达与肺癌的转移过程密切相关。对肺癌患者P16蛋白表达的状态的正确评估将有助于癌症患者的治疗。
本课题受黑龙江省自然科学基金(Q98-9)资助
参考文献
1 Kamb A, Gruis N, Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157)∶436-440.
2 Hayashi N, Sugimoto Y, Tsuchiya E, et al.Somatic mutations of the MTS(multiple tumor suppressor)1/CDK4I(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small cell lung carcinomas.Biochem Biophys Res Commun,1994,202(3)∶1426-1430.
, 百拇医药
3 郑杰，侯萍，周传农，等.CDKN2(p16INK4/MTS1)基因丢失和cyclin D扩增在食管癌发生中的意义.中华肿瘤杂志，1996，18(6)∶408-411.
4 Hirabayashi H, Fuji Y, Sakaguchi M, et al.p16 INK4,pRB, p53 and cyclin D1 expression and hypermethylation of CDKN2 gene in thymoma and thymic carcinoma. Int J Cancer, 1997,73(5)∶639-644.
5 Straume O, Akslen LA. Alterations and prognostic significance of p16 and p53 protein expression in subgroups of cutaneous melanoma. Int J Cancer, 1997,74(5)∶535-539.
(收稿：1998-12-03 修回：1999-03-24), 百拇医药