一种普遍提高微量DNA拷贝数的方法
作者：赵庆国 张郁 李丽君 焦保权 吕萍
单位：050082石家庄，北京军区白求恩国际和平医院优生优育中心
关键词：
一种普遍提高微量DNA拷贝数的方法 聚合酶链反应(polymorphism chain reaction,PCR)工作中常受标本量的制约。如胚胎移植前基因诊断的单细胞、古标本、血斑、精斑等，标本来源有限，量又少，甚至单个模板DNA分子，最多能满足1次PCR扩增模板量的需求。类似标本的DNA分析中，能够扩增多个靶序列片段进行DNA多位点遗传分析，或同一靶序列重复扩增确保结果准确性，是科研和实践中很有价值的课题。针对微量模板DNA靶片段量少，扩增产量低的缺陷，采用套式PCR技术，可较大地提高扩增效率。但此技术过于敏感，假阳性率高，尤其仅只限于单一位点分析。因而对微量DNA，特别是单体细胞、配子体等的基因定型、多位点遗传分析用处不大。我们介绍一种广泛提高序列拷贝数，使微量DNA可用于多位点扩增的方法——引物延伸预扩增法(primer-extension preamplification,PEP)。以15个碱基随机寡核苷酸为引物，通过热循环反应，能够得到使单个二倍体细胞基因组78%序列的拷贝数增加30倍以上[1]，其产物分为若干份作为模板，可进行多位点PCR扩增或重复扩增。我们引用此法实现了微量模板DNA的相同或(和)不同靶序列位点的多次PCR反应。结果证明，此方法用于微量DNA分析，具有较高的实用价值。
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1 材料与方法
1.1 引物 15个碱基随机寡核苷酸引物、扩增Y染色体长臂重复序列DYZ1片段引物YCH和扩增X染色体上Ⅴ Ⅲ因子基因的引物F8[2]，均由美国CyberSyn公司合成。随机引物：5′-d(NNNNNNNN-NNNNNNN)-3′，N代表dAMP、dTMP、dGMP、dCMP任一种脱氧核苷酸残基。YCH1：5′-CAATCTATTACAATCTAA-TGAACTTTA-3′；YCH2：5′-TTCCATT-CCATTCCATTCCTTTCCTTT-3′，扩增片段长度248bp。F8-1：5′-CTGTGCT-CTCAAAACCCACC-3′；F8-2：5′-CAC-TGCAGCAATAAAATAGT-3′，扩增片段长度208bp。
1.2 试剂 Taq DNA聚合酶购自北京泰克金生物技术有限公司，dNTP购自宝灵曼公司，其它常规试剂均为分析纯级，购自国内有关厂商。
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1.3 使用的主要设备 PCR反应使用美国MJ公司的PTC-200型扩增仪。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在美国Stratagene公司Eagle eyeⅡ凝胶系统分析仪上定性、相对定量分析。
1.4 方法 (1)确定扩增得到“平台效应”前的热循环周期数，以及所需最低模板量。按常规方法提取、纯化外周血(男性)白细胞DNA，紫外分光光度计定量。建立20μlPCR扩增反应体系，内含引物0.5μmol/L,dNTP各150μmol/L,Taq DNA聚合酶2U，10×缓冲液2.0μl，模板2.0μl，补充去离子水至20μl。模板DNA量呈梯度稀释后加入，分别为12ng、6ng、3ng、1.5ng、0.75ng。扩增条件：94℃变性40秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，35、33、30、28、25个循环，72℃温育5分钟。产物相对定量。当产物量也相应成倍比关系时，其最大的循环周期数，即为“平台效应”前的循环数。在此循环数下，产物经琼脂凝胶电泳，EB染色后可检测的最初模板量，即为我们所需的最低模板量。(2)PEP反应：建立引物延伸预扩增反应体系20μl。含模板1.5ng(最低模板量)，50mmol/L KC1,2.5mmol/L MgCl2，0.1mg/ml gelatin,10mmol/L Tris*HCl(pH9.0),200μ mol/L dNTP,随机引物浓度为30μmol/L,97℃变性5分钟，再加入2U Taq DNA聚合酶，并覆盖适量石蜡油。反应条件为：92℃1分钟，37℃2分钟，10秒/度升温斜率到55℃，55℃4分钟，反应共50个周期，最后72℃保温5分钟。(3)PCR反应 引物YCH扩增体系20μl,取2μlPEP反应产物为模板，28个热循环(到达“平台效应”前)，体系中其它反应成分、扩增参数与(1)相同。同样取1.5ng男性DNA为模板，在同等PCR反应体系和循环参数下扩增，其产物量作为判断PEP后拷贝数增加程度的基准对照。(4)PEP后不同位点扩增。PEP后扩增Y染色体上DYZ1片段的体系和循环参数同(3)，将循环周期数增至35。扩增X染色体DNA片段引物F8体系20μl，用4μl上述PEP反应产物为模板。体系含引物0.5μmol/L,dNTP各150μmol/L,Taq DNA聚合酶1U，10×缓冲液2.0μl，镁离子为1.3mmol/L,补充去离子水至20μl，加入模板。扩增条件：94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃温育5分钟。(5)结果分析：各取扩增产物10μl，同时将特定量的此DYZ1片段梯度稀释，在含EB(0.5μg/L)的2.0%琼脂糖凝胶上点样电泳，凝胶系统分析仪上以梯度稀释的DYZ1片段为标准参照，比较荧光亮度，获得PEP后再经PCR扩增和基准对照PCR的产物相对量，通过两者的比值，得到PEP后靶序列拷贝数提高的信息。
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2 结果与讨论
在本实验室条件和反应体系下，28个循环扩增Y染色体长臂重复序列DYZ1 248bp片段，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，其扩增产物可检测的最低初始模板量为1.5ng/20μl体系。20μl随机引物延伸预扩增体系中加入1.5ng模板，PEP反应后取其产物的1/10(2μl)作为模板，扩增248bp的DYZ1片段。电泳后，凝胶分析系统分析，经PEP反应后DYZ1片段扩增产物相对量与未经PEP反应的基准对照产物相对量之比为：1.2±0.2。PEP预扩增反应后，只用其产物的1/10作为DYZ1片段扩增模板，因而可推断得出：经随机寡核苷酸引物延伸预扩增反应，248bp的DYZ1片段拷贝数增加了10倍以上。
随机序列引物，即引物由4种脱氧核糖核酸随机排列组合生成，合成的引物种类数理论上符合随机排列组合定理。即15个碱基随机序列引物具有的引物种类数是415=1.0×109个。在相对宽松的扩增条件下，如此众多种类的引物，可普遍提高DNA片段的拷贝数。但在PEP扩增体系内，针对随机引物中某一种引物而言，其引物量是非常少的，为体系中加入随机引物量的1/415=1.0×10-9。因而，即使PEP循环周期数为50，拷贝数也只能提高10倍左右。
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微量DNA(1.5ng)经PEP后，分别取其产物作为模板，成功地扩增了Y染色体上248bp的DYZ1片段和X染色体上第Ⅷ因子基因208bp的F8片段。可见，原本只能满足一次YCH引物扩增的微量DNA(1.5ng)经PEP后，其产物可多次作为PCR模板扩增相同或(和)不同位点DNA片段的模板。
我们在研究中注意到，随着起始模板量的增加，PEP后拷贝数提高程度呈下降趋势，这可能与随机引物相对于模板量比例减少，耗费强度加大有关。同时也说明Zhang等[1]研究中，得到单细胞基因组拷贝数提高30倍以上，与引物相对于模板较充沛相关。另外，PEP预扩增随机提高片段拷贝数程度与片段长度呈负相关。
由我们的研究结果可见，极微量模板DNA经随机引物延伸反应后，取其1/10进行扩增，PCR产量明显高于相同初始模板量的常规PCR产出量。使原本仅能进行一次PCR反应的模板，可多次用于(不少于10次)扩增。预示着可进行标本DNA多位点遗传分析或重复扩增相互验证实验结果。另外，经PEP后明显增加了微量DNA模板扩增的敏感度。由于随机引物的特性，引物延伸预扩增中不会出现某一片段的优势扩增，避免了象套式PCR技术那样过于敏感，即使一个DNA拷贝的污染也有造成假阳性的可能性。且本方法在进行多个不同片段DNA分析时无需特定的套式引物。
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本课题受全军“九五”青年科研基金(95A016)资助
参考文献
1 Zhang L,Cui XF,Schmitt K,et al.Whole genome from a single cell: implications for genetic analysis.Pro Natl Acad Sci U S A,1992,89∶5847-5851.
2 Linda RA,Andrews RH,Vowell NL,et al.Improved detection of fetal cells from maternal blood with polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol,1994,170∶952-955.
(收稿：1998-12-18 修回：1999-05-10), http://www.100md.com
单位：050082石家庄，北京军区白求恩国际和平医院优生优育中心
关键词：
一种普遍提高微量DNA拷贝数的方法 聚合酶链反应(polymorphism chain reaction,PCR)工作中常受标本量的制约。如胚胎移植前基因诊断的单细胞、古标本、血斑、精斑等，标本来源有限，量又少，甚至单个模板DNA分子，最多能满足1次PCR扩增模板量的需求。类似标本的DNA分析中，能够扩增多个靶序列片段进行DNA多位点遗传分析，或同一靶序列重复扩增确保结果准确性，是科研和实践中很有价值的课题。针对微量模板DNA靶片段量少，扩增产量低的缺陷，采用套式PCR技术，可较大地提高扩增效率。但此技术过于敏感，假阳性率高，尤其仅只限于单一位点分析。因而对微量DNA，特别是单体细胞、配子体等的基因定型、多位点遗传分析用处不大。我们介绍一种广泛提高序列拷贝数，使微量DNA可用于多位点扩增的方法——引物延伸预扩增法(primer-extension preamplification,PEP)。以15个碱基随机寡核苷酸为引物，通过热循环反应，能够得到使单个二倍体细胞基因组78%序列的拷贝数增加30倍以上[1]，其产物分为若干份作为模板，可进行多位点PCR扩增或重复扩增。我们引用此法实现了微量模板DNA的相同或(和)不同靶序列位点的多次PCR反应。结果证明，此方法用于微量DNA分析，具有较高的实用价值。
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1 材料与方法
1.1 引物 15个碱基随机寡核苷酸引物、扩增Y染色体长臂重复序列DYZ1片段引物YCH和扩增X染色体上Ⅴ Ⅲ因子基因的引物F8[2]，均由美国CyberSyn公司合成。随机引物：5′-d(NNNNNNNN-NNNNNNN)-3′，N代表dAMP、dTMP、dGMP、dCMP任一种脱氧核苷酸残基。YCH1：5′-CAATCTATTACAATCTAA-TGAACTTTA-3′；YCH2：5′-TTCCATT-CCATTCCATTCCTTTCCTTT-3′，扩增片段长度248bp。F8-1：5′-CTGTGCT-CTCAAAACCCACC-3′；F8-2：5′-CAC-TGCAGCAATAAAATAGT-3′，扩增片段长度208bp。
1.2 试剂 Taq DNA聚合酶购自北京泰克金生物技术有限公司，dNTP购自宝灵曼公司，其它常规试剂均为分析纯级，购自国内有关厂商。
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1.3 使用的主要设备 PCR反应使用美国MJ公司的PTC-200型扩增仪。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在美国Stratagene公司Eagle eyeⅡ凝胶系统分析仪上定性、相对定量分析。
1.4 方法 (1)确定扩增得到“平台效应”前的热循环周期数，以及所需最低模板量。按常规方法提取、纯化外周血(男性)白细胞DNA，紫外分光光度计定量。建立20μlPCR扩增反应体系，内含引物0.5μmol/L,dNTP各150μmol/L,Taq DNA聚合酶2U，10×缓冲液2.0μl，模板2.0μl，补充去离子水至20μl。模板DNA量呈梯度稀释后加入，分别为12ng、6ng、3ng、1.5ng、0.75ng。扩增条件：94℃变性40秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，35、33、30、28、25个循环，72℃温育5分钟。产物相对定量。当产物量也相应成倍比关系时，其最大的循环周期数，即为“平台效应”前的循环数。在此循环数下，产物经琼脂凝胶电泳，EB染色后可检测的最初模板量，即为我们所需的最低模板量。(2)PEP反应：建立引物延伸预扩增反应体系20μl。含模板1.5ng(最低模板量)，50mmol/L KC1,2.5mmol/L MgCl2，0.1mg/ml gelatin,10mmol/L Tris*HCl(pH9.0),200μ mol/L dNTP,随机引物浓度为30μmol/L,97℃变性5分钟，再加入2U Taq DNA聚合酶，并覆盖适量石蜡油。反应条件为：92℃1分钟，37℃2分钟，10秒/度升温斜率到55℃，55℃4分钟，反应共50个周期，最后72℃保温5分钟。(3)PCR反应 引物YCH扩增体系20μl,取2μlPEP反应产物为模板，28个热循环(到达“平台效应”前)，体系中其它反应成分、扩增参数与(1)相同。同样取1.5ng男性DNA为模板，在同等PCR反应体系和循环参数下扩增，其产物量作为判断PEP后拷贝数增加程度的基准对照。(4)PEP后不同位点扩增。PEP后扩增Y染色体上DYZ1片段的体系和循环参数同(3)，将循环周期数增至35。扩增X染色体DNA片段引物F8体系20μl，用4μl上述PEP反应产物为模板。体系含引物0.5μmol/L,dNTP各150μmol/L,Taq DNA聚合酶1U，10×缓冲液2.0μl，镁离子为1.3mmol/L,补充去离子水至20μl，加入模板。扩增条件：94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃温育5分钟。(5)结果分析：各取扩增产物10μl，同时将特定量的此DYZ1片段梯度稀释，在含EB(0.5μg/L)的2.0%琼脂糖凝胶上点样电泳，凝胶系统分析仪上以梯度稀释的DYZ1片段为标准参照，比较荧光亮度，获得PEP后再经PCR扩增和基准对照PCR的产物相对量，通过两者的比值，得到PEP后靶序列拷贝数提高的信息。
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2 结果与讨论
在本实验室条件和反应体系下，28个循环扩增Y染色体长臂重复序列DYZ1 248bp片段，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，其扩增产物可检测的最低初始模板量为1.5ng/20μl体系。20μl随机引物延伸预扩增体系中加入1.5ng模板，PEP反应后取其产物的1/10(2μl)作为模板，扩增248bp的DYZ1片段。电泳后，凝胶分析系统分析，经PEP反应后DYZ1片段扩增产物相对量与未经PEP反应的基准对照产物相对量之比为：1.2±0.2。PEP预扩增反应后，只用其产物的1/10作为DYZ1片段扩增模板，因而可推断得出：经随机寡核苷酸引物延伸预扩增反应，248bp的DYZ1片段拷贝数增加了10倍以上。
随机序列引物，即引物由4种脱氧核糖核酸随机排列组合生成，合成的引物种类数理论上符合随机排列组合定理。即15个碱基随机序列引物具有的引物种类数是415=1.0×109个。在相对宽松的扩增条件下，如此众多种类的引物，可普遍提高DNA片段的拷贝数。但在PEP扩增体系内，针对随机引物中某一种引物而言，其引物量是非常少的，为体系中加入随机引物量的1/415=1.0×10-9。因而，即使PEP循环周期数为50，拷贝数也只能提高10倍左右。
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微量DNA(1.5ng)经PEP后，分别取其产物作为模板，成功地扩增了Y染色体上248bp的DYZ1片段和X染色体上第Ⅷ因子基因208bp的F8片段。可见，原本只能满足一次YCH引物扩增的微量DNA(1.5ng)经PEP后，其产物可多次作为PCR模板扩增相同或(和)不同位点DNA片段的模板。
我们在研究中注意到，随着起始模板量的增加，PEP后拷贝数提高程度呈下降趋势，这可能与随机引物相对于模板量比例减少，耗费强度加大有关。同时也说明Zhang等[1]研究中，得到单细胞基因组拷贝数提高30倍以上，与引物相对于模板较充沛相关。另外，PEP预扩增随机提高片段拷贝数程度与片段长度呈负相关。
由我们的研究结果可见，极微量模板DNA经随机引物延伸反应后，取其1/10进行扩增，PCR产量明显高于相同初始模板量的常规PCR产出量。使原本仅能进行一次PCR反应的模板，可多次用于(不少于10次)扩增。预示着可进行标本DNA多位点遗传分析或重复扩增相互验证实验结果。另外，经PEP后明显增加了微量DNA模板扩增的敏感度。由于随机引物的特性，引物延伸预扩增中不会出现某一片段的优势扩增，避免了象套式PCR技术那样过于敏感，即使一个DNA拷贝的污染也有造成假阳性的可能性。且本方法在进行多个不同片段DNA分析时无需特定的套式引物。
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本课题受全军“九五”青年科研基金(95A016)资助
参考文献
1 Zhang L,Cui XF,Schmitt K,et al.Whole genome from a single cell: implications for genetic analysis.Pro Natl Acad Sci U S A,1992,89∶5847-5851.
2 Linda RA,Andrews RH,Vowell NL,et al.Improved detection of fetal cells from maternal blood with polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol,1994,170∶952-955.
(收稿：1998-12-18 修回：1999-05-10), http://www.100md.com