端粒酶核酶抑制裸鼠移植瘤生长的实验研究
作者：屈艺 刘菽秋 张朝良 白绍槐 欧阳雪松 刘柏林*
单位：610041 成都，华西医科大学分子生物研究室
关键词：端粒酶；核酶；裸鼠移植瘤；生长；凋亡
中华医学遗传学杂志990606 【摘要】 目的 探讨端粒酶核酶对裸鼠移植瘤生长的影响。方法 构建了人子宫颈癌细胞株HeLa裸鼠移植瘤，将不同剂量端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-teloRZ用脂质体包裹后进行瘤体内多点注射，对照组注射生理盐水或空质粒载体。连续注射14 天，测量肿瘤体积和重量，检测瘤组织端粒酶活性，并作病理切片检查。结果 端粒酶核酶使肿瘤组织端粒酶活性下降，肿瘤组织凋亡增加，明显地抑制了裸鼠移植瘤生长。结论 该端粒酶核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂，在肿瘤基因治疗中发挥作用。
Study on the inhibition of nude mice transplantation tumor growth by telomerase ribozyme
, 百拇医药
QU Yi, LIU Shuqiu, ZHANG Chaoliang,BAI Saohuai, OUYANG Xuesong, LIU Bailin.* Laboratory of Medical Molecular Biology, West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041 P.R.China. Email:quyi@mail.sc.cninfo.net
【Abstract】 Objective To explore whether telomerase ribozyme could inhibit the growth of nude mice transplantation tumor.Mehtods A xenograft human-nude mouse model was constructed. A total of 24 mice were divided into 4 groups, namely, the saline control(Group 1), the blank plasmid control(Group 2), the 20μg/mouse/day pXJ-neo-teloRZ(Group 3) and the 30μg/mouse/day pXJ-neo-teloRZ(Group 4).All plasmids were packaged by lipofectamine and used for subcutaneous, continuous infusions over 14 days. Tumor measurements and observations of animal behavior were recorded daily. On completion of the study, the mice were killed by cervical dislocation and their organs were removed, weighed, and stored in formaldehyde for histological examination. The telomerase activities of tumor tissues of each group were also detected.Results The telomerase ribozyme effectively inhibited the telomerase activities of tumor tissues and promoted the apoptosis of tumor cells. The in vivo studies showed a significant decrease in tumor size in mice treated with pXJ-neo-teloRZ when compared to the mice treated with controls.Furthermore, the in vivo effect of pXJ-neo-teloRZ was dose dependent.Conclusion Telomerase ribozyme is a powerful telomerase inhibition agent; probably it could be effective in tumor gene therapy.
, 百拇医药
【Key words】 Telomerase Ribozyme Nude mice transplantation tumor Growth Apoptosis
端粒酶激活与恶性肿瘤的形成和发展密切相关[1]。我们曾报道设计、合成了一种针对端粒酶RNA组分的核酶(telomerase ribozyme,telo RZ)，将其导入体外培养的HeLa细胞能有效抑制端粒酶活性，使细胞倍增时间延长，培养19～20代后出现大量凋亡[2]。本研究旨在进一步探讨该端粒酶核酶对裸鼠移植瘤生长的抑制情况。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料 人子宫颈癌细胞株HeLa为本室传代培养。BALB/C裸鼠(重约20g/只)购于华西医科大学实验动物中心。端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-telo RZ由本室构建并保存。脂质体转染试剂Lipofectamin为GIBCO BRL公司产品。端粒酶检测试剂盒TRAP EZETM Telomerase Detection Kit购自Oncor公司。
, http://www.100md.com
1.2 HeLa裸鼠移植瘤的建立 HeLa细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱中常规培养传代。收获处于对数生长期的HeLa细胞，按每只裸鼠1×107分别皮下注射到24只6周龄裸鼠左胁肋部，2周后肿瘤长至65mm3大小时用于实验。
1.3 端粒酶核酶对肿瘤生长的抑制 端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-telo RZ按文献[2]的方法构建。将裸鼠分为4组，每组6只(雌雄各半)。1组为生理盐水对照组，每日于瘤体内多点注射400μl/只生理盐水；2组为空质粒载体对照组，每日瘤体内多点注射30μg/只空质粒载体pXJ-neo(30μg pXJ-neo+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)；3组为小剂量组，每日瘤体内多点注射20μg/只pXJ-neo-telo RZ(20μg pXJ-neo-telo RZ+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)；4组为大剂量组，每日瘤体内多点注射30μg/只pXJ-neo-telo RZ(30μg pXJ-neo-telo RZ+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)。连续注射14天，动态测定肿瘤体积(长×宽×高×0.5236)。14天后用断颈法处死动物，测量肿瘤湿重，按文献[3]的方法测量肿瘤端粒酶活性，并按常规方法作病理切片检查。采用t检验检测有无组间显著性差异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 端粒酶核酶对肿瘤生长的抑制 注射pXJ-neo-telo RZ的肿瘤生长速度明显较注射生理盐水和空质粒载体的对照组为慢，见表1。小剂量组抑瘤率为45%，大剂量组抑瘤率为62%。结果提示，脂质体能有效介导端粒酶核酶基因进入肿瘤细胞，核酶基因的表达能够抑制裸鼠体内肿瘤生长。图1示用药14天后各组裸鼠移植瘤大小。对用药14天后的各组裸鼠移植瘤作中性福尔马林固定，5μm常规石蜡切片，HE染色，镜下观察瘤体的组织病理学特征，结果表明，注射pXJ-neo-teloRZ的肿瘤组织凋亡细胞较对照组明显增多(图2)。
表1 注射pXJ-neo-teloRZ对裸鼠移植瘤生长的影响
Tab 1 Effect of pXJ-neo-teloRZ on nude mice transplantation tumor growth Groups
, 百拇医药
(分组)
Mean tumor volume on
7th day(mm3)
(7天时肿瘤平均体积)
Mean tumor weight on 14th day(g)
(14天时肿瘤平均湿重)
P value
(P值)
Tumor inhibition Ratio
(抑瘤率%)
, http://www.100md.com Normal saline control(group 1，1组)
176
0.788±0.193
-
0
pXJ-neo-telo control(group 2，2组)
174
0.774±0.224
>0.05
0
20μg pXJ-neo-teloRZ(group 3，3组)
, http://www.100md.com
105
0.433±0.178
<0.05
45
30μg pXJ-neo-teloRZ(group 4，4组)
92
0.299±0.161
<0.05
62
图1 用药14天后各组裸鼠移植瘤大小 1组：生理盐水对照组；2组:空质粒载体对照组；3组：小剂量组；4组：大剂量组；a、b、c、d、e、f示各组不同个体裸鼠肿瘤组织编号
, http://www.100md.com
Fig 1 Nude mice transplantation tumor of each group on 14th day Group 1:normal saline control;group 2:pXJ-neo control;group 3:low dosage(20μg pXJ-neo-teloRZ)group;group 4:high dosage (30μgpXJ-neo-teloRZ)group;a,c,d,e and f show different tumor tissues of each group
图2 用药14天后裸鼠移植瘤病理切片(HE×100) a：生理盐水对照组；b：大剂量组；箭头示凋亡细胞群
Fig 2 Pathological slices(HE×100) of nude mice transplantation tumor on 14th day a:normal saline control;b:high dosage(30μg pXJ-neo-teloRZ)group; arrow indicate apoptosis cells
, http://www.100md.com
2.2 核酶对肿瘤端粒酶活性的抑制 按文献[3]的方法，对注射14天后各组肿瘤组织端粒酶活性进行定量分析表明，端粒酶核酶能有效抑制肿瘤细胞端粒酶活性，小剂量组肿瘤组织端粒酶活性为生理盐水对照组的39%，大剂量组肿瘤组织端粒酶活性为生理盐水组的31%；空质粒载体组与生理盐水对照组肿瘤端粒酶活性无明显差异。图3显示部分肿瘤组织端粒酶活性检测电泳图。
图3 各组肿瘤组织端粒酶活性 M：分子量标准(pBR322/Hae Ⅲ)；1、2：la组和1b组端粒酶活性；3、4：2a组和2b组端粒酶活性；5、6：3a组和3b组端粒酶活性；7、8：4a组和4b组端粒酶活性
Fig 3 Telomerase activites of tumor tissues of each gruop M:molecular wight marker(pBR322/HaeⅢ)；lanes 1,2：telomerase activities of group 1a and group 1b;lanes 3,4:telomerase activities of group 2a and group 2b;lanes 5,6:telomerase activities of group 3a and group 3b; lanes 7,8:telomerase activities of group 4a and gruop 4b
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是一种蛋白组分和RNA组分构成的核蛋白复合物，细胞分裂时，它以自身RNA组分为模板，催化合成染色体端粒顺序，弥补端粒丢失，从而使细胞获得不死性[4]。近来的研究还表明，端粒酶不仅在维持端粒长度中起重要作用，而且它很可能是一种细胞周期调控因素，通过调控细胞周期的进程而控制着细胞增殖活力[5]。因而，抑制肿瘤细胞端粒酶活性可望达到抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡的目的。
我们根据Symons[6]锤头结构原理独立设计合成了针对hTR的核酶基因telo RZ，构建了其体外转录载体和真核表达载体。实验表明该核酶能在HeLa细胞内有效抑制端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡[2]。本研究中，我们构建了HeLa细胞裸鼠移植瘤，探讨了该核酶对肿瘤组织的生长抑制情况。结果表明，采用脂质体法能有效介导端粒酶核酶真核表达质粒进入肿瘤细胞，核酶基因能在肿瘤组织内有效表达，使肿瘤组织端粒酶活性下降至原来的30%左右，肿瘤生长速度明显变慢，凋亡的肿瘤细胞增多，从而达到了抑制肿瘤生长的目的(抑瘤率约60%)，如能进一步提高核酶基因的转染和表达效率，改进用药剂量和方式，可望使抑瘤率进一步提高。
, 百拇医药
现已证明，绝大多数(84.7%)的恶性肿瘤细胞具有端粒酶活性，而除生殖细胞以外的正常人体组织大多为端粒酶阴性，因此采用端粒酶抑制战略进行抗癌治疗具有广谱性和副作用小的特点[1]。本研究直接证明了端粒酶核酶对HeLa细胞裸鼠移植瘤的生长抑制效力，该核酶对其它恶性肿瘤的抑制作用也是能够预期的，因而可望成为一种广谱高效的抗癌药，在肿瘤基因治疗中发挥作用。
本课题受国家自然科学基金(39670821)、CMB基金资助
*通信联系人
参考文献
1 Rhyu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1995, 87(12)∶884-890.
2 屈艺、欧阳雪松、刘柏林，等.核酶抑制端粒酶活性的实验研究.中华医学遗传学杂志，1999,16(3)∶133-137.
, 百拇医药
3 欧阳雪松，屈艺，刘菽秋，等.细胞端粒酶活性的定性及定量检测.华西医科大学学报，1998，29(3)∶292-296.
4 Feng J, Walter DF, Wang SS, et al.The RNA component of human telomerase. Science, 1995, 269(5228)∶1236-1241.
5 Michael F.Telomerase and the aging cell. JAMA, 1998, 279(21)∶1732-1735.
6 Symons R. Self-cleavage of RNA in the replicative of small pathogens of plants and animals.Trends Biological Sciences, 1989, 14(167)∶445-450.
(收稿：1999-04-27 修回：1999-06-20), 百拇医药(屈艺 刘菽秋 张朝良 白绍槐 欧阳雪松 刘柏林*)
单位：610041 成都，华西医科大学分子生物研究室
关键词：端粒酶；核酶；裸鼠移植瘤；生长；凋亡
中华医学遗传学杂志990606 【摘要】 目的 探讨端粒酶核酶对裸鼠移植瘤生长的影响。方法 构建了人子宫颈癌细胞株HeLa裸鼠移植瘤，将不同剂量端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-teloRZ用脂质体包裹后进行瘤体内多点注射，对照组注射生理盐水或空质粒载体。连续注射14 天，测量肿瘤体积和重量，检测瘤组织端粒酶活性，并作病理切片检查。结果 端粒酶核酶使肿瘤组织端粒酶活性下降，肿瘤组织凋亡增加，明显地抑制了裸鼠移植瘤生长。结论 该端粒酶核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂，在肿瘤基因治疗中发挥作用。
Study on the inhibition of nude mice transplantation tumor growth by telomerase ribozyme
, 百拇医药
QU Yi, LIU Shuqiu, ZHANG Chaoliang,BAI Saohuai, OUYANG Xuesong, LIU Bailin.* Laboratory of Medical Molecular Biology, West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041 P.R.China. Email:quyi@mail.sc.cninfo.net
【Abstract】 Objective To explore whether telomerase ribozyme could inhibit the growth of nude mice transplantation tumor.Mehtods A xenograft human-nude mouse model was constructed. A total of 24 mice were divided into 4 groups, namely, the saline control(Group 1), the blank plasmid control(Group 2), the 20μg/mouse/day pXJ-neo-teloRZ(Group 3) and the 30μg/mouse/day pXJ-neo-teloRZ(Group 4).All plasmids were packaged by lipofectamine and used for subcutaneous, continuous infusions over 14 days. Tumor measurements and observations of animal behavior were recorded daily. On completion of the study, the mice were killed by cervical dislocation and their organs were removed, weighed, and stored in formaldehyde for histological examination. The telomerase activities of tumor tissues of each group were also detected.Results The telomerase ribozyme effectively inhibited the telomerase activities of tumor tissues and promoted the apoptosis of tumor cells. The in vivo studies showed a significant decrease in tumor size in mice treated with pXJ-neo-teloRZ when compared to the mice treated with controls.Furthermore, the in vivo effect of pXJ-neo-teloRZ was dose dependent.Conclusion Telomerase ribozyme is a powerful telomerase inhibition agent; probably it could be effective in tumor gene therapy.
, 百拇医药
【Key words】 Telomerase Ribozyme Nude mice transplantation tumor Growth Apoptosis
端粒酶激活与恶性肿瘤的形成和发展密切相关[1]。我们曾报道设计、合成了一种针对端粒酶RNA组分的核酶(telomerase ribozyme,telo RZ)，将其导入体外培养的HeLa细胞能有效抑制端粒酶活性，使细胞倍增时间延长，培养19～20代后出现大量凋亡[2]。本研究旨在进一步探讨该端粒酶核酶对裸鼠移植瘤生长的抑制情况。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料 人子宫颈癌细胞株HeLa为本室传代培养。BALB/C裸鼠(重约20g/只)购于华西医科大学实验动物中心。端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-telo RZ由本室构建并保存。脂质体转染试剂Lipofectamin为GIBCO BRL公司产品。端粒酶检测试剂盒TRAP EZETM Telomerase Detection Kit购自Oncor公司。
, http://www.100md.com
1.2 HeLa裸鼠移植瘤的建立 HeLa细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱中常规培养传代。收获处于对数生长期的HeLa细胞，按每只裸鼠1×107分别皮下注射到24只6周龄裸鼠左胁肋部，2周后肿瘤长至65mm3大小时用于实验。
1.3 端粒酶核酶对肿瘤生长的抑制 端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-telo RZ按文献[2]的方法构建。将裸鼠分为4组，每组6只(雌雄各半)。1组为生理盐水对照组，每日于瘤体内多点注射400μl/只生理盐水；2组为空质粒载体对照组，每日瘤体内多点注射30μg/只空质粒载体pXJ-neo(30μg pXJ-neo+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)；3组为小剂量组，每日瘤体内多点注射20μg/只pXJ-neo-telo RZ(20μg pXJ-neo-telo RZ+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)；4组为大剂量组，每日瘤体内多点注射30μg/只pXJ-neo-telo RZ(30μg pXJ-neo-telo RZ+30μl lipofectamin+370μl无血清1640培养基)。连续注射14天，动态测定肿瘤体积(长×宽×高×0.5236)。14天后用断颈法处死动物，测量肿瘤湿重，按文献[3]的方法测量肿瘤端粒酶活性，并按常规方法作病理切片检查。采用t检验检测有无组间显著性差异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 端粒酶核酶对肿瘤生长的抑制 注射pXJ-neo-telo RZ的肿瘤生长速度明显较注射生理盐水和空质粒载体的对照组为慢，见表1。小剂量组抑瘤率为45%，大剂量组抑瘤率为62%。结果提示，脂质体能有效介导端粒酶核酶基因进入肿瘤细胞，核酶基因的表达能够抑制裸鼠体内肿瘤生长。图1示用药14天后各组裸鼠移植瘤大小。对用药14天后的各组裸鼠移植瘤作中性福尔马林固定，5μm常规石蜡切片，HE染色，镜下观察瘤体的组织病理学特征，结果表明，注射pXJ-neo-teloRZ的肿瘤组织凋亡细胞较对照组明显增多(图2)。
表1 注射pXJ-neo-teloRZ对裸鼠移植瘤生长的影响
Tab 1 Effect of pXJ-neo-teloRZ on nude mice transplantation tumor growth Groups
, 百拇医药
(分组)
Mean tumor volume on
7th day(mm3)
(7天时肿瘤平均体积)
Mean tumor weight on 14th day(g)
(14天时肿瘤平均湿重)
P value
(P值)
Tumor inhibition Ratio
(抑瘤率%)
, http://www.100md.com Normal saline control(group 1，1组)
176
0.788±0.193
-
0
pXJ-neo-telo control(group 2，2组)
174
0.774±0.224
>0.05
0
20μg pXJ-neo-teloRZ(group 3，3组)
, http://www.100md.com
105
0.433±0.178
<0.05
45
30μg pXJ-neo-teloRZ(group 4，4组)
92
0.299±0.161
<0.05
62
图1 用药14天后各组裸鼠移植瘤大小 1组：生理盐水对照组；2组:空质粒载体对照组；3组：小剂量组；4组：大剂量组；a、b、c、d、e、f示各组不同个体裸鼠肿瘤组织编号
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Fig 1 Nude mice transplantation tumor of each group on 14th day Group 1:normal saline control;group 2:pXJ-neo control;group 3:low dosage(20μg pXJ-neo-teloRZ)group;group 4:high dosage (30μgpXJ-neo-teloRZ)group;a,c,d,e and f show different tumor tissues of each group
图2 用药14天后裸鼠移植瘤病理切片(HE×100) a：生理盐水对照组；b：大剂量组；箭头示凋亡细胞群
Fig 2 Pathological slices(HE×100) of nude mice transplantation tumor on 14th day a:normal saline control;b:high dosage(30μg pXJ-neo-teloRZ)group; arrow indicate apoptosis cells
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2.2 核酶对肿瘤端粒酶活性的抑制 按文献[3]的方法，对注射14天后各组肿瘤组织端粒酶活性进行定量分析表明，端粒酶核酶能有效抑制肿瘤细胞端粒酶活性，小剂量组肿瘤组织端粒酶活性为生理盐水对照组的39%，大剂量组肿瘤组织端粒酶活性为生理盐水组的31%；空质粒载体组与生理盐水对照组肿瘤端粒酶活性无明显差异。图3显示部分肿瘤组织端粒酶活性检测电泳图。
图3 各组肿瘤组织端粒酶活性 M：分子量标准(pBR322/Hae Ⅲ)；1、2：la组和1b组端粒酶活性；3、4：2a组和2b组端粒酶活性；5、6：3a组和3b组端粒酶活性；7、8：4a组和4b组端粒酶活性
Fig 3 Telomerase activites of tumor tissues of each gruop M:molecular wight marker(pBR322/HaeⅢ)；lanes 1,2：telomerase activities of group 1a and group 1b;lanes 3,4:telomerase activities of group 2a and group 2b;lanes 5,6:telomerase activities of group 3a and group 3b; lanes 7,8:telomerase activities of group 4a and gruop 4b
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是一种蛋白组分和RNA组分构成的核蛋白复合物，细胞分裂时，它以自身RNA组分为模板，催化合成染色体端粒顺序，弥补端粒丢失，从而使细胞获得不死性[4]。近来的研究还表明，端粒酶不仅在维持端粒长度中起重要作用，而且它很可能是一种细胞周期调控因素，通过调控细胞周期的进程而控制着细胞增殖活力[5]。因而，抑制肿瘤细胞端粒酶活性可望达到抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡的目的。
我们根据Symons[6]锤头结构原理独立设计合成了针对hTR的核酶基因telo RZ，构建了其体外转录载体和真核表达载体。实验表明该核酶能在HeLa细胞内有效抑制端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡[2]。本研究中，我们构建了HeLa细胞裸鼠移植瘤，探讨了该核酶对肿瘤组织的生长抑制情况。结果表明，采用脂质体法能有效介导端粒酶核酶真核表达质粒进入肿瘤细胞，核酶基因能在肿瘤组织内有效表达，使肿瘤组织端粒酶活性下降至原来的30%左右，肿瘤生长速度明显变慢，凋亡的肿瘤细胞增多，从而达到了抑制肿瘤生长的目的(抑瘤率约60%)，如能进一步提高核酶基因的转染和表达效率，改进用药剂量和方式，可望使抑瘤率进一步提高。
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现已证明，绝大多数(84.7%)的恶性肿瘤细胞具有端粒酶活性，而除生殖细胞以外的正常人体组织大多为端粒酶阴性，因此采用端粒酶抑制战略进行抗癌治疗具有广谱性和副作用小的特点[1]。本研究直接证明了端粒酶核酶对HeLa细胞裸鼠移植瘤的生长抑制效力，该核酶对其它恶性肿瘤的抑制作用也是能够预期的，因而可望成为一种广谱高效的抗癌药，在肿瘤基因治疗中发挥作用。
本课题受国家自然科学基金(39670821)、CMB基金资助
*通信联系人
参考文献
1 Rhyu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1995, 87(12)∶884-890.
2 屈艺、欧阳雪松、刘柏林，等.核酶抑制端粒酶活性的实验研究.中华医学遗传学杂志，1999,16(3)∶133-137.
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3 欧阳雪松，屈艺，刘菽秋，等.细胞端粒酶活性的定性及定量检测.华西医科大学学报，1998，29(3)∶292-296.
4 Feng J, Walter DF, Wang SS, et al.The RNA component of human telomerase. Science, 1995, 269(5228)∶1236-1241.
5 Michael F.Telomerase and the aging cell. JAMA, 1998, 279(21)∶1732-1735.
6 Symons R. Self-cleavage of RNA in the replicative of small pathogens of plants and animals.Trends Biological Sciences, 1989, 14(167)∶445-450.
(收稿：1999-04-27 修回：1999-06-20), 百拇医药(屈艺 刘菽秋 张朝良 白绍槐 欧阳雪松 刘柏林*)