应用FISH和PCR技术鉴别Turner综合征患者标记染色体起源
作者：胡晓峰 朱宝生 虎宝先 林汉华 舒丹 李春华 刘希贤
单位：胡晓峰 林汉华 舒丹 430030 武汉，同济医科大学同济医院儿科；虎宝先 附属协和医院；刘希贤 医学遗传研究室；朱宝生 李春华 云南省第一人民医院
关键词：Turner综合征；标记染色体；荧光原位杂交；聚合酶链式反应
应用FISH和PCR技术鉴别Turner 综合征患者标记染色体起源 【摘要】 目的 为指导遗传咨询，鉴别Turner综合征患者微小标记染色体起源。方法 选择SRY基因编码区1对特异寡核苷酸引物、X和Y染色体特异探针，采用PCR及荧光原位杂交方法，对8例具有Turner综合征体征的患者进行标记染色体分析。结果 5例患者标记染色体起源于X染色体；3例起源于Y染色体，其中2例SRY基因序列扩增，可见男性特异扩增带，另1例无男性特异扩增带。结论 FISH与PCR技术结合可准确鉴别标记染色体，对选择治疗方案及了解核型与表型关系有指导意义。
, http://www.100md.com
An investigation of small marker chromosome in eight Turner syndrome patients by fluorescence in situ hybridization and DNA analysis
HU Xiaofeng*,ZHU Baosen,HU Baoxian,LIN Hanhua,SHU Dan,LI Chunhua， LIU Xixian.*Department of Pediatrics, Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030 P.R.China.E-mail:xiaofenghu@hotmail.com
【Abstract】 Objective To direct genetic counseling and identify the origin of small marker chromosome in patients with Turner syndrome stigmata.Methods The specific primer on the sex determining region on Y (SRY) and biotin labeled X- and Y-chromosome DNA probes were utilized in the analysis of sex chromosome-derived markers.The PCR product from the amplification was detected on agarose gel,and fluorescence in situ hybridization(FISH) was conducted to metaphase chromosome.ResultsIn 8 patients who had a small marker chromosome, five markers were derived from the X chromosome and three from the Y chromosome.Two patients with a Y-derived marker were determined by Y-chromosome probe as well as by SRY sequences amplification.One patient with a Y-derived marker was only demonstrated by FISH.Conclusion The findings of this study demonstrate successfully the value and necessity of FISH utilizing DNA probes combined with specific amplification on SRY gene in the identification of sex chromosome marker.Such identification is important not only for clinical care,but also for understanding phenotype-karyotype correlations.
, 百拇医药
【Key words】 Turner syndrome Marker chromosome Fluorescence in situ hybridizationPolymerase chain reaction
约半数Turner综合征患者伴有X染色体结构畸变，或为性染色体数目、结构畸变的嵌合体，嵌合体中6%～11%患者带有起源于X或Y染色体的微小标记染色体细胞系[1]，资料表明，标记染色体来源于Y染色体的患者，约20%可发生性腺肿瘤[2]。因此，辨认标记染色体起源，是指导遗传咨询、选择治疗方案的关键。我们应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法，对8例具有Turner综合征体征患者的标记染色体起源进行了分析，现报告如下。
1 材料与方法
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1.1 病例 本组病例来源于本院儿科、计划生育专科门诊，3例因原发性闭经就诊，5例以生长发育落后就诊。8例表型及心理性别均为女性，身高均低于同性别同年龄组第3百分位数，智力正常，均有Turner综合征体征。临床特征及盆腔超声检查结果见表1。
表1 8例患者临床特征
Tab 1 The clinical features in 8 patients
Case No.
(例号)
Age
(years)
(年龄)
Short
, 百拇医药
stature
(矮身材)
Short
neck
(颈短)
Low hair
line
(发际低)
Cubitus
valgus
(肘外翻)
External
, 百拇医药 genitalia
(外阴)
Gonadal dysgenesis
(性腺发育不良)
1
17
+
+
+
+
infantile
uterus, ovarian
2
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15
+
+
+
+
infantile
uterus, ovarian
3
15
+
0
+
+
, 百拇医药
infantile
uterus, ovarian
4
25
+
+
+
+
infantile
uterus, ovarian
5
20
+
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+
+
+
infantile
uterus, ovarian
6
17
+
+
+
-
infantile
uterus, ovarian
, 百拇医药
7
15
+
+
+
-
infantile
rudimentary uterus,no nympha
no testis
8
25
+
+
, 百拇医药
+
+
infantile
uterus,ovarian
infantile(幼稚型)；no nympha(无小阴唇)；uterus(子宫)；ovarian(卵巢)；rudimentary uterus,no nympha(始基子宫、未见睾丸组织)
1.2 方法
1.2.1 染色体制备及核型分析 外周血染色体GTG显带标本制备按本室常规方法，核型分析参照ISCN(1981)标准[3]，每例计数60～80分裂相，记录核型。
1.2.2 PCR扩增及产物检测 按常规方法提取患者外周血基因组DNA，参照文献[4]合成SRY基因编码区1对引物，该引物特异性扩增正常男性SRY基因保守区299bp的DNA片段，序列为：Sp1:5′-CGGGAG-AAAACAGTAAAGGC-3′;Sp2:5′-CTGCGGGAAG-CAAACTGC-3′。扩增体系含DNA模板50～100ng，反应总体积25μl，30个周期循环(94℃ 30秒变性，60℃30秒退火，72℃1分30秒延伸)。反应完成后，取扩增产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。
, 百拇医药
1.2.3 FISH 染色体探针选用荧光素直接标记的全染色体探针试剂盒(WCP，BRL)，Y染色体DNA探针为Spectrum Orange荧光素直接标记，X染色体DNA探针为FITC(异硫氰荧光素)直接标记；X染色体着丝粒探针用Rhodamine标记。操作步骤按Dartler等[5]的方法加以修改进行。已做过GTG显带核型分析的玻片标本照相记录后，经二甲苯、乙醇、甲醇脱油脱色，空气干燥。玻片浸入67℃ 70%甲酰胺溶液中变性10秒钟，取出立即投入预冷在-20℃的70%乙醇中固定2分钟，再经乙醇系列脱水，空气干燥后进行杂交。于Olympus BX60荧光显微镜下，用WU、WIB、WIG滤镜组分别观察DAPI复染的分裂相和杂交的荧光信号，用Fuji-Color 400G日光型负片照相记录。
2 结果
2.1 核型分析 8例患者核型均为45，X/46，X，+mar,各患者的两种细胞系比例不同，见表2。GTG显带未能辨认mar。
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表2 8例患者核型PCR及FIST结果
Tab2 Karyotype results of FISH and PCR in 8 patients
Case No.
(例号)
No.of
metaphases
counted
(计数细胞)
No.of 46,X,+mar cells
(含mar的
细胞数)
, 百拇医药
FISH
SRY
Karyotype
(核型)
X
Y
1
60
14
+
ND
-
45，X/46，X，mar(X)
, 百拇医药
2
60
18
+
ND
-
45，X/46，X，mar(X)
3
80
10
+
ND
-
, 百拇医药 45，X/46，X，mar(X)
4
80
32
+
ND
-
45，X/46，X，mar(X)
5
80
24
+
ND
, 百拇医药
-
45，X/46，X，mar(X)
6
80
61
ND
+
+
45，X/46，X，mar(Y)
7
100
27
ND
, 百拇医药
+
+
45，X/46，X，mar(Y)
8
100
34
-
+
-
45，X/46，X，mar(Y)
ND：Not done(未作)
2.2 PCR分析 正常男性和例6、例7的PCR产物电泳染色后，在300bp处可见1条清晰带纹，正常女性和另外6例患者无此带纹(图1)，提示例6、例7基因组中存在SRY基因序列，重复5次实验结果相同。
, 百拇医药
图1 SRY基因PCR扩增产物 M：分子量标准，1：正常男性外周血DNA；2：正常女性外周血DNA；3～6：分别为病例6、7、8和1
Fig1 Y chromosome specific sequencies amplified by PCR with oligoprimers corresponding to SRY M: PCR markers, lane 1:peripheral blood DNA from control male; lane 2:control female;and lanes 3-6:cases 6,7,8, and 1,respectively
2.3 FISH分析 例1～5用X特异探针杂交后标记染色体与正常X均显示杂交信号，例6、例7、例8用Y染色体探针杂交后，标记染色体显示橘红色杂交信号(图2)。
, 百拇医药
图2 X、Y染色体探针FISH结果
Fig 2 Fluorescent in situ hybridization of biotin laelled DXZ1 (a),X WPC,Y WPC(b) to metaphase chromosomes from (a)patient 2,(b)patient 8,M indicates the marker chromosomes,n indicates the normal X chromosomes
3 讨论
核型为45，X/46，X,mar的个体，常伴有不同程度Turner综合征体征[6]。mar来源不同，治疗方案及预后有很大差别。我们应用FISH和PCR技术准确鉴定了8个病例的性染色体标记染色体来源，进一步完善了细胞遗传学诊断。已作显带核型分析的标本，可经脱油脱色处理后用于原位杂交，避免重复采样，尤其适用于产前诊断，也利于回顾性分析，以及检测嵌合细胞系比例极少的病例。另外，扩增Y染色体特异性片段也可用于筛查带有Y染色体来源的标记染色体个体。
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据文献报道，与mar(X)个体比较，带有mar(Y)的女性表型患者，身材矮小的程度较轻，体征少，且至今未发现伴智力低下者。本组例6、例7临床特征也与之相符，但病例数少，需继续积累病例。例8经FISH证实有Y染色体片段，但SRY基因扩增产物阴性，提示缺失发育可能是SRY基因该患者女性表型形成的主要原因。本组3例带有mar(Y)的患者，体格检查于大阴唇及腹股沟区均未触及结节，建议作剖腹探查，对发育不良之性腺作病理检查，了解有无睾丸组织存在，以利于研究基因型与表型的关系。
性染色体标记染色体的嵌合比例可能与复杂表型形成有关[7]。对本组病例核型分析，两种细胞系嵌合比例不同，mar细胞系范围14%～38%，但临床表型无明显差异，推测可能在组织分化过程中，嵌合细胞系在组织间存在差异，单纯凭外周白血细胞嵌合细胞比例难以建立表型与核型之间的关系。
总之，在细胞遗传学基础上，采用DNA分析和分子细胞遗传学相结合的方法，可准确辨认性腺不良患儿的标记染色体起源，对指导遗传咨询，避免手术失误具有指导性意义。
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参考文献
1 Cooper C,Crolla JA,Laister C,et al.An investigation of ring and dicentric chromosome found in three Turner's syndrome patients using DNA analysis and in situ hybridization with X and Y chromosome specific probes.J Med Genet,1991,28∶6-9.
2 Nagel T,Camarge M,Tagatz G,et al.Gonadal tumors in patients with gonadal dysgenesis and sex chromosome rings and fragments.Am J Obstet Gynecol,1984,150∶76-82.
, http://www.100md.com
3 ISCN.An international system for human cytogenetics nomenclature high-resolution banding.Cytogenet Cell Genet,1981,31∶1.
4 Jager RJ,Anveret M,Hall K,et al.A human XY female with a frame shift mutation in the candidate testis-determining gene SRY.Nature,1990,348∶452.
5 朱宝生，章晓梅，任淑平，等.染色体原位抑制杂交鉴别染色体易位和标记染色体.中华医学遗传学杂志.1995，13∶308-309.
6 Fernandez R,Pasaro E,Mendez J.Turner syndrome: a study of chromosomal mosaicism.Hum Genet,1996,98∶29-35.
7 Kuznetzova T,Baranov A,Schwed N,et al.Cytogenetic and molecular findings in patients with Turner's syndrome stigma.J Med Genet,1995,32∶962-967.
(收稿：1998-12-27 修回：1999-02-28), 百拇医药
单位：胡晓峰 林汉华 舒丹 430030 武汉，同济医科大学同济医院儿科；虎宝先 附属协和医院；刘希贤 医学遗传研究室；朱宝生 李春华 云南省第一人民医院
关键词：Turner综合征；标记染色体；荧光原位杂交；聚合酶链式反应
应用FISH和PCR技术鉴别Turner 综合征患者标记染色体起源 【摘要】 目的 为指导遗传咨询，鉴别Turner综合征患者微小标记染色体起源。方法 选择SRY基因编码区1对特异寡核苷酸引物、X和Y染色体特异探针，采用PCR及荧光原位杂交方法，对8例具有Turner综合征体征的患者进行标记染色体分析。结果 5例患者标记染色体起源于X染色体；3例起源于Y染色体，其中2例SRY基因序列扩增，可见男性特异扩增带，另1例无男性特异扩增带。结论 FISH与PCR技术结合可准确鉴别标记染色体，对选择治疗方案及了解核型与表型关系有指导意义。
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An investigation of small marker chromosome in eight Turner syndrome patients by fluorescence in situ hybridization and DNA analysis
HU Xiaofeng*,ZHU Baosen,HU Baoxian,LIN Hanhua,SHU Dan,LI Chunhua， LIU Xixian.*Department of Pediatrics, Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030 P.R.China.E-mail:xiaofenghu@hotmail.com
【Abstract】 Objective To direct genetic counseling and identify the origin of small marker chromosome in patients with Turner syndrome stigmata.Methods The specific primer on the sex determining region on Y (SRY) and biotin labeled X- and Y-chromosome DNA probes were utilized in the analysis of sex chromosome-derived markers.The PCR product from the amplification was detected on agarose gel,and fluorescence in situ hybridization(FISH) was conducted to metaphase chromosome.ResultsIn 8 patients who had a small marker chromosome, five markers were derived from the X chromosome and three from the Y chromosome.Two patients with a Y-derived marker were determined by Y-chromosome probe as well as by SRY sequences amplification.One patient with a Y-derived marker was only demonstrated by FISH.Conclusion The findings of this study demonstrate successfully the value and necessity of FISH utilizing DNA probes combined with specific amplification on SRY gene in the identification of sex chromosome marker.Such identification is important not only for clinical care,but also for understanding phenotype-karyotype correlations.
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【Key words】 Turner syndrome Marker chromosome Fluorescence in situ hybridizationPolymerase chain reaction
约半数Turner综合征患者伴有X染色体结构畸变，或为性染色体数目、结构畸变的嵌合体，嵌合体中6%～11%患者带有起源于X或Y染色体的微小标记染色体细胞系[1]，资料表明，标记染色体来源于Y染色体的患者，约20%可发生性腺肿瘤[2]。因此，辨认标记染色体起源，是指导遗传咨询、选择治疗方案的关键。我们应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法，对8例具有Turner综合征体征患者的标记染色体起源进行了分析，现报告如下。
1 材料与方法
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1.1 病例 本组病例来源于本院儿科、计划生育专科门诊，3例因原发性闭经就诊，5例以生长发育落后就诊。8例表型及心理性别均为女性，身高均低于同性别同年龄组第3百分位数，智力正常，均有Turner综合征体征。临床特征及盆腔超声检查结果见表1。
表1 8例患者临床特征
Tab 1 The clinical features in 8 patients
Case No.
(例号)
Age
(years)
(年龄)
Short
, 百拇医药
stature
(矮身材)
Short
neck
(颈短)
Low hair
line
(发际低)
Cubitus
valgus
(肘外翻)
External
, 百拇医药 genitalia
(外阴)
Gonadal dysgenesis
(性腺发育不良)
1
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+
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infantile
uterus, ovarian
2
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15
+
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+
+
infantile
uterus, ovarian
3
15
+
0
+
+
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infantile
uterus, ovarian
4
25
+
+
+
+
infantile
uterus, ovarian
5
20
+
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+
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uterus, ovarian
6
17
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infantile
uterus, ovarian
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7
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infantile
rudimentary uterus,no nympha
no testis
8
25
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uterus,ovarian
infantile(幼稚型)；no nympha(无小阴唇)；uterus(子宫)；ovarian(卵巢)；rudimentary uterus,no nympha(始基子宫、未见睾丸组织)
1.2 方法
1.2.1 染色体制备及核型分析 外周血染色体GTG显带标本制备按本室常规方法，核型分析参照ISCN(1981)标准[3]，每例计数60～80分裂相，记录核型。
1.2.2 PCR扩增及产物检测 按常规方法提取患者外周血基因组DNA，参照文献[4]合成SRY基因编码区1对引物，该引物特异性扩增正常男性SRY基因保守区299bp的DNA片段，序列为：Sp1:5′-CGGGAG-AAAACAGTAAAGGC-3′;Sp2:5′-CTGCGGGAAG-CAAACTGC-3′。扩增体系含DNA模板50～100ng，反应总体积25μl，30个周期循环(94℃ 30秒变性，60℃30秒退火，72℃1分30秒延伸)。反应完成后，取扩增产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。
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1.2.3 FISH 染色体探针选用荧光素直接标记的全染色体探针试剂盒(WCP，BRL)，Y染色体DNA探针为Spectrum Orange荧光素直接标记，X染色体DNA探针为FITC(异硫氰荧光素)直接标记；X染色体着丝粒探针用Rhodamine标记。操作步骤按Dartler等[5]的方法加以修改进行。已做过GTG显带核型分析的玻片标本照相记录后，经二甲苯、乙醇、甲醇脱油脱色，空气干燥。玻片浸入67℃ 70%甲酰胺溶液中变性10秒钟，取出立即投入预冷在-20℃的70%乙醇中固定2分钟，再经乙醇系列脱水，空气干燥后进行杂交。于Olympus BX60荧光显微镜下，用WU、WIB、WIG滤镜组分别观察DAPI复染的分裂相和杂交的荧光信号，用Fuji-Color 400G日光型负片照相记录。
2 结果
2.1 核型分析 8例患者核型均为45，X/46，X，+mar,各患者的两种细胞系比例不同，见表2。GTG显带未能辨认mar。
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表2 8例患者核型PCR及FIST结果
Tab2 Karyotype results of FISH and PCR in 8 patients
Case No.
(例号)
No.of
metaphases
counted
(计数细胞)
No.of 46,X,+mar cells
(含mar的
细胞数)
, 百拇医药
FISH
SRY
Karyotype
(核型)
X
Y
1
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2
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45，X/46，X，mar(X)
6
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45，X/46，X，mar(Y)
7
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8
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45，X/46，X，mar(Y)
ND：Not done(未作)
2.2 PCR分析 正常男性和例6、例7的PCR产物电泳染色后，在300bp处可见1条清晰带纹，正常女性和另外6例患者无此带纹(图1)，提示例6、例7基因组中存在SRY基因序列，重复5次实验结果相同。
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图1 SRY基因PCR扩增产物 M：分子量标准，1：正常男性外周血DNA；2：正常女性外周血DNA；3～6：分别为病例6、7、8和1
Fig1 Y chromosome specific sequencies amplified by PCR with oligoprimers corresponding to SRY M: PCR markers, lane 1:peripheral blood DNA from control male; lane 2:control female;and lanes 3-6:cases 6,7,8, and 1,respectively
2.3 FISH分析 例1～5用X特异探针杂交后标记染色体与正常X均显示杂交信号，例6、例7、例8用Y染色体探针杂交后，标记染色体显示橘红色杂交信号(图2)。
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图2 X、Y染色体探针FISH结果
Fig 2 Fluorescent in situ hybridization of biotin laelled DXZ1 (a),X WPC,Y WPC(b) to metaphase chromosomes from (a)patient 2,(b)patient 8,M indicates the marker chromosomes,n indicates the normal X chromosomes
3 讨论
核型为45，X/46，X,mar的个体，常伴有不同程度Turner综合征体征[6]。mar来源不同，治疗方案及预后有很大差别。我们应用FISH和PCR技术准确鉴定了8个病例的性染色体标记染色体来源，进一步完善了细胞遗传学诊断。已作显带核型分析的标本，可经脱油脱色处理后用于原位杂交，避免重复采样，尤其适用于产前诊断，也利于回顾性分析，以及检测嵌合细胞系比例极少的病例。另外，扩增Y染色体特异性片段也可用于筛查带有Y染色体来源的标记染色体个体。
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据文献报道，与mar(X)个体比较，带有mar(Y)的女性表型患者，身材矮小的程度较轻，体征少，且至今未发现伴智力低下者。本组例6、例7临床特征也与之相符，但病例数少，需继续积累病例。例8经FISH证实有Y染色体片段，但SRY基因扩增产物阴性，提示缺失发育可能是SRY基因该患者女性表型形成的主要原因。本组3例带有mar(Y)的患者，体格检查于大阴唇及腹股沟区均未触及结节，建议作剖腹探查，对发育不良之性腺作病理检查，了解有无睾丸组织存在，以利于研究基因型与表型的关系。
性染色体标记染色体的嵌合比例可能与复杂表型形成有关[7]。对本组病例核型分析，两种细胞系嵌合比例不同，mar细胞系范围14%～38%，但临床表型无明显差异，推测可能在组织分化过程中，嵌合细胞系在组织间存在差异，单纯凭外周白血细胞嵌合细胞比例难以建立表型与核型之间的关系。
总之，在细胞遗传学基础上，采用DNA分析和分子细胞遗传学相结合的方法，可准确辨认性腺不良患儿的标记染色体起源，对指导遗传咨询，避免手术失误具有指导性意义。
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参考文献
1 Cooper C,Crolla JA,Laister C,et al.An investigation of ring and dicentric chromosome found in three Turner's syndrome patients using DNA analysis and in situ hybridization with X and Y chromosome specific probes.J Med Genet,1991,28∶6-9.
2 Nagel T,Camarge M,Tagatz G,et al.Gonadal tumors in patients with gonadal dysgenesis and sex chromosome rings and fragments.Am J Obstet Gynecol,1984,150∶76-82.
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3 ISCN.An international system for human cytogenetics nomenclature high-resolution banding.Cytogenet Cell Genet,1981,31∶1.
4 Jager RJ,Anveret M,Hall K,et al.A human XY female with a frame shift mutation in the candidate testis-determining gene SRY.Nature,1990,348∶452.
5 朱宝生，章晓梅，任淑平，等.染色体原位抑制杂交鉴别染色体易位和标记染色体.中华医学遗传学杂志.1995，13∶308-309.
6 Fernandez R,Pasaro E,Mendez J.Turner syndrome: a study of chromosomal mosaicism.Hum Genet,1996,98∶29-35.
7 Kuznetzova T,Baranov A,Schwed N,et al.Cytogenetic and molecular findings in patients with Turner's syndrome stigma.J Med Genet,1995,32∶962-967.
(收稿：1998-12-27 修回：1999-02-28), 百拇医药