突变扩增系统法检测SRD5α2基因R227Q突变
作者：光炜 周李 曾瑞萍* 杜传书
单位：光炜 曾瑞萍 杜伟书 510089 广州，中山医科大学医学遗传学教研室；周李 第一附属医院小儿外科
关键词：5α2还原酶基因；突变；突变扩增系统；尿道下裂
中华医学遗传学杂志990613 【摘要】 目的 建立一种简易、准确的2型5α还原酶(SRD5α2)基因分析方法。方法 采用突变扩增系统，对23例先天性尿道下裂患儿及正常标本进行SRD5α2基因R227Q突变分析，对阳性者进行DNA测序证实。结果 23例先天性尿道下裂患儿中，3例为SRD5α2基因R227Q突变阳性(2例为突变纯合子，1例为杂合子)，与测序结果一致；其余及正常对照均为阴性。结论 此法简单、快速、准确、易于推广，可作为先天性尿道下裂中SRD5α2基因突变的筛查方法。
Detection of R227Q mutation of SRD5α2 gene by amplification refractory mutation system
, http://www.100md.com
GUANG Wei,ZHOU Li,ZENG Ruiping*,DU Chuanshu.*Department of Medical Genetics,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089 P.R.China.
【Abstract】 Objective To set up a simple method for identifying the mutation of R227Q of SRD5α2 gene which is one of the most common mutations in congenital hypospadias in China.Methods The amplification refractory mutation system(ARMS) was employed in detecting the SRD5α2 gene R227Q mutation in congenital hypospadias confirmed by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism and DNA sequencing.Results The ARMS was successfully applied to the detection of the R227Q mutation of SRD5α2 gene.Three out of 23 congenital hypospadias were positive for R227Q mutation.The mutations determined by ARMS were in full agreement with those obtained by the DNA sequencing.Conclusion This is a simple,rapid and accurate method.It can be used for detecting the SRD5α2 gene R227Q mutation in congenital hypospadias and male pseudohermaphroditism.
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【Key words】 SRD5α2 gene Mutation Amplification refractory mutation system Hypospadias
研究表明，胚胎期男性外生殖器的发育与睾丸内雄激素(睾酮和双氢睾酮)水平密切相关。双氢睾酮生物学效应是睾酮的50倍，是促使胚胎期男性外生殖器发育的主要雄激素。5α还原酶催化睾酮还原成双氢睾酮，如发生遗传缺陷将导致不同程度男性外生殖器发育障碍，其中2型还原酶与生殖器发育关系密切。现已用5α还原酶抑制剂建立了尿道下裂动物模型，并证实部分男性假两性畸形患者有5α还原酶活性的降低[1-3]。为探讨小儿常见的先天性尿道下裂与2型5α还原酶(SRD5α2)基因突变的关系，我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)结合DNA测序方法，在23例尿道下裂患儿中，发现3例为SRD5α2基因R227Q突变纯合子或杂合子(另文发表)，提示该突变为中国人尿道下裂SRD5α2基因的常见突变。为简便、快速和准确地筛查这一突变，我们根据突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)原理，设计建立了SRD5α2基因R227Q突变的检测方法，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 研究对象及DNA提取 1996年8月～1998年2月在我校第一附属医院小儿外科住院的23例尿道下裂患儿及正常对照，抽取外周血，常规提取DNA。
1.2 引物设计 上游共同引物(SRE4A)：CGAAGT-CCGATGCAATGATTGACCTTCCGATTCTT；下游正常引物(SR227N)：TACCTATGGTGGTGAAA-TGCTC；下游突变引物(SR227M)：TACCTATGGT-GGTGAAATGCTT。内对照引物：上游：CAGGATC-CGAACAGTGAATCCTAACCTTTCCTCCC，下游：CGAAGCTTCATTGTTAGCTGGGAAGTAGGTG-AGAA。
1.3 PCR反应 每一标本分别取2管进行。每管反应体积30μl，含基因组DNA 0.5～1μg，10×缓冲液3.0μl，dNTPs(2mmol/L)3.0μl,各管均为含2对引物的双重PCR。其中一对扩增SRD5α2基因第2外显子引物作为内对照，另外一对引物，在突变管中为SRE4A和SR227M，在正常管中为SRE4A和SR227N，各对引物均为20pmol/L。PCR条件：经97℃变性7分钟后，加Taq酶2U，94℃40秒，60℃50秒，72℃60秒，共35个循环后，72℃延伸5分钟。
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1.4 结果观察 1.5%琼脂糖，0.5×TBE电泳40分钟，溴乙啶染色，紫外灯下观察并照相保存结果。
2 结果
2.1 采用双盲法对23例先天性尿道下裂患儿进行ARMS法突变筛查，检测者在检测前对患儿DNA测序结果完全不知。
2.2 正常对照及无R227Q突变的尿道下裂患儿 在正常反应管中可见两条区带，一条为263bp(内对照带)，另一条为199bp的正常带图1。而突变反应管中则只有263bp对照带。
2.3 存在R227Q突变的尿道下裂患儿(图1) R227Q突变纯合子在正常反应管中只有263bp内对照带，突变反应管中则可见263bp和199bp两条区带；而突变杂合子在正常与突变反应管中均可见263bp和199bp两条区带。
, 百拇医药
图1 ARMS法检测SRD5α2基因R227Q突变结果 1：正常对照；2～5：先天性尿道下裂患儿，其中2，3为R227Q突变纯合子，4为杂合子，5无此突变；N：正常管；M：突变管
Fig 1 Detection of SRD5α2 gene R227Q mutation by using ARMS Lane 1:control;lanes 2-5：congenital hypospadias,2,3:homozygote,4:heterozygote,5:no R227Q mutation;N:normal;M:mutation
2.4 23例先天性尿道下裂患者检测结果 发现3例存在R227Q突变，其中2例为纯合子，1例为杂合子。其结果与DNA测序完全吻合(图2)。
图2 SRD5α2基因R227Q突变DNA测序结果 *227密码子第2碱基发生G→A突变(R227Q)
, 百拇医药
Fig 2 DNA sequence analysis of the R227Q mutation of SRD5α2 gene *G→A transition in second base of 227 code(R227Q)
3 讨论
突变扩增系统(ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等[4]首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测，我室也已建立了β地中海贫血常见突变的ARMS法[5]。
ARMS成功的关键在于引物设计和PCR扩增条件的严谨性。为增加该方法的特异性，在引物设计中，我们除了在3′末端碱基不同外，根据突变性质及特点，参照国内外研究结果，对距3′末端上游第5碱基处亦进行了改动。所设计的引物，经对患者检测得到了与测序结果完全一致的结果，证明了其可靠性及准确性。
, 百拇医药
该方法简便、快速、可靠，并可同时鉴别正常、R227Q突变纯合子和杂合子，有利于推广应用。
*通信联系人
参考文献
1 Labrie F,Sugimoto Y,Luu-The V,et al.Structure of human type Ⅱ 5α-reductase gene.Endocrinology,1992,131(3)∶1571-1573.
2 Thigpen A,Davis DL,Milatovich A,et al.Molecular genetics of steroid 5α-reductase 2 deficiency.J Clin lnvest,1992,90(September)∶799-809.
3 Andersson S,Berman DM,Jenkins EP,et al.Deletion of 5α-reductase 2 gene in male pseudohermaphroditism.Nature,1991,354(14)∶159-161.
4 Newton CR,Graham A,Hentinstall LE,et al. Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acids Res,1989,17(7)∶2503-2516.
5 杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等.用ARMS法检测β-地贫CD654-2突变.中华血液学杂志，1998，19(10)∶544-545.
(收稿：1999-01-06 修回：1999-04-13), http://www.100md.com(光炜 周李 曾瑞萍* 杜传书)
单位：光炜 曾瑞萍 杜伟书 510089 广州，中山医科大学医学遗传学教研室；周李 第一附属医院小儿外科
关键词：5α2还原酶基因；突变；突变扩增系统；尿道下裂
中华医学遗传学杂志990613 【摘要】 目的 建立一种简易、准确的2型5α还原酶(SRD5α2)基因分析方法。方法 采用突变扩增系统，对23例先天性尿道下裂患儿及正常标本进行SRD5α2基因R227Q突变分析，对阳性者进行DNA测序证实。结果 23例先天性尿道下裂患儿中，3例为SRD5α2基因R227Q突变阳性(2例为突变纯合子，1例为杂合子)，与测序结果一致；其余及正常对照均为阴性。结论 此法简单、快速、准确、易于推广，可作为先天性尿道下裂中SRD5α2基因突变的筛查方法。
Detection of R227Q mutation of SRD5α2 gene by amplification refractory mutation system
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GUANG Wei,ZHOU Li,ZENG Ruiping*,DU Chuanshu.*Department of Medical Genetics,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089 P.R.China.
【Abstract】 Objective To set up a simple method for identifying the mutation of R227Q of SRD5α2 gene which is one of the most common mutations in congenital hypospadias in China.Methods The amplification refractory mutation system(ARMS) was employed in detecting the SRD5α2 gene R227Q mutation in congenital hypospadias confirmed by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism and DNA sequencing.Results The ARMS was successfully applied to the detection of the R227Q mutation of SRD5α2 gene.Three out of 23 congenital hypospadias were positive for R227Q mutation.The mutations determined by ARMS were in full agreement with those obtained by the DNA sequencing.Conclusion This is a simple,rapid and accurate method.It can be used for detecting the SRD5α2 gene R227Q mutation in congenital hypospadias and male pseudohermaphroditism.
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【Key words】 SRD5α2 gene Mutation Amplification refractory mutation system Hypospadias
研究表明，胚胎期男性外生殖器的发育与睾丸内雄激素(睾酮和双氢睾酮)水平密切相关。双氢睾酮生物学效应是睾酮的50倍，是促使胚胎期男性外生殖器发育的主要雄激素。5α还原酶催化睾酮还原成双氢睾酮，如发生遗传缺陷将导致不同程度男性外生殖器发育障碍，其中2型还原酶与生殖器发育关系密切。现已用5α还原酶抑制剂建立了尿道下裂动物模型，并证实部分男性假两性畸形患者有5α还原酶活性的降低[1-3]。为探讨小儿常见的先天性尿道下裂与2型5α还原酶(SRD5α2)基因突变的关系，我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)结合DNA测序方法，在23例尿道下裂患儿中，发现3例为SRD5α2基因R227Q突变纯合子或杂合子(另文发表)，提示该突变为中国人尿道下裂SRD5α2基因的常见突变。为简便、快速和准确地筛查这一突变，我们根据突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)原理，设计建立了SRD5α2基因R227Q突变的检测方法，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 研究对象及DNA提取 1996年8月～1998年2月在我校第一附属医院小儿外科住院的23例尿道下裂患儿及正常对照，抽取外周血，常规提取DNA。
1.2 引物设计 上游共同引物(SRE4A)：CGAAGT-CCGATGCAATGATTGACCTTCCGATTCTT；下游正常引物(SR227N)：TACCTATGGTGGTGAAA-TGCTC；下游突变引物(SR227M)：TACCTATGGT-GGTGAAATGCTT。内对照引物：上游：CAGGATC-CGAACAGTGAATCCTAACCTTTCCTCCC，下游：CGAAGCTTCATTGTTAGCTGGGAAGTAGGTG-AGAA。
1.3 PCR反应 每一标本分别取2管进行。每管反应体积30μl，含基因组DNA 0.5～1μg，10×缓冲液3.0μl，dNTPs(2mmol/L)3.0μl,各管均为含2对引物的双重PCR。其中一对扩增SRD5α2基因第2外显子引物作为内对照，另外一对引物，在突变管中为SRE4A和SR227M，在正常管中为SRE4A和SR227N，各对引物均为20pmol/L。PCR条件：经97℃变性7分钟后，加Taq酶2U，94℃40秒，60℃50秒，72℃60秒，共35个循环后，72℃延伸5分钟。
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1.4 结果观察 1.5%琼脂糖，0.5×TBE电泳40分钟，溴乙啶染色，紫外灯下观察并照相保存结果。
2 结果
2.1 采用双盲法对23例先天性尿道下裂患儿进行ARMS法突变筛查，检测者在检测前对患儿DNA测序结果完全不知。
2.2 正常对照及无R227Q突变的尿道下裂患儿 在正常反应管中可见两条区带，一条为263bp(内对照带)，另一条为199bp的正常带图1。而突变反应管中则只有263bp对照带。
2.3 存在R227Q突变的尿道下裂患儿(图1) R227Q突变纯合子在正常反应管中只有263bp内对照带，突变反应管中则可见263bp和199bp两条区带；而突变杂合子在正常与突变反应管中均可见263bp和199bp两条区带。
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图1 ARMS法检测SRD5α2基因R227Q突变结果 1：正常对照；2～5：先天性尿道下裂患儿，其中2，3为R227Q突变纯合子，4为杂合子，5无此突变；N：正常管；M：突变管
Fig 1 Detection of SRD5α2 gene R227Q mutation by using ARMS Lane 1:control;lanes 2-5：congenital hypospadias,2,3:homozygote,4:heterozygote,5:no R227Q mutation;N:normal;M:mutation
2.4 23例先天性尿道下裂患者检测结果 发现3例存在R227Q突变，其中2例为纯合子，1例为杂合子。其结果与DNA测序完全吻合(图2)。
图2 SRD5α2基因R227Q突变DNA测序结果 *227密码子第2碱基发生G→A突变(R227Q)
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Fig 2 DNA sequence analysis of the R227Q mutation of SRD5α2 gene *G→A transition in second base of 227 code(R227Q)
3 讨论
突变扩增系统(ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等[4]首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测，我室也已建立了β地中海贫血常见突变的ARMS法[5]。
ARMS成功的关键在于引物设计和PCR扩增条件的严谨性。为增加该方法的特异性，在引物设计中，我们除了在3′末端碱基不同外，根据突变性质及特点，参照国内外研究结果，对距3′末端上游第5碱基处亦进行了改动。所设计的引物，经对患者检测得到了与测序结果完全一致的结果，证明了其可靠性及准确性。
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该方法简便、快速、可靠，并可同时鉴别正常、R227Q突变纯合子和杂合子，有利于推广应用。
*通信联系人
参考文献
1 Labrie F,Sugimoto Y,Luu-The V,et al.Structure of human type Ⅱ 5α-reductase gene.Endocrinology,1992,131(3)∶1571-1573.
2 Thigpen A,Davis DL,Milatovich A,et al.Molecular genetics of steroid 5α-reductase 2 deficiency.J Clin lnvest,1992,90(September)∶799-809.
3 Andersson S,Berman DM,Jenkins EP,et al.Deletion of 5α-reductase 2 gene in male pseudohermaphroditism.Nature,1991,354(14)∶159-161.
4 Newton CR,Graham A,Hentinstall LE,et al. Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acids Res,1989,17(7)∶2503-2516.
5 杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等.用ARMS法检测β-地贫CD654-2突变.中华血液学杂志，1998，19(10)∶544-545.
(收稿：1999-01-06 修回：1999-04-13), http://www.100md.com(光炜 周李 曾瑞萍* 杜传书)
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