云南省两种G6PD基因突变的检测
作者：杨昭庆 褚嘉佑 许绍斌 洪坤学 卫灿东
单位：；杨昭庆(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；褚嘉佑(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；许绍斌(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；洪坤学(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；卫灿东(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)
关键词：
红细胞葡萄糖 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)，是磷酸戊糖旁路中产生还原型辅酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)的关键酶。G6PD的缺陷可导致蚕豆病、药物性溶血、新生儿高胆红素血症乃至核黄疸、感染性溶血及非球形细胞溶血性贫血等，G6PD缺乏症是一种常见的人类遗传性酶缺陷疾病。G6PD基因突变是导致G6PD缺乏症的主要分子基础，目前已发现DNA突变类型78种，其中在中国人中发现了13种[1]。云南是G6PD缺乏症高发区，部分少数民族地区该病发生率达16.3%[2]。我们采用扩增不应突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)，在60例云南籍G6PD缺陷者中检测G1376T和G1388A这两种中国人中最常见的突变类型，探讨云南省G6PD基因突变类型的分布特点，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 60例(男43例，女17例)均为医院门诊或住院的无亲缘关系的患者，来源于云南省西双版纳自治州、德宏傣族景颇族自治州、昆明地区和玉溪地区。其中有傣族14例，汉族46例。均经酶活性检测或四氮唑蓝定量法分析，临床诊断为G6PD缺陷。
1.2 基因组DNA制备 取外周静脉血5 ml，常规分离白细胞，蛋白酶K消化后经酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
1.3 PCR引物 参考文献[3]合成，引物序列及扩增片段长度见表1。
表1 ARMS法检测G6PD基因突变的引物序列及扩增片段长度
突变
引物
, 百拇医药
序列(5′-3′)
扩增片段长
度(碱基对)
G1376T
1376M
TGAAAATACGCCAGGGCCTCAA
345
L
GACCTGACCTACGGCAACAGATAC
G1388A
1388M
GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT
, 百拇医药
361
(内对照)
4F
TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG
192
4R
CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC
注：L为1376M和1388M共用的上游引物，有下划线者为等位基因特异性错配碱基
1.4 PCR扩增 反应总体积为25 μl，其中包括基因组DNA2 μl(约200 ng)，10×反应缓冲液(100 mmol/L Tris HCl, pH8.8, 500 mmol/L KCl, 0.8%乙基苯基聚乙二醇)2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 2.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，20 μmol/L 4F、4R、L、1388M(或1376M)各1 μl， 4 U/μl Taq DNA多聚酶0.5 μl。PCR在DNA热循环仪中进行，反应混合物经95℃ 4 min变性后，以94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 50 s循环25次，最后72℃延伸10 min。
, 百拇医药
1.5 PCR产物分析 取PCR产物10 μl与上样缓冲液(0.05%溴酚蓝，0.05%的二甲苯青，30%的甘油)混合上样，2%的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳后凝胶经0.5 μg/ml溴化乙锭染色，于紫外透射仪上观察并摄影。
2 结果
病例DNA样品经PCR扩增后电泳结果见图1。出现345 bp特异性扩增和192 bp内对照扩增片段者，说明该DNA样品中存在G1376 T突变。同理，出现361 bp片段和192 bp片段的样品存在G1388A突变。仅出现192 bp内对照扩增片段的，判断为上述两种突变阴性结果。采用这样的分析方法，60例被检样品中，共检出G1376T 7例(11.7%)，3例为傣族，4例为汉族；G1388A 17例(28.3%)，6例为傣族，11例为汉族。其中有2例汉族具有G1376T/G1388A复合突变，这与用错配碱基PCR/限制性酶切法检测所得的结果相同[4]。
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图1 ARMS法检测两种G6PD基因突变电泳结果 M：DNA分子量标准ΦX174/Hae Ⅲ；1：G1388A突变；2：G1376T突变；3：内对照扩增片段
3 讨论
ARMS又称等位基因特异性扩增(allele-specific amplification, ASA)是目前用于检测已知点突变的一种常用方法。其基本原理是在PCR扩增的引物设计中，在引物3′端针对已知突变引入一错配碱基，使之只能扩增突变型或野生型基因。ARMS法已成功地应用于多种疾病的突变检测，任晓琴等[3]首次将其成功应用于G6PD基因突变的检测，并设计内对照引物以利于消除假阴性反应。我们的研究结果也表明，用ARMS法检测两种常见G6PD基因突变，无需同位素，也无需使用限制性内切酶，具有简便、快速、可靠的优点，尤其适用于大批量样品的快速筛查。
G1376T和G1388A型突变是中国人G6PD缺陷最常见的两种基因突变类型[5]。目前对云南省多个地区G6PD基因突变的研究尚不多见。本组研究的60例样品为较大的一组云南省G6PD缺乏症病例，结果证实了云南昆明、玉溪、德宏傣族景颇族自治州、西双版纳傣族自治州等多个地区存在在G1376T和G1388A型G6PD基因突变。
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我们的研究还证实在云南省存在有G1376T/G1388A复合突变类型。文献[4]表明傣族中有G1388A型突变存在。除G1388A外，我们在云南省不同地区的傣族中，还发现有G1376T型突变。
文献[6，7]表明G1376T和G1388A突变类型在台湾、广东分别占71.3%和63.7%，在与云南相邻的广西为41.1%[8]。在本组病例中，G1376T和G1388A两种突变共占40%，提示这两种突变可能也是云南常见的突变类型。国内其他G6PD高发区均以G1376T型突变最为多见[6-8]，而本组结果显示云南省的G1388A型突变明显多于G1376T型突变，与国内其它地区有所不同。合并何永蜀[4]的29例云南籍病例研究结果，G1388A型突变分布比例为40.4%(36/89)，G1376T型为9%(8/89)，G1388A多于G1 376T型的现象更为显著，表明云南省G6PD基因突变类型分布比例有自身的特点，G1388A型突变应为最常见突变。这一现象可能与云南省交通不便的地理环境、多个民族隔离群体分布有关。在中国不同地区、民族中呈现不同的G1376T和G1388A突变分布特点，表明G6PD突变具有较高的遗传多态性。同时，老挝、日本等亚洲国家也发现这两种突变[9]，结合最新的遗传多样性研究资料[10]，提示亚洲各民族群体在进化上可能有共同渊源。
, 百拇医药
云南省是G6PD缺陷症的高发地区，研究G6PD基因突变的类型及分布特点，可为进一步探讨该病的发病机理、临床诊断、遗传和优生、少数民族源流及迁移和进化提供更多的依据。
基金项目：国家自然科学基金重大项目(39993420)
参考文献
[1]宋力.中国人群葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的分析与进展.中国优生与遗传杂志，1998，6(5)∶119-121.
[2]张铀，褚嘉佑，何勤，等.应用G6PD/6PGD比值法检测云南勐腊县6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因频率.中国优生与遗传杂志，1995，3(4)∶25-26.
[3]任晓琴，杜传书，陈路明，等.应用ARMS法检测中国人中两种常见G6PD基因突变型.中山医科大学学报，1997，18(4)∶319.
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[4]何永蜀，杜传书，蒋玮莹，等.云南省几个民族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变分析.中华血液学杂志，1997，18(4)∶193-196.
[5]Chiu DTY, Zuo L, Chao L, et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency in patients of Chinese descent and identification of new base substitutions in the huamn G6PD gene. Blood, 1993, 81(8)∶2150-2154.
[6]Huang CS, Huang KL, Huang MJ, et al. Neonatal jaundice and molecular mutations in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient newborn infants. Am J Hematol, 1996, 51(1)∶19-25.
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[7]唐东江，马燮琴，宋诚燕，等.干血纸片法用于广东人G6PD基因突变筛查研究.中华血液学杂志，1998，19(4)∶189-191.
[8]谢建生，龙桂芳，唐智宁，等.广西地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变研究.中华医学遗传学杂志，1998，15(3)∶151-154.
[9]Beutler E. G6PD:Population genetics and clinical manifestations. Blood Rev, 1996, 10(1)∶45-52.
[10]Chu JY, Huang W, Kuang SQ, et al. Genetic relationship of populations in China. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(20)∶11763-11768.
收稿日期：1999-03-21, 百拇医药
单位：；杨昭庆(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；褚嘉佑(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；许绍斌(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；洪坤学(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)；卫灿东(650118 昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所)
关键词：
红细胞葡萄糖 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)，是磷酸戊糖旁路中产生还原型辅酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)的关键酶。G6PD的缺陷可导致蚕豆病、药物性溶血、新生儿高胆红素血症乃至核黄疸、感染性溶血及非球形细胞溶血性贫血等，G6PD缺乏症是一种常见的人类遗传性酶缺陷疾病。G6PD基因突变是导致G6PD缺乏症的主要分子基础，目前已发现DNA突变类型78种，其中在中国人中发现了13种[1]。云南是G6PD缺乏症高发区，部分少数民族地区该病发生率达16.3%[2]。我们采用扩增不应突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)，在60例云南籍G6PD缺陷者中检测G1376T和G1388A这两种中国人中最常见的突变类型，探讨云南省G6PD基因突变类型的分布特点，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 60例(男43例，女17例)均为医院门诊或住院的无亲缘关系的患者，来源于云南省西双版纳自治州、德宏傣族景颇族自治州、昆明地区和玉溪地区。其中有傣族14例，汉族46例。均经酶活性检测或四氮唑蓝定量法分析，临床诊断为G6PD缺陷。
1.2 基因组DNA制备 取外周静脉血5 ml，常规分离白细胞，蛋白酶K消化后经酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
1.3 PCR引物 参考文献[3]合成，引物序列及扩增片段长度见表1。
表1 ARMS法检测G6PD基因突变的引物序列及扩增片段长度
突变
引物
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序列(5′-3′)
扩增片段长
度(碱基对)
G1376T
1376M
TGAAAATACGCCAGGGCCTCAA
345
L
GACCTGACCTACGGCAACAGATAC
G1388A
1388M
GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT
, 百拇医药
361
(内对照)
4F
TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG
192
4R
CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC
注：L为1376M和1388M共用的上游引物，有下划线者为等位基因特异性错配碱基
1.4 PCR扩增 反应总体积为25 μl，其中包括基因组DNA2 μl(约200 ng)，10×反应缓冲液(100 mmol/L Tris HCl, pH8.8, 500 mmol/L KCl, 0.8%乙基苯基聚乙二醇)2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 2.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，20 μmol/L 4F、4R、L、1388M(或1376M)各1 μl， 4 U/μl Taq DNA多聚酶0.5 μl。PCR在DNA热循环仪中进行，反应混合物经95℃ 4 min变性后，以94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 50 s循环25次，最后72℃延伸10 min。
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1.5 PCR产物分析 取PCR产物10 μl与上样缓冲液(0.05%溴酚蓝，0.05%的二甲苯青，30%的甘油)混合上样，2%的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳后凝胶经0.5 μg/ml溴化乙锭染色，于紫外透射仪上观察并摄影。
2 结果
病例DNA样品经PCR扩增后电泳结果见图1。出现345 bp特异性扩增和192 bp内对照扩增片段者，说明该DNA样品中存在G1376 T突变。同理，出现361 bp片段和192 bp片段的样品存在G1388A突变。仅出现192 bp内对照扩增片段的，判断为上述两种突变阴性结果。采用这样的分析方法，60例被检样品中，共检出G1376T 7例(11.7%)，3例为傣族，4例为汉族；G1388A 17例(28.3%)，6例为傣族，11例为汉族。其中有2例汉族具有G1376T/G1388A复合突变，这与用错配碱基PCR/限制性酶切法检测所得的结果相同[4]。
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图1 ARMS法检测两种G6PD基因突变电泳结果 M：DNA分子量标准ΦX174/Hae Ⅲ；1：G1388A突变；2：G1376T突变；3：内对照扩增片段
3 讨论
ARMS又称等位基因特异性扩增(allele-specific amplification, ASA)是目前用于检测已知点突变的一种常用方法。其基本原理是在PCR扩增的引物设计中，在引物3′端针对已知突变引入一错配碱基，使之只能扩增突变型或野生型基因。ARMS法已成功地应用于多种疾病的突变检测，任晓琴等[3]首次将其成功应用于G6PD基因突变的检测，并设计内对照引物以利于消除假阴性反应。我们的研究结果也表明，用ARMS法检测两种常见G6PD基因突变，无需同位素，也无需使用限制性内切酶，具有简便、快速、可靠的优点，尤其适用于大批量样品的快速筛查。
G1376T和G1388A型突变是中国人G6PD缺陷最常见的两种基因突变类型[5]。目前对云南省多个地区G6PD基因突变的研究尚不多见。本组研究的60例样品为较大的一组云南省G6PD缺乏症病例，结果证实了云南昆明、玉溪、德宏傣族景颇族自治州、西双版纳傣族自治州等多个地区存在在G1376T和G1388A型G6PD基因突变。
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我们的研究还证实在云南省存在有G1376T/G1388A复合突变类型。文献[4]表明傣族中有G1388A型突变存在。除G1388A外，我们在云南省不同地区的傣族中，还发现有G1376T型突变。
文献[6，7]表明G1376T和G1388A突变类型在台湾、广东分别占71.3%和63.7%，在与云南相邻的广西为41.1%[8]。在本组病例中，G1376T和G1388A两种突变共占40%，提示这两种突变可能也是云南常见的突变类型。国内其他G6PD高发区均以G1376T型突变最为多见[6-8]，而本组结果显示云南省的G1388A型突变明显多于G1376T型突变，与国内其它地区有所不同。合并何永蜀[4]的29例云南籍病例研究结果，G1388A型突变分布比例为40.4%(36/89)，G1376T型为9%(8/89)，G1388A多于G1 376T型的现象更为显著，表明云南省G6PD基因突变类型分布比例有自身的特点，G1388A型突变应为最常见突变。这一现象可能与云南省交通不便的地理环境、多个民族隔离群体分布有关。在中国不同地区、民族中呈现不同的G1376T和G1388A突变分布特点，表明G6PD突变具有较高的遗传多态性。同时，老挝、日本等亚洲国家也发现这两种突变[9]，结合最新的遗传多样性研究资料[10]，提示亚洲各民族群体在进化上可能有共同渊源。
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云南省是G6PD缺陷症的高发地区，研究G6PD基因突变的类型及分布特点，可为进一步探讨该病的发病机理、临床诊断、遗传和优生、少数民族源流及迁移和进化提供更多的依据。
基金项目：国家自然科学基金重大项目(39993420)
参考文献
[1]宋力.中国人群葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的分析与进展.中国优生与遗传杂志，1998，6(5)∶119-121.
[2]张铀，褚嘉佑，何勤，等.应用G6PD/6PGD比值法检测云南勐腊县6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因频率.中国优生与遗传杂志，1995，3(4)∶25-26.
[3]任晓琴，杜传书，陈路明，等.应用ARMS法检测中国人中两种常见G6PD基因突变型.中山医科大学学报，1997，18(4)∶319.
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[4]何永蜀，杜传书，蒋玮莹，等.云南省几个民族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变分析.中华血液学杂志，1997，18(4)∶193-196.
[5]Chiu DTY, Zuo L, Chao L, et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency in patients of Chinese descent and identification of new base substitutions in the huamn G6PD gene. Blood, 1993, 81(8)∶2150-2154.
[6]Huang CS, Huang KL, Huang MJ, et al. Neonatal jaundice and molecular mutations in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient newborn infants. Am J Hematol, 1996, 51(1)∶19-25.
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[7]唐东江，马燮琴，宋诚燕，等.干血纸片法用于广东人G6PD基因突变筛查研究.中华血液学杂志，1998，19(4)∶189-191.
[8]谢建生，龙桂芳，唐智宁，等.广西地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变研究.中华医学遗传学杂志，1998，15(3)∶151-154.
[9]Beutler E. G6PD:Population genetics and clinical manifestations. Blood Rev, 1996, 10(1)∶45-52.
[10]Chu JY, Huang W, Kuang SQ, et al. Genetic relationship of populations in China. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(20)∶11763-11768.
收稿日期：1999-03-21, 百拇医药