胃癌p53基因突变与微卫星DNA不稳定性关系的研究
作者：郭文 张亚历 吴保平 张立力 周殿元
单位：郭文(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；张亚历(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；吴保平(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；张立力(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；周殿元(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
关键词：胃癌；p53基因突变；微卫星DNA不稳定性；超声内镜
中华医学遗传学杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS 2000 Vol 【摘要】 目的 探讨术前不同分期的胃癌p53基因突变与微卫星DNA不稳定性(microsatellite instability, MSI)的变化及其相互关系。方法 应用超声内境(endoscopic ultrasonography,EUS)对73例胃癌患者行术前分期，同时采用银染PCR-SSCP方法检测内镜活检组织标本p53基因突变及MSI。结果 p53基因总突变率为54.8%；T3期(64.3%)和T4期(67.9%)突变率明显高于T1(0)或T2期(25.0%)病例(P<0.05)；有淋巴结转移的病例突变率为67.6%，亦明显高于无转移时的41.7%(P<0.05)。MSI总检出率为37.0%；与癌的浸润深度无关，T1～T4期癌MSI的检出率分别为40.0%、33.3%、39.3%和34.5%(P>0.05)；但有淋巴结转移组MSI的检出率为51.4%，明显高于无转移的22.2%(P<0.05)。p53基因突变组，MSI检出率(42.5%)较无突变组(30.3%)有增高趋势，但两者无显著性差异(P>0.05)。结论 p53基因改变与MSI可能分别代表了胃粘膜癌变过程中的不同分子病理学机理，两者均不同程度地反映胃癌的细胞生物学恶性行为，对临床分析胃癌的预后可能有参考意义。
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Study on the p53 gene mutation and microsatellite instability of gastric carcinoma
GUO Wen ZHANG Yali WU Baoping ZHANG Lili ZHOU Dianyuan
(PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, First Medical University of PLA, Guangzhou, Guangdong, 510515 P.R. China)
【Abstract】 Objective To observe the relationship between p53 gene mutation and microsatellite instability (MSI) of the preoperative staging of gastric carcinoma by endoscopic ultrasonography(EUS). Methods A total of 73 cases of gastric carcinoma were taken for the preoperative staging with EUS.Silver staining PCR-SSCP method was used to detect mutations in exons 5,6,7,8 of p53 gene and MSI at 4 loci on chromosomes 2,5,17 in the 73 paraffin-embedded biospy specimens, and the relationship between them was studied further.Results The overall mutated rate of p53 gene was 54.8%, with 6.8%, 15.1%, 19.2% and 13.7% in exons 5 to 8, respectively. Analysis of the relation of the mutation with the preoperative staging by EUS showed that it was significantly higher in T3(64.3%) and T4(67.9%) than in T1(0) or T2(25.0%)(P<0.05), and it was 67.6% in cases with lymph node metastasis, which was significantly higher than that without metastasis (41.7%)(P<0.05). The overall detective rate of MSI was 37.0%. The detective rate of MSI had no relation with the depth of invasion, which was 40.0%, 33.3%,39.3% and 34.5% at T1 to T4 stages(P<0.05),respectively, but it was significantly higher in cases with lymph node metastasis(51.4%) than those without metastasis(22.2%)(P<0.05).Although the detective rate of MSI showed an increasing trend in the mutated cases of p53 gene as compared with the no mutation cases,there was no relationship between MSI and p53 gene mutation (P<0.05).Conclusion These results suggest that the gene mutation of p53 and MSI may represent the different mechanisms of carcinogenesis.They can reflect the cytobiologic malignant behavior of gastric carcinoma in varying degrees, which may be of reference significance in analysing the prognosis of the patients in clinics.
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【Key words】 gastric carcinoma; p53 gene mutation; microsatellite instability; endoscopic ultrasonography
从分子水平探讨胃癌发病机理是近几年研究的一个热点。现已表明，胃癌的发生发展与抑癌基因有关，其中p53基因突变是胃癌最常见的遗传学改变之一[1，2]。微卫星DNA不稳定性(microsatellite insta-bility,MSI)与肿瘤及一些癌前病变密切相关。与常见的癌基因与抑癌基因改变不同，MSI主要表现为短核苷酸重复序列如(CA)n、(AT)n等重复次数的增多或减少，因此，MSI被认为是细胞癌变的新机理[3，4]。然而，在胃癌发生与进展中，基因之间变化的规律所知甚少，尤其是对术前粘膜活组织的检测是否能反映其中规律，尚未见深入研究。基于超声内镜(endoscopic ultrasonography,EUS)术前对肿瘤的分期，我们采用银染PCR-SSCP技术，探讨胃癌p53基因突变与微卫星DNA不稳定性的变化及其相互关系。
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1 材料与方法
1.1 临床病例及EUS检查 73例胃癌患者，其中男41例，女32例，男女之比为1.28∶1。年龄26～67岁，平均51.4岁。采用日本Olympus EU-M20型超声胃镜，探头频率为7.5MHz和12MHz，术前行EUS检查。检查时先用普通胃镜对上消化道进行全面观察，了解病变部位及表面形态改变，同时活检粘膜病变及正常组织作石蜡包埋切片，以做HE染色和组织消化，行PCR-SSCP检测p53基因突变和MSI。然后再用超声胃镜以水囊法和/或水充盈法检查病变。根据对癌浸润深度和淋巴结转移情况的判断进行TN分期[5]。所有病例于2周内手术，作术后病理TN分期对照。
1.2 PCR反应 按文献[6]之方法A，从石蜡组织切片中提取DNA模板。
p53基因第5～8外显子引物参考文献[2]设计，由加拿大真达基因公司协助合成。其序列如下：(1)第5外显子(产物为245bp)。PU5：5′-GACTTTCAACT-GTCTC-3′，PD5：5′-CTGGGACCCTGGGCAAC-3′；(2)第6外显子(产物为184bp)PU6：5′-GAGACG-ACAGGGCTGGTT-3′，PD6：5′-CCACTGACAAC-CACCCTT-3′；(3)第7外显子(产物为188bp)，PU7：5′-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3′，PD7：5′-AA-GTGGCTCCTGACCTGGAG-3′；(4)第8外显子(产物为214bp)，PU8：5′-TGGTAATCTACTGGGAC-G-3′，PD8：5′-CTCGCTTAGTGCTCCCTGG-3′。
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MIN的引物参照文献[4]设计，序列如下：D2S123：(1)5′-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3′，(2)5′-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3′，扩增片段为197～227bp。D5S107：(1)5′-GATCCACTTTA-ACCCAAATAC-3′，(2)5′-GGCATCAACTTGAA-CAGCAT-3′。扩增片段为133～155bp。D17S250(1)5′-GGA-AGAATCAAATAGACAAT-3′，(2)5′-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3′。扩增片段为53～169bp。D2S119：(1)5′-CTTGGGGAAC-AGAGGTCATT-3′，(2)5′-GAGAATCCCTCAA-TTTCTTTGGA-3′。扩增片段为214～232bp。
25 μl PCR反应体系中加入无菌水10.5 μl，10×扩增缓冲剂2.5 μl，4种dNTP混合物(10 mmol/L)1 μl，引物Ⅰ、Ⅱ(100 ng/μl)各2 μl，模板DNA 4 μl。于97℃加热8 min使DNA完全变性，将3 μl Taq酶(0.75U)加入处于80℃的反应混合液中。PCR扩增：94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，依次进行35个循环，72℃ 5 min。
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1.3 SSCP分析 取上述PCR产物6 μl加入18 μl测序加样缓冲液(含98%去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA、pH8.0、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝)混匀于97℃变性8 min，置40%乙醇碎冰中冰浴5 min，再快速加样于预冷4℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5%的甘油，丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1)上。双链对照标本是将6 μl PCR产物加入2 μl上样缓冲液中混匀，不作变性处理，直接上样。13℃，400V恒压电泳4 h。电泳缓冲液为0.5×TBE。
1.4 银染 取下凝胶，按文献[7]银染。
2 结果
2.1 胃癌EUS检查与分期 EUS能清晰显示胃壁的层次结构。胃癌的EUS影像表现为不规则的低回声肿块影，根据正常胃壁结构层次的破坏情况可对其进行分期。其中T1期癌(浸润粘膜或粘膜下层)5例，T2期癌(浸润固有肌层)12例，T3期癌(浸润至浆膜层)28例，T4期癌(浸润至邻近组织)28例。根据EUS检查有无探及邻近淋巴结肿大情况，可将病例分为淋巴结转移(N+)与非转移(N0)两组，其中N+者37例，N0者36例。对照术后病理检查，EUS对T分期的准确率为84.9%，N分期为83.6%。
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2.2 胃癌p53基因突变检测 应用银染PCR-SSCP技术检测73例胃癌标本中p53基因第5、6、7和8外显子的突变情况，通过与自身的正常胃粘膜组织对照，发现40例存在p53基因点突变，出现异常移动的单链DNA电泳带(图1)，突变率为54.8%。
外显子5～8出现异常电泳带的频率分别为：5例(6.8%)、11例(15.1%)、14例(19.2%)和10例(13.7%)。分析其突变与术前超声内镜分期的关系(表1)，可见癌细胞浸润浆膜层后(T3或T4期)，突变率明显高于癌细胞限制于固有肌层以内(T1或T2期)者(P<0.05)，但T3与T4或T1与T2期之间p53基因突变并无明显差别。另外，伴淋巴转移组突变率明显高于无转移组(P<0.05)。
2.3 胃癌MSI检测 应用4对分别代表了第2、5、17号染色体不同位点的引物，在所检测的73例胃癌中，27例出现1个或多个染色体位点的不稳定性(图2)，检出率为37.0%。分析MSI与术前EUS分期的关系(表1)，可见其与胃癌的浸润深度无关。但在伴淋巴结转移的病例MSI检出率高达51.4%，明显高于无转移组的22.2%。
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图1 银染PCR-SSCP检测p53基因突变 A、B、C、D分别代表第5、6、7、8外显子突变；与肿瘤邻近正常组织标本相比，肿瘤组织(T)出现p53突变时有DNA单链泳动带的位移，出现额外的电泳带(病例37T、66T、57T、45T箭头所示)；ds:双链DNA，银染观察
Fig 1 SSCP analysis of p53 mutations In exons 5(A),6(B),7(C) and 8(D):p53 mutations lead to mobility shifts of the single strand DNA in cases 37T,66T,57T and 45T (arrowheads) as evidenced by additional banding patterns in comparison with non-mutated, adjacent normal tissue DNA (N), ds is regarded as the double strand DNA. The results are visualized with the silver staining technique
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图2 银染PCR-SSCP检测正常和肿瘤组织DNA微卫星DNA不稳定性 A、B、C、D分别代表D2S119、D5S107、D2S123和D17S250位点MSI情况；病例11T、57T、9T和25T(箭头所示)肿瘤组织与正常对照组比较出现了DNA单链泳动带的位移；N:正常组织；T：肿瘤组织
Fig 2 SSCP analysis of MSI in paired normal (N) and tumor (T) DNA at loci D2S119 (A), D5S107(B),D2S123(C) and D17S250(D) gastric cancer. MSI leads to mobility shifts of the single strand DNA in cases 11T, 57T,9T and 25T(arrowheads) in comparison with non-mutated, adjacent normal tissue DNA(N)
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表1 不同EUS分期的胃癌p53基因突变和MSI频率
Table 1 Frequency of p53 gene mutation and MSI in different EUS stagings of gastric carcinomas
EUS staging
(EUS分期)
Depth of invasion or metastasis
(浸润深度或转移)
n
(例数)
p53 gene mutation
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(p53基因突变)
MSI
(微卫星DNA不稳定性)
n
%
n
%
T1
Mucosaor submucosa
5
0
0
2
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40.0
T2
Muscularis propria
12
3
25.0
4
33.3
T3
Serosa
28
18
64.3*
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11
39.3
T4
Adjacent structures
28
19
67.9*
10
35.7
N0
Nolymph node metastasis
36
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15
41.7
8
22.2
N+
Lymph node metastasis
37
25
67.6**
19
51.4*
*Significantly different from T1 or T2(P<0.05)(与T1或T2比较有显著性差异)；**Significantly different from N0(P<0.05)(与N0比较有显著性差异)；mucosa or submucosa(粘膜或粘膜下)；muscularis propria(固有肌层)；serosa(浆膜层)；adjacent structures(邻近组织)；no lymph node metastasis(无淋巴结转移)；lymph node metastasis(伴淋巴结转移)
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2.4 p53基因突变与MSI的关系 分析p53基因突变与MSI的关系(表2)，表明p53基因突变组，MSI检出率有增高趋势，但经统计学处理两者无明显的相关性(P>0.05)。
表2 胃癌p53基因突变与MSI的关系
Table 2 Relationship between p53 gene mutation and MSI in gastric carcinomas
p53 gene mutation
(p53突变)
n
(例数)
MSI(%)
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Positive(阳性)
Negative(阴性)
Positive(阳性)
40
17(42.5)
23(57.5)
Negative(阴性)
33
10(30.3)
23(69.7)
3 讨论
临床对肿瘤的检查已不满足于单纯的术前诊断。由于正确的癌肿分期对决策治疗方案和评价预后有重要的指导意义，因此，术前癌肿分期已成为现代医学重要的诊断模式。在胃癌的术前诊断中，EUS由于能将超声探头直接经内镜检查送达病变部位对病变进行超声扫描，明显优于现有的其他检查，且与术后病理对照也具有较高的一致性，因此已在临床逐步推广应用。我们对73例胃癌术前EUS分期准确性，T分期达84.9%、N分期达83.6%，与文献报道相符。
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p53基因是一种肿瘤抑制基因。已证实，p53基因突变或丢失与人类胃癌的发生发展相关。这种基因水平的改变主要发生在4个进化上高度保守区，即外显子5～8。既往检测基因突变的方法为序列分析，但该法费时、昂贵，尤其不适用于对大量标本的研究及基层实验室开展。我们应用银染PCR-SSCP技术检测了73例胃癌p53基因第5、6、7和8外显子的突变情况，发现40例存在基因突变，突变率为54.8%。同时显示，p53基因突变与肿瘤浸润深度及淋巴结转移状况相关。提示胃癌中普遍存在p53基因突变，并推测p53基因突变与胃癌的发生演化、转移和预后有关。
微卫星DNA是真核基因组中大量而随机出现的简单重复序列，具有容易筛选并且顺序化、种类多、分布广、高度多态、重组率低，在人群中表现高度的个体特异性，并按照孟德尔共显性方式遗传，突变率极低等特点，现已成为一种新的遗传标记。与常见的癌基因与抑癌基因改变不同，MSI主要表现为DNA简单重复序列改变，导致微卫星DNA序列长度的异常，因此，MSI被认为是细胞癌变的新机理。
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我们采用银染PCR-SSCP方法检测胃癌组织标本MSI，总的检出率为37.0%，提示MSI是胃癌病变中常见的分子遗传学变化。研究结果显示，MSI在胃癌发生的早期(T1期)有较高的检出率，提示MSI是胃癌发生的早期事件，可能是胃癌发生的重要机理。虽然本研究并没有显示胃癌的浸润深度与MSI的相关性，但是在有癌旁淋巴结转移组，MSI的检出率明显高于无转移组，提示MSI的出现不仅是癌变的信号，而且与癌的恶性转移也有一定的关系。
分析p53基因突变与MSI的关系表明：p53基因突变组，MSI检出率有增高趋势，但经统计学处理两者无明显的相关性(P>0.05)。提示p53基因改变可能与MSI分别代表了胃粘膜癌变过程中的不同分子病理学机理，但无论是p53基因改变、还是MSI的分析，均在淋巴结转移时有较高的检出率，表明两者均可不同程度地反映胃癌的细胞生物学恶性行为，这对临床上分析胃癌的预后可能有参考意义。
参考文献
, 百拇医药
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[7]Li JL, Yang GH, Li GD. Detection of point mutation of p53 gene by silver staining PCR-SSCP in paraffin-embedded malignant fibrous histiocytoma. Chin J Oncol,1996,18(1)∶13-15.〔李家良，杨光华，李甘地.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变.中华肿瘤杂志，1996，18(1)∶13-15.〕
收稿日期：1999-04-13, http://www.100md.com
单位：郭文(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；张亚历(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；吴保平(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；张立力(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)；周殿元(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
关键词：胃癌；p53基因突变；微卫星DNA不稳定性；超声内镜
中华医学遗传学杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS 2000 Vol 【摘要】 目的 探讨术前不同分期的胃癌p53基因突变与微卫星DNA不稳定性(microsatellite instability, MSI)的变化及其相互关系。方法 应用超声内境(endoscopic ultrasonography,EUS)对73例胃癌患者行术前分期，同时采用银染PCR-SSCP方法检测内镜活检组织标本p53基因突变及MSI。结果 p53基因总突变率为54.8%；T3期(64.3%)和T4期(67.9%)突变率明显高于T1(0)或T2期(25.0%)病例(P<0.05)；有淋巴结转移的病例突变率为67.6%，亦明显高于无转移时的41.7%(P<0.05)。MSI总检出率为37.0%；与癌的浸润深度无关，T1～T4期癌MSI的检出率分别为40.0%、33.3%、39.3%和34.5%(P>0.05)；但有淋巴结转移组MSI的检出率为51.4%，明显高于无转移的22.2%(P<0.05)。p53基因突变组，MSI检出率(42.5%)较无突变组(30.3%)有增高趋势，但两者无显著性差异(P>0.05)。结论 p53基因改变与MSI可能分别代表了胃粘膜癌变过程中的不同分子病理学机理，两者均不同程度地反映胃癌的细胞生物学恶性行为，对临床分析胃癌的预后可能有参考意义。
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Study on the p53 gene mutation and microsatellite instability of gastric carcinoma
GUO Wen ZHANG Yali WU Baoping ZHANG Lili ZHOU Dianyuan
(PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, First Medical University of PLA, Guangzhou, Guangdong, 510515 P.R. China)
【Abstract】 Objective To observe the relationship between p53 gene mutation and microsatellite instability (MSI) of the preoperative staging of gastric carcinoma by endoscopic ultrasonography(EUS). Methods A total of 73 cases of gastric carcinoma were taken for the preoperative staging with EUS.Silver staining PCR-SSCP method was used to detect mutations in exons 5,6,7,8 of p53 gene and MSI at 4 loci on chromosomes 2,5,17 in the 73 paraffin-embedded biospy specimens, and the relationship between them was studied further.Results The overall mutated rate of p53 gene was 54.8%, with 6.8%, 15.1%, 19.2% and 13.7% in exons 5 to 8, respectively. Analysis of the relation of the mutation with the preoperative staging by EUS showed that it was significantly higher in T3(64.3%) and T4(67.9%) than in T1(0) or T2(25.0%)(P<0.05), and it was 67.6% in cases with lymph node metastasis, which was significantly higher than that without metastasis (41.7%)(P<0.05). The overall detective rate of MSI was 37.0%. The detective rate of MSI had no relation with the depth of invasion, which was 40.0%, 33.3%,39.3% and 34.5% at T1 to T4 stages(P<0.05),respectively, but it was significantly higher in cases with lymph node metastasis(51.4%) than those without metastasis(22.2%)(P<0.05).Although the detective rate of MSI showed an increasing trend in the mutated cases of p53 gene as compared with the no mutation cases,there was no relationship between MSI and p53 gene mutation (P<0.05).Conclusion These results suggest that the gene mutation of p53 and MSI may represent the different mechanisms of carcinogenesis.They can reflect the cytobiologic malignant behavior of gastric carcinoma in varying degrees, which may be of reference significance in analysing the prognosis of the patients in clinics.
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【Key words】 gastric carcinoma; p53 gene mutation; microsatellite instability; endoscopic ultrasonography
从分子水平探讨胃癌发病机理是近几年研究的一个热点。现已表明，胃癌的发生发展与抑癌基因有关，其中p53基因突变是胃癌最常见的遗传学改变之一[1，2]。微卫星DNA不稳定性(microsatellite insta-bility,MSI)与肿瘤及一些癌前病变密切相关。与常见的癌基因与抑癌基因改变不同，MSI主要表现为短核苷酸重复序列如(CA)n、(AT)n等重复次数的增多或减少，因此，MSI被认为是细胞癌变的新机理[3，4]。然而，在胃癌发生与进展中，基因之间变化的规律所知甚少，尤其是对术前粘膜活组织的检测是否能反映其中规律，尚未见深入研究。基于超声内镜(endoscopic ultrasonography,EUS)术前对肿瘤的分期，我们采用银染PCR-SSCP技术，探讨胃癌p53基因突变与微卫星DNA不稳定性的变化及其相互关系。
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1 材料与方法
1.1 临床病例及EUS检查 73例胃癌患者，其中男41例，女32例，男女之比为1.28∶1。年龄26～67岁，平均51.4岁。采用日本Olympus EU-M20型超声胃镜，探头频率为7.5MHz和12MHz，术前行EUS检查。检查时先用普通胃镜对上消化道进行全面观察，了解病变部位及表面形态改变，同时活检粘膜病变及正常组织作石蜡包埋切片，以做HE染色和组织消化，行PCR-SSCP检测p53基因突变和MSI。然后再用超声胃镜以水囊法和/或水充盈法检查病变。根据对癌浸润深度和淋巴结转移情况的判断进行TN分期[5]。所有病例于2周内手术，作术后病理TN分期对照。
1.2 PCR反应 按文献[6]之方法A，从石蜡组织切片中提取DNA模板。
p53基因第5～8外显子引物参考文献[2]设计，由加拿大真达基因公司协助合成。其序列如下：(1)第5外显子(产物为245bp)。PU5：5′-GACTTTCAACT-GTCTC-3′，PD5：5′-CTGGGACCCTGGGCAAC-3′；(2)第6外显子(产物为184bp)PU6：5′-GAGACG-ACAGGGCTGGTT-3′，PD6：5′-CCACTGACAAC-CACCCTT-3′；(3)第7外显子(产物为188bp)，PU7：5′-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3′，PD7：5′-AA-GTGGCTCCTGACCTGGAG-3′；(4)第8外显子(产物为214bp)，PU8：5′-TGGTAATCTACTGGGAC-G-3′，PD8：5′-CTCGCTTAGTGCTCCCTGG-3′。
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MIN的引物参照文献[4]设计，序列如下：D2S123：(1)5′-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3′，(2)5′-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3′，扩增片段为197～227bp。D5S107：(1)5′-GATCCACTTTA-ACCCAAATAC-3′，(2)5′-GGCATCAACTTGAA-CAGCAT-3′。扩增片段为133～155bp。D17S250(1)5′-GGA-AGAATCAAATAGACAAT-3′，(2)5′-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3′。扩增片段为53～169bp。D2S119：(1)5′-CTTGGGGAAC-AGAGGTCATT-3′，(2)5′-GAGAATCCCTCAA-TTTCTTTGGA-3′。扩增片段为214～232bp。
25 μl PCR反应体系中加入无菌水10.5 μl，10×扩增缓冲剂2.5 μl，4种dNTP混合物(10 mmol/L)1 μl，引物Ⅰ、Ⅱ(100 ng/μl)各2 μl，模板DNA 4 μl。于97℃加热8 min使DNA完全变性，将3 μl Taq酶(0.75U)加入处于80℃的反应混合液中。PCR扩增：94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，依次进行35个循环，72℃ 5 min。
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1.3 SSCP分析 取上述PCR产物6 μl加入18 μl测序加样缓冲液(含98%去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA、pH8.0、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝)混匀于97℃变性8 min，置40%乙醇碎冰中冰浴5 min，再快速加样于预冷4℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5%的甘油，丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1)上。双链对照标本是将6 μl PCR产物加入2 μl上样缓冲液中混匀，不作变性处理，直接上样。13℃，400V恒压电泳4 h。电泳缓冲液为0.5×TBE。
1.4 银染 取下凝胶，按文献[7]银染。
2 结果
2.1 胃癌EUS检查与分期 EUS能清晰显示胃壁的层次结构。胃癌的EUS影像表现为不规则的低回声肿块影，根据正常胃壁结构层次的破坏情况可对其进行分期。其中T1期癌(浸润粘膜或粘膜下层)5例，T2期癌(浸润固有肌层)12例，T3期癌(浸润至浆膜层)28例，T4期癌(浸润至邻近组织)28例。根据EUS检查有无探及邻近淋巴结肿大情况，可将病例分为淋巴结转移(N+)与非转移(N0)两组，其中N+者37例，N0者36例。对照术后病理检查，EUS对T分期的准确率为84.9%，N分期为83.6%。
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2.2 胃癌p53基因突变检测 应用银染PCR-SSCP技术检测73例胃癌标本中p53基因第5、6、7和8外显子的突变情况，通过与自身的正常胃粘膜组织对照，发现40例存在p53基因点突变，出现异常移动的单链DNA电泳带(图1)，突变率为54.8%。
外显子5～8出现异常电泳带的频率分别为：5例(6.8%)、11例(15.1%)、14例(19.2%)和10例(13.7%)。分析其突变与术前超声内镜分期的关系(表1)，可见癌细胞浸润浆膜层后(T3或T4期)，突变率明显高于癌细胞限制于固有肌层以内(T1或T2期)者(P<0.05)，但T3与T4或T1与T2期之间p53基因突变并无明显差别。另外，伴淋巴转移组突变率明显高于无转移组(P<0.05)。
2.3 胃癌MSI检测 应用4对分别代表了第2、5、17号染色体不同位点的引物，在所检测的73例胃癌中，27例出现1个或多个染色体位点的不稳定性(图2)，检出率为37.0%。分析MSI与术前EUS分期的关系(表1)，可见其与胃癌的浸润深度无关。但在伴淋巴结转移的病例MSI检出率高达51.4%，明显高于无转移组的22.2%。
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图1 银染PCR-SSCP检测p53基因突变 A、B、C、D分别代表第5、6、7、8外显子突变；与肿瘤邻近正常组织标本相比，肿瘤组织(T)出现p53突变时有DNA单链泳动带的位移，出现额外的电泳带(病例37T、66T、57T、45T箭头所示)；ds:双链DNA，银染观察
Fig 1 SSCP analysis of p53 mutations In exons 5(A),6(B),7(C) and 8(D):p53 mutations lead to mobility shifts of the single strand DNA in cases 37T,66T,57T and 45T (arrowheads) as evidenced by additional banding patterns in comparison with non-mutated, adjacent normal tissue DNA (N), ds is regarded as the double strand DNA. The results are visualized with the silver staining technique
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图2 银染PCR-SSCP检测正常和肿瘤组织DNA微卫星DNA不稳定性 A、B、C、D分别代表D2S119、D5S107、D2S123和D17S250位点MSI情况；病例11T、57T、9T和25T(箭头所示)肿瘤组织与正常对照组比较出现了DNA单链泳动带的位移；N:正常组织；T：肿瘤组织
Fig 2 SSCP analysis of MSI in paired normal (N) and tumor (T) DNA at loci D2S119 (A), D5S107(B),D2S123(C) and D17S250(D) gastric cancer. MSI leads to mobility shifts of the single strand DNA in cases 11T, 57T,9T and 25T(arrowheads) in comparison with non-mutated, adjacent normal tissue DNA(N)
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表1 不同EUS分期的胃癌p53基因突变和MSI频率
Table 1 Frequency of p53 gene mutation and MSI in different EUS stagings of gastric carcinomas
EUS staging
(EUS分期)
Depth of invasion or metastasis
(浸润深度或转移)
n
(例数)
p53 gene mutation
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(p53基因突变)
MSI
(微卫星DNA不稳定性)
n
%
n
%
T1
Mucosaor submucosa
5
0
0
2
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40.0
T2
Muscularis propria
12
3
25.0
4
33.3
T3
Serosa
28
18
64.3*
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11
39.3
T4
Adjacent structures
28
19
67.9*
10
35.7
N0
Nolymph node metastasis
36
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15
41.7
8
22.2
N+
Lymph node metastasis
37
25
67.6**
19
51.4*
*Significantly different from T1 or T2(P<0.05)(与T1或T2比较有显著性差异)；**Significantly different from N0(P<0.05)(与N0比较有显著性差异)；mucosa or submucosa(粘膜或粘膜下)；muscularis propria(固有肌层)；serosa(浆膜层)；adjacent structures(邻近组织)；no lymph node metastasis(无淋巴结转移)；lymph node metastasis(伴淋巴结转移)
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2.4 p53基因突变与MSI的关系 分析p53基因突变与MSI的关系(表2)，表明p53基因突变组，MSI检出率有增高趋势，但经统计学处理两者无明显的相关性(P>0.05)。
表2 胃癌p53基因突变与MSI的关系
Table 2 Relationship between p53 gene mutation and MSI in gastric carcinomas
p53 gene mutation
(p53突变)
n
(例数)
MSI(%)
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Positive(阳性)
Negative(阴性)
Positive(阳性)
40
17(42.5)
23(57.5)
Negative(阴性)
33
10(30.3)
23(69.7)
3 讨论
临床对肿瘤的检查已不满足于单纯的术前诊断。由于正确的癌肿分期对决策治疗方案和评价预后有重要的指导意义，因此，术前癌肿分期已成为现代医学重要的诊断模式。在胃癌的术前诊断中，EUS由于能将超声探头直接经内镜检查送达病变部位对病变进行超声扫描，明显优于现有的其他检查，且与术后病理对照也具有较高的一致性，因此已在临床逐步推广应用。我们对73例胃癌术前EUS分期准确性，T分期达84.9%、N分期达83.6%，与文献报道相符。
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p53基因是一种肿瘤抑制基因。已证实，p53基因突变或丢失与人类胃癌的发生发展相关。这种基因水平的改变主要发生在4个进化上高度保守区，即外显子5～8。既往检测基因突变的方法为序列分析，但该法费时、昂贵，尤其不适用于对大量标本的研究及基层实验室开展。我们应用银染PCR-SSCP技术检测了73例胃癌p53基因第5、6、7和8外显子的突变情况，发现40例存在基因突变，突变率为54.8%。同时显示，p53基因突变与肿瘤浸润深度及淋巴结转移状况相关。提示胃癌中普遍存在p53基因突变，并推测p53基因突变与胃癌的发生演化、转移和预后有关。
微卫星DNA是真核基因组中大量而随机出现的简单重复序列，具有容易筛选并且顺序化、种类多、分布广、高度多态、重组率低，在人群中表现高度的个体特异性，并按照孟德尔共显性方式遗传，突变率极低等特点，现已成为一种新的遗传标记。与常见的癌基因与抑癌基因改变不同，MSI主要表现为DNA简单重复序列改变，导致微卫星DNA序列长度的异常，因此，MSI被认为是细胞癌变的新机理。
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我们采用银染PCR-SSCP方法检测胃癌组织标本MSI，总的检出率为37.0%，提示MSI是胃癌病变中常见的分子遗传学变化。研究结果显示，MSI在胃癌发生的早期(T1期)有较高的检出率，提示MSI是胃癌发生的早期事件，可能是胃癌发生的重要机理。虽然本研究并没有显示胃癌的浸润深度与MSI的相关性，但是在有癌旁淋巴结转移组，MSI的检出率明显高于无转移组，提示MSI的出现不仅是癌变的信号，而且与癌的恶性转移也有一定的关系。
分析p53基因突变与MSI的关系表明：p53基因突变组，MSI检出率有增高趋势，但经统计学处理两者无明显的相关性(P>0.05)。提示p53基因改变可能与MSI分别代表了胃粘膜癌变过程中的不同分子病理学机理，但无论是p53基因改变、还是MSI的分析，均在淋巴结转移时有较高的检出率，表明两者均可不同程度地反映胃癌的细胞生物学恶性行为，这对临床上分析胃癌的预后可能有参考意义。
参考文献
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收稿日期：1999-04-13, http://www.100md.com