IL-4基因转染诱导肝母细胞瘤分化及抑制端粒酶活性
作者：付劲蓉 李成荣 杨锡强 李欣
单位：付劲蓉(518026 广东省深圳市儿童医院)；李成荣(518026 广东省深圳市儿童医院)；杨锡强(重庆医科大学儿童医院)；李欣(重庆医科大学儿童医院)
关键词：白细胞介素4；基因转染；肝母细胞瘤；细胞分化；端粒酶
中华医学遗传学杂志000206 【摘要】 目的 研究人白细胞介素4(human interleukin-4,hIL-4)基因转染对肝母细胞瘤细胞的诱导分化和对端粒酶活性的影响。方法 以逆转录病毒载体(PL-IL-4-SN)将hIL-4基因导入人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞。台盼蓝拒染、瑞式染色、放射免疫测定、流式细胞仪细胞周期分析、原位杂交、PCR-ELISA等方法检测基因转染后细胞形态、甲胎蛋白合成、原癌基因的表达及端粒酶活性变化。结果 转染IL-4基因后Hep G2细胞生长速度减慢(P<0.05),细胞周期发生G0/G1期阻滞，细胞形态趋于向正常肝细胞转化。甲胎蛋白分泌量(3.26±1.43ng.106cells-1.24h-1)较未转基因细胞(15.6±0.67ng.106.cells-1.24h-1)降低(P<0.05)；原癌基因表达及端粒酶活性降低(P<0.01)。结论 hIL-4基因转染可诱导肝母细胞瘤分化及下调端粒酶活性。
, 百拇医药
IL-4 gene transfer induces the differentiation of cells and inhibits the activity of telomerase in hepatoblastoma cells*
FU Jingrong LI Chengrong
(Children's Hospital of Shenzhen, Guangdong ,518026 P.R. China);
YANG Xiqiang LI Xin
(Children's Hospital, Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing, 400014 P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effects of human interleukin-4(hIL-4) gene transfer on the differentiation and the activities of telomerase in hepatoblastoma cells. Methods Retroviral vector (PL-IL-4-SN) was employed to introduce hIL-4 gene into human hepatoblastoma cell line(Hep G2) cells.Trypan blue and Wright's stain, radioimmunoassay, in situ hybridization, flow cytometry, PCR-ELISA were used to determine the change in morphology and cell cycle, the expression of proto-oncogenes, the synthesis of AFP and the activities of telomerase in IL-4 gene transferred tumor cells. Results The shape of the hepatoblastoma cells tended to become relatively mature; the growth of the cells was significantly suppressed(P<0.05); the synthesis of AFP was reduced from 15.60±0.67 ng.106 cells-1.24h-1 to 3.26±1.43 ng.106 cells-1.24h-1； the proliferation of the cells was significantly suppressed(P<0.05); the cell cycle was arrested at G0/G1 stage; the expression of c-fos, c-jun,c-myc and the activities of telomerase were remarkably decreased in IL-4 gene-modified Hep G2 cells. Conclusion hIL-4 gene transfer could induce the differentiation of heptoblastoma cells and down-regulate the activity of tolemarase in Hep G2 cells.
, http://www.100md.com
【Key words】 interleukin-4; gene transfer; heptoblastoma cells; differentiation; telomerase
人白细胞介素-4(hIL-4)可抑制肿瘤增殖、诱导抗瘤免疫反应及多种白血病细胞分化，作为极好的候选因子用于肿瘤基因治疗已进入临床初试阶段[1]，我们的前期结果表明重组IL-4可诱导肝母细胞瘤分化。现在进一步研究IL-4基因转染是否诱导肝细细胞瘤分化，并同时检测细胞端粒酶活性，探讨端粒酶活性在IL-4基因转染诱导分化过程中的变化及调节机理。
1 材料和方法
1.1 建立hIL-4 Hep G2阳性克隆 以磷酸钙沉淀法将PL-IL-4-SN逆转录病毒载体(本室构建)导入包装细胞系PA317、NIH3T3细胞测病毒滴度[2]，选较高滴度的病毒上清(5×105CFU/ml)感染HepG2细胞，G418(250 μg/ml)筛选2周获抗性克隆，经PCR检测证实hIL-4基因已整合到阳性克隆细胞中。双抗体夹心ELISA检测IL-4克隆细胞(IL-4+)IL-4分泌量为400～800pg.106 cells-1.24h-1。反复传代3个月分泌量仍达200～300pg.106 cells-1.24h-1。野生型(wild)及空载体(neo)转染细胞分泌量极低(16～25pg.106cells-1.24h-1)。提示已获稳定表达hIL-4的瘤细胞克隆。
, http://www.100md.com
1.2 细胞生长特性检测 采用台盼蓝拒染和瑞氏染色法检测细胞增殖能力及细胞形态。
1.3 甲胎蛋白测定 用放射免疫法测定[3](试剂盒购自中国潍坊3V诊断技术公司)。
1.4 细胞周期分析 调细胞浓度5×105/ml,碘化丙啶染色，流式细胞仪(FACS Calibur美国BD)检测分析。
1.5 原癌基因c-fos、c-jun、c-myc mRNA表达水平检测 采用原位杂交法，按文献[4]略加改良，预杂交和杂交后(所用地高辛标记的cDNA探针购自北京医大医学交流服务部)用硝基四唑氮蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)显色，尖固红(nucleic fast red)或Safranin复染封片镜检计数，重复10次，每次检测不同视野100个细胞的按强阳性、阳性、弱阳性、阴性积3、2、1、0分，计算积分比值。
, 百拇医药
1.6 端粒酶活性检测 操作参照说明书。端粒酶PCR-EIESA试剂盒购自Boehringer Mannheim。200 μl端粒酶提取液裂解5×105对数生长的瘤细胞，4℃16 000r/min离心20 min。收集上清取2 μl作RT-PCR，经逆转录，端粒酶灭活，PCR扩增，取5 μl PCR产物以ELISA半定量检测端粒酶活性：生物素标记的PCR产物被吸附于亲和素包被的酶标板孔内，加入特异性地高辛标记核苷酸探针、抗DIG-POD抗体及底物(TMB)，波长450 nm和690 mn比色，根据A=1.5A450-A690计算酶活性A(旧称光密度OD)，每个标本重复3孔取均值，阴性对照小于0.2，阳性对照大于1.0为有效测定。
1.7 统计学分析 采用t、F检验及直线相关分析。
2 结果
2.1 hIL-4基因转染对Hep G2细胞生长特性的影响 IL-4+Hep G2细胞生长速度明显低于Wild Hep G2细胞(图1，经F检验，P<0.05)。进一步观察细胞形态可见转染IL-4+Hep G2细胞形态由原来大小不一的长梭形或卵圆形转变为大小较均一的多边形，细胞核变小，细胞浆增多，原来存在的瘤巨细胞消失。
, http://www.100md.com
2.2 甲胎蛋白测定 Wild Hep G2细胞AFP分泌量为15.6±0.67ng.106cells-1.24h-1,IL-4 Hep G2细胞AFP分泌量为3.26±1.43ng.106 cells-1.24h-1，两者相比差异显著(P<0.05)。
图1 IL-4基因转染对细胞生长的影响
Fig 1 The effect on the growth of HepG2 cells by hIL-4 gene transfer
, http://www.100md.com
2.3 hIL-4基因转染对瘤细胞c-fos、c-jun、c-myc基因表达的影响 图2为原癌基因原位杂交检测示意图，可见Wild Hep G2细胞c-fos、c-jun、c-myc基因过度表达，积分分别为230%±20.5%、238%±21.7%、279%±39.0%，而IL-4基因修饰细胞c-fos、c-jun、c-myc表达明显降低，积分值分别为131%±27.5%、146%±30.5%、21%±7.0%，两组相比差异显著(P<0.001，υ=8)。
图2 IL-4基因转染对端粒酶活性影响 1：裂解液(阴性质控)；2：RNA酶(空白对照)；3：阳性质控；4：野生型Hep G2;5：野生型Hep G2无血清培养46 h；6：IL-4基因修饰Hep G2细胞
Fig 2 The effects of IL-4 gene modification on the activities of telomerase in Hep G2 cells 1:Lysis;2:RNase A;3:TSR8(positive control);4:Wild Hep G2;5:Wild Hep G2 in serum free medium for 46h;6:IL-4+Hep G2
, http://www.100md.com
2.4 细胞周期分布分析(表1) 流式细胞仪分析结果表明IL-4 Hep G2细胞周期主体群向G0/G1期移动，G0/G1基因修饰使百分比明显增高，提示IL-4基因修饰的细胞发生了G0/G1期阻滞。
2.5 端粒酶活性检测结果 见图3。转染IL-4基因的Hep G2细胞端粒酶活性明显低于野生型Hep G2细胞，直线相关分析发现端粒酶活性与AFP分泌量成正相关(n=6，r=0.945，P<0.05)。进一步无血清培养野生型Hep G2细胞46 h，使其与IL-4+Hep G2细胞在细胞周期中各时相分布一致(表1)，可见IL-4+Hep G2细胞端粒酶活性仍明显低于Wild Hep G2细胞。
, 百拇医药
图3 人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞原癌基因c-fos、c-jun、c-myc原位杂交检测(核固红复染3.3×40) A：野生型Hep G2 c-fos mRNA;B:IL-4+基因修饰Hep G2 c-fos mRNA;C:野生型Hep G2 c-jun mRNA;D:IL-4+基因修饰Hep G2 c-jun mRNA;E:野生型Hep G2 c-myc mRNA;F:IL-4+基因修饰Hep G2 c-myc mRNA。胞浆中蓝色颗粒为阳性杂交信号
Fig 3 Identification of expression of proto-oncogenes (c-fos,c-jun,c-myc)in Hep G2 cells Blue granule in intracytoplasm represents a positive signal of hybridization
, http://www.100md.com 表1 Hep G2及其基因修饰细胞周期分析结果
Table 1 The result of cell cycle analysis of Hep G2 cells and Hep G2 cells transferred with hIL-4 gene Cells
(细胞)
Percentage of cells entering into
cell cycle(细胞周期细胞数，%)
G1/G0
S
G2/M
, 百拇医药
Wild Hep G2(野生型)
43.34±1.92
33.70±2.21
22.96±2.02
IL-4Hep G2(IL-4基因修饰型)
59.19±3.72
28.15±4.66
12.66±2.89
Wild Hep G2 in serum free
medium for 46h
(野生型无血清培养46 h)
, 百拇医药
60.43±1.76
27.29±2.17
12.29±1.46
3 讨论
以全反式维甲酸(ATRA)为代表的诱导分化治疗是肿瘤治疗的研究热点，由于可发生白细胞过多症等致死性副作用及长期、反复、全身使用可导致耐药，寻找副作用更小的分化诱导剂仍是当前的重要课题[5]。hIL-4可促使某些白血病细胞分化。但诱导实体瘤细胞分化的作用目前尚少有报道。我们通过逆转录病毒载体将IL-4导入肝母细胞瘤系Hep G2线胞，发现转染hIL-4基因的Hep G2细胞增殖明显受抑，形态上由原来较幼稚的圆形，梭形转变为正常肝细胞的多角形，核浆比例明显缩小，AFP分泌减少，过度表达的原癌基因c-fos、c-jun、c-myc显著降低，提示hIL-4基因治疗有诱导肿瘤分化的作用。这种利用基因工程技术使肿瘤细胞自分泌及旁分泌hIL-4，在局部以更接近生理的模式发挥效应而避免反复、全身使用可能导致的副作用，较传统分化诱导剂更具优越性。
, http://www.100md.com
端粒酶是一种逆转录酶，约85%的人类恶性肿瘤端粒酶过度表达，研究结果表明端粒酶过度激活与恶性肿瘤形成机理密切相关，抑制端粒酶活性已成为抗肿瘤治疗的新靶点[6]。我们研究发现hIL-4阳性克隆瘤细胞端粒酶活性明显降低，表明hIL-4基因治疗肿瘤具有激发机体抗肿瘤免疫反应、抑制细胞增殖、诱导分化和抑制端粒酶活性等多重效应。
端粒酶活性与肝癌分化指标AFP的分泌量成正相关，提示端粒酶活性与细胞分化状态有共同调节通道。文献报道端粒酶活性调节具有细胞周期依赖性，其活性在细胞周期中S期最高，G0/G1期次之，G2/M期最低[7]。我们研究发现转染IL-4基因可使瘤细胞主体群向G0/G1期移动，那么hIL-4阳性克隆瘤细胞端粒酶活性下调是否是由于细胞周期阻滞于G0/G1期所致呢?用无血清培养法使野生型Hep G2细胞在细胞周期时相的分布与IL-4+克隆细胞基本一致，再检测端粒酶活性发现野生型瘤细胞仍明显高于IL-4+克隆细胞， 提示除细胞周期依赖性调节机理外，可能还有其它因素调节端粒酶活性。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金项目(39470733)；深圳市卫生系统科研基金(19994006)
参考文献
[1]Hara T,Yamada K,Tachibana H,et al.Basophilic differentiation of the human leukemia cell line KU812 upon treatment with interleukin-4.Biochem Biophys Res Commun,1998,247∶542-548.
[2]Zhao XD, Li CR, Yang XQ, et al.The foundation of Retroviral vector of IL-4 and gene expression in human tumor cell. J Chongqing University Medical Sience, 1998,23,1-3.[赵晓东，李成荣，杨锡强，等.人重组IL-4逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达.重庆医科大学学报，1998，23∶1-3.]
, 百拇医药
[3]Han R. The studies and the laboratory technics of anti-tumor drug. Beijing: Beijing Medical University Press,1997.123-159.[韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术.第1版 北京：北京医科大学出版社，1997.123-159.]
[4]Le GD,Frapppaer L,Desprez PY.Ultrastructural localization of mRNA encoding for the EGF receptor in human breast cell cancer line BT20 by in situ hybridization.J Histochem Cytochem,1991,39∶1-6.
[5]Wang ZY,Chen Z,Hang W,et al.Problems existing in differentiation therapy of acute promelocytic leukemia with ATRA.Blood Cells,1993,19∶633-641.
[6]Parkinson EK.Do telomerase antagonists represent a novel anticancer strategy? Bri J Cancer,1996,73∶1-4.
[7]Zhu XL,Kumar R,Mandal M,et al.Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells.Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93∶6091-6095.
收稿日期：1999-04-29, 百拇医药
单位：付劲蓉(518026 广东省深圳市儿童医院)；李成荣(518026 广东省深圳市儿童医院)；杨锡强(重庆医科大学儿童医院)；李欣(重庆医科大学儿童医院)
关键词：白细胞介素4；基因转染；肝母细胞瘤；细胞分化；端粒酶
中华医学遗传学杂志000206 【摘要】 目的 研究人白细胞介素4(human interleukin-4,hIL-4)基因转染对肝母细胞瘤细胞的诱导分化和对端粒酶活性的影响。方法 以逆转录病毒载体(PL-IL-4-SN)将hIL-4基因导入人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞。台盼蓝拒染、瑞式染色、放射免疫测定、流式细胞仪细胞周期分析、原位杂交、PCR-ELISA等方法检测基因转染后细胞形态、甲胎蛋白合成、原癌基因的表达及端粒酶活性变化。结果 转染IL-4基因后Hep G2细胞生长速度减慢(P<0.05),细胞周期发生G0/G1期阻滞，细胞形态趋于向正常肝细胞转化。甲胎蛋白分泌量(3.26±1.43ng.106cells-1.24h-1)较未转基因细胞(15.6±0.67ng.106.cells-1.24h-1)降低(P<0.05)；原癌基因表达及端粒酶活性降低(P<0.01)。结论 hIL-4基因转染可诱导肝母细胞瘤分化及下调端粒酶活性。
, 百拇医药
IL-4 gene transfer induces the differentiation of cells and inhibits the activity of telomerase in hepatoblastoma cells*
FU Jingrong LI Chengrong
(Children's Hospital of Shenzhen, Guangdong ,518026 P.R. China);
YANG Xiqiang LI Xin
(Children's Hospital, Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing, 400014 P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effects of human interleukin-4(hIL-4) gene transfer on the differentiation and the activities of telomerase in hepatoblastoma cells. Methods Retroviral vector (PL-IL-4-SN) was employed to introduce hIL-4 gene into human hepatoblastoma cell line(Hep G2) cells.Trypan blue and Wright's stain, radioimmunoassay, in situ hybridization, flow cytometry, PCR-ELISA were used to determine the change in morphology and cell cycle, the expression of proto-oncogenes, the synthesis of AFP and the activities of telomerase in IL-4 gene transferred tumor cells. Results The shape of the hepatoblastoma cells tended to become relatively mature; the growth of the cells was significantly suppressed(P<0.05); the synthesis of AFP was reduced from 15.60±0.67 ng.106 cells-1.24h-1 to 3.26±1.43 ng.106 cells-1.24h-1； the proliferation of the cells was significantly suppressed(P<0.05); the cell cycle was arrested at G0/G1 stage; the expression of c-fos, c-jun,c-myc and the activities of telomerase were remarkably decreased in IL-4 gene-modified Hep G2 cells. Conclusion hIL-4 gene transfer could induce the differentiation of heptoblastoma cells and down-regulate the activity of tolemarase in Hep G2 cells.
, http://www.100md.com
【Key words】 interleukin-4; gene transfer; heptoblastoma cells; differentiation; telomerase
人白细胞介素-4(hIL-4)可抑制肿瘤增殖、诱导抗瘤免疫反应及多种白血病细胞分化，作为极好的候选因子用于肿瘤基因治疗已进入临床初试阶段[1]，我们的前期结果表明重组IL-4可诱导肝母细胞瘤分化。现在进一步研究IL-4基因转染是否诱导肝细细胞瘤分化，并同时检测细胞端粒酶活性，探讨端粒酶活性在IL-4基因转染诱导分化过程中的变化及调节机理。
1 材料和方法
1.1 建立hIL-4 Hep G2阳性克隆 以磷酸钙沉淀法将PL-IL-4-SN逆转录病毒载体(本室构建)导入包装细胞系PA317、NIH3T3细胞测病毒滴度[2]，选较高滴度的病毒上清(5×105CFU/ml)感染HepG2细胞，G418(250 μg/ml)筛选2周获抗性克隆，经PCR检测证实hIL-4基因已整合到阳性克隆细胞中。双抗体夹心ELISA检测IL-4克隆细胞(IL-4+)IL-4分泌量为400～800pg.106 cells-1.24h-1。反复传代3个月分泌量仍达200～300pg.106 cells-1.24h-1。野生型(wild)及空载体(neo)转染细胞分泌量极低(16～25pg.106cells-1.24h-1)。提示已获稳定表达hIL-4的瘤细胞克隆。
, http://www.100md.com
1.2 细胞生长特性检测 采用台盼蓝拒染和瑞氏染色法检测细胞增殖能力及细胞形态。
1.3 甲胎蛋白测定 用放射免疫法测定[3](试剂盒购自中国潍坊3V诊断技术公司)。
1.4 细胞周期分析 调细胞浓度5×105/ml,碘化丙啶染色，流式细胞仪(FACS Calibur美国BD)检测分析。
1.5 原癌基因c-fos、c-jun、c-myc mRNA表达水平检测 采用原位杂交法，按文献[4]略加改良，预杂交和杂交后(所用地高辛标记的cDNA探针购自北京医大医学交流服务部)用硝基四唑氮蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)显色，尖固红(nucleic fast red)或Safranin复染封片镜检计数，重复10次，每次检测不同视野100个细胞的按强阳性、阳性、弱阳性、阴性积3、2、1、0分，计算积分比值。
, 百拇医药
1.6 端粒酶活性检测 操作参照说明书。端粒酶PCR-EIESA试剂盒购自Boehringer Mannheim。200 μl端粒酶提取液裂解5×105对数生长的瘤细胞，4℃16 000r/min离心20 min。收集上清取2 μl作RT-PCR，经逆转录，端粒酶灭活，PCR扩增，取5 μl PCR产物以ELISA半定量检测端粒酶活性：生物素标记的PCR产物被吸附于亲和素包被的酶标板孔内，加入特异性地高辛标记核苷酸探针、抗DIG-POD抗体及底物(TMB)，波长450 nm和690 mn比色，根据A=1.5A450-A690计算酶活性A(旧称光密度OD)，每个标本重复3孔取均值，阴性对照小于0.2，阳性对照大于1.0为有效测定。
1.7 统计学分析 采用t、F检验及直线相关分析。
2 结果
2.1 hIL-4基因转染对Hep G2细胞生长特性的影响 IL-4+Hep G2细胞生长速度明显低于Wild Hep G2细胞(图1，经F检验，P<0.05)。进一步观察细胞形态可见转染IL-4+Hep G2细胞形态由原来大小不一的长梭形或卵圆形转变为大小较均一的多边形，细胞核变小，细胞浆增多，原来存在的瘤巨细胞消失。
, http://www.100md.com
2.2 甲胎蛋白测定 Wild Hep G2细胞AFP分泌量为15.6±0.67ng.106cells-1.24h-1,IL-4 Hep G2细胞AFP分泌量为3.26±1.43ng.106 cells-1.24h-1，两者相比差异显著(P<0.05)。
图1 IL-4基因转染对细胞生长的影响
Fig 1 The effect on the growth of HepG2 cells by hIL-4 gene transfer
, http://www.100md.com
2.3 hIL-4基因转染对瘤细胞c-fos、c-jun、c-myc基因表达的影响 图2为原癌基因原位杂交检测示意图，可见Wild Hep G2细胞c-fos、c-jun、c-myc基因过度表达，积分分别为230%±20.5%、238%±21.7%、279%±39.0%，而IL-4基因修饰细胞c-fos、c-jun、c-myc表达明显降低，积分值分别为131%±27.5%、146%±30.5%、21%±7.0%，两组相比差异显著(P<0.001，υ=8)。
图2 IL-4基因转染对端粒酶活性影响 1：裂解液(阴性质控)；2：RNA酶(空白对照)；3：阳性质控；4：野生型Hep G2;5：野生型Hep G2无血清培养46 h；6：IL-4基因修饰Hep G2细胞
Fig 2 The effects of IL-4 gene modification on the activities of telomerase in Hep G2 cells 1:Lysis;2:RNase A;3:TSR8(positive control);4:Wild Hep G2;5:Wild Hep G2 in serum free medium for 46h;6:IL-4+Hep G2
, http://www.100md.com
2.4 细胞周期分布分析(表1) 流式细胞仪分析结果表明IL-4 Hep G2细胞周期主体群向G0/G1期移动，G0/G1基因修饰使百分比明显增高，提示IL-4基因修饰的细胞发生了G0/G1期阻滞。
2.5 端粒酶活性检测结果 见图3。转染IL-4基因的Hep G2细胞端粒酶活性明显低于野生型Hep G2细胞，直线相关分析发现端粒酶活性与AFP分泌量成正相关(n=6，r=0.945，P<0.05)。进一步无血清培养野生型Hep G2细胞46 h，使其与IL-4+Hep G2细胞在细胞周期中各时相分布一致(表1)，可见IL-4+Hep G2细胞端粒酶活性仍明显低于Wild Hep G2细胞。
, 百拇医药
图3 人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞原癌基因c-fos、c-jun、c-myc原位杂交检测(核固红复染3.3×40) A：野生型Hep G2 c-fos mRNA;B:IL-4+基因修饰Hep G2 c-fos mRNA;C:野生型Hep G2 c-jun mRNA;D:IL-4+基因修饰Hep G2 c-jun mRNA;E:野生型Hep G2 c-myc mRNA;F:IL-4+基因修饰Hep G2 c-myc mRNA。胞浆中蓝色颗粒为阳性杂交信号
Fig 3 Identification of expression of proto-oncogenes (c-fos,c-jun,c-myc)in Hep G2 cells Blue granule in intracytoplasm represents a positive signal of hybridization
, http://www.100md.com 表1 Hep G2及其基因修饰细胞周期分析结果
Table 1 The result of cell cycle analysis of Hep G2 cells and Hep G2 cells transferred with hIL-4 gene Cells
(细胞)
Percentage of cells entering into
cell cycle(细胞周期细胞数，%)
G1/G0
S
G2/M
, 百拇医药
Wild Hep G2(野生型)
43.34±1.92
33.70±2.21
22.96±2.02
IL-4Hep G2(IL-4基因修饰型)
59.19±3.72
28.15±4.66
12.66±2.89
Wild Hep G2 in serum free
medium for 46h
(野生型无血清培养46 h)
, 百拇医药
60.43±1.76
27.29±2.17
12.29±1.46
3 讨论
以全反式维甲酸(ATRA)为代表的诱导分化治疗是肿瘤治疗的研究热点，由于可发生白细胞过多症等致死性副作用及长期、反复、全身使用可导致耐药，寻找副作用更小的分化诱导剂仍是当前的重要课题[5]。hIL-4可促使某些白血病细胞分化。但诱导实体瘤细胞分化的作用目前尚少有报道。我们通过逆转录病毒载体将IL-4导入肝母细胞瘤系Hep G2线胞，发现转染hIL-4基因的Hep G2细胞增殖明显受抑，形态上由原来较幼稚的圆形，梭形转变为正常肝细胞的多角形，核浆比例明显缩小，AFP分泌减少，过度表达的原癌基因c-fos、c-jun、c-myc显著降低，提示hIL-4基因治疗有诱导肿瘤分化的作用。这种利用基因工程技术使肿瘤细胞自分泌及旁分泌hIL-4，在局部以更接近生理的模式发挥效应而避免反复、全身使用可能导致的副作用，较传统分化诱导剂更具优越性。
, http://www.100md.com
端粒酶是一种逆转录酶，约85%的人类恶性肿瘤端粒酶过度表达，研究结果表明端粒酶过度激活与恶性肿瘤形成机理密切相关，抑制端粒酶活性已成为抗肿瘤治疗的新靶点[6]。我们研究发现hIL-4阳性克隆瘤细胞端粒酶活性明显降低，表明hIL-4基因治疗肿瘤具有激发机体抗肿瘤免疫反应、抑制细胞增殖、诱导分化和抑制端粒酶活性等多重效应。
端粒酶活性与肝癌分化指标AFP的分泌量成正相关，提示端粒酶活性与细胞分化状态有共同调节通道。文献报道端粒酶活性调节具有细胞周期依赖性，其活性在细胞周期中S期最高，G0/G1期次之，G2/M期最低[7]。我们研究发现转染IL-4基因可使瘤细胞主体群向G0/G1期移动，那么hIL-4阳性克隆瘤细胞端粒酶活性下调是否是由于细胞周期阻滞于G0/G1期所致呢?用无血清培养法使野生型Hep G2细胞在细胞周期时相的分布与IL-4+克隆细胞基本一致，再检测端粒酶活性发现野生型瘤细胞仍明显高于IL-4+克隆细胞， 提示除细胞周期依赖性调节机理外，可能还有其它因素调节端粒酶活性。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金项目(39470733)；深圳市卫生系统科研基金(19994006)
参考文献
[1]Hara T,Yamada K,Tachibana H,et al.Basophilic differentiation of the human leukemia cell line KU812 upon treatment with interleukin-4.Biochem Biophys Res Commun,1998,247∶542-548.
[2]Zhao XD, Li CR, Yang XQ, et al.The foundation of Retroviral vector of IL-4 and gene expression in human tumor cell. J Chongqing University Medical Sience, 1998,23,1-3.[赵晓东，李成荣，杨锡强，等.人重组IL-4逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达.重庆医科大学学报，1998，23∶1-3.]
, 百拇医药
[3]Han R. The studies and the laboratory technics of anti-tumor drug. Beijing: Beijing Medical University Press,1997.123-159.[韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术.第1版 北京：北京医科大学出版社，1997.123-159.]
[4]Le GD,Frapppaer L,Desprez PY.Ultrastructural localization of mRNA encoding for the EGF receptor in human breast cell cancer line BT20 by in situ hybridization.J Histochem Cytochem,1991,39∶1-6.
[5]Wang ZY,Chen Z,Hang W,et al.Problems existing in differentiation therapy of acute promelocytic leukemia with ATRA.Blood Cells,1993,19∶633-641.
[6]Parkinson EK.Do telomerase antagonists represent a novel anticancer strategy? Bri J Cancer,1996,73∶1-4.
[7]Zhu XL,Kumar R,Mandal M,et al.Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells.Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93∶6091-6095.
收稿日期：1999-04-29, 百拇医药