中国人消化道肿瘤发病的遗传背景因素——错配修复基因hMLH1错义突变Va1384Asp
作者：王亚平 周建农 李忠佑 王建东 李金田 高长明 高萍
单位：王亚平(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；周建农(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；李忠佑(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；王建东(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；李金田(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；高长明(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；高萍(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)
关键词：hMLH1基因；错义突变；Val384Asp；病因学；消化道肿瘤
中华医学遗传学杂志000205 【摘要】 目的 探讨中国人中存在的错配修复基因hMLH1 Val384Asp在大肠癌、胃癌、食道癌发病中的作用。方法 中国汉族人101例大肠癌患者、79例胃癌患者、76例食道癌患者、79例和76例胃癌和食道癌患者的亲属、100名正常对照，各取正常体细胞，提取基因组DNA。PCR-SSCP和DNA序列分析技术检测hMLH1基因的第12外显子，比较分析Val384Asp的检出率。结果 6%的正常人携带hMLH1基因Val384Asp；小于45岁的大肠癌患者中hMLH1基因Val384Asp的检出率高于正常对照(P<0.05)；显著性差异还存在于具有癌症家族史的胃癌患者及其亲属与正常对照的比较(P<0.05和P<0.01)；食道癌患者及其亲属与正常对照之间的比较无显著差异(P>0.05)。结论 中国汉族人中hMLH1基因Val384Asp等位基因频率约3%，这一错义突变可能在中国人部分大肠癌、胃癌的发病中起作用。
, http://www.100md.com
One of the etiological factors of digestive tract cancers in Chinese: the missense mutation Val384Asp in the hMLH1 gene*
WANG Yaping ZHOU Jiannong LI Zhongyou WANG Jiandong LI Jintian GAO Changming
GAO Ping.
(Jiangsu Institute of Cancer Research, Nanjing, Jiangsu,210009 P.R. China. E-mail:wangyapn@jlonline.com)
【Abstract】 Objective To investigate the etiological role of Val384Asp in the hMLH1 gene, which may be a polymorphism in Chinese, in colorectal,gastric and esophageal cancers. Methods Genomic DNA extracted from normal tissues were subjected to analysis in exon 12 of the hMLH1 gene by single strand conformation polymorphism(SSCP) followed by DNA sequencing of aberrant bands in 101 colorectal, 79 gastric and 76 esophageal cancer patients; in 79 and 76 first degree relatives of gastric cancer and esophageal cancer patients respectively; and in 100 healthy control individuals. Results Six percent of Chinese healthy individuals were the carriers of Val384Asp in the hMLH1 gene. There were significant differences in the frequencies of Val384Asp in the hMLH1 gene between the patients with colorectal cancer at young age(<45 years) and the control individuals (P<0.05), and between the gastric cancer patients with family history, the first degree relatives and the control group (P<0.05 and P<0.01 respectively). No difference was found between the esophageal cancer patients, their relatives and healthy controls.Conclusion The alleles frequency of Val384Asp in the hMLH1 gene in Chinese is three percent. This missense mutation may play a part in the etiology of colorectal and gastric cancers in Chinese.
, 百拇医药
【Key words】 hMLH1 gene; missense mutation; Val384Asp; etiology; digestive tract cancers
遗传性非息肉性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)是一种遗传预置性(predisposition)疾病，呈常染色体显性遗传。在HNPCC家庭成员中，除大肠癌聚集发生外，胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等的发病亦明显高于一般人群[1，2]。近年来，HNPCC的发生与错配修复基因突变之间的关系得以确认[3，4]。通过在HNPCC患者中检测错配修复基因的突变，对HNPCC患者的家庭成员进行遗传咨询和基因诊断成为可能。对于已发现的某些突变，评价它的病因作用并不困难，如移码突变、无义突变，然而对于某些由单个碱基置换而导致的错义突变，有时难以确定其临床意义[5，6]。我们最近首先在大肠癌患者检出错配修复基因hMLH1遗传性(germline)错义突变Val384Asp，初步研究表明这一突变可能影响其携带者大肠癌的发病年龄[7，8]。为进一步探明hMLH1基因val384Asp的病因学作用，我们对不同消化道肿瘤患者及其亲属中hMLH1基因Val384Asp的存在状况进行了比较。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 检测的样本
1.1.1 大肠癌患者 101例大肠癌患者，男60例，女41例。1例符合HNPCC临床诊断标准，2例由家族性多发性结肠息肉病恶性转化而来，余为散发性大肠癌患者。发病年龄23～77岁，其中小于45岁的患者30例，大于或等于45岁的患者71例。每例患者取外周静脉血(61例)或手术切除的远离癌灶的正常组织(40例，病理排除癌细胞浸润)。
1.1.2 胃癌患者 79例胃癌患者，男58例，女21例，年龄30～79例。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者24例；无明确癌症家族史的患者55例。每例取外周静脉血。
1.1.3 食道癌患者 76例食道癌患者，男42例，女34例，年龄40～78岁。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者27例，无明确癌症家族史的患者49例。每例取外周静脉血。
, 百拇医药
1.1.4 癌症患者亲属的样本 每例胃癌、食道癌患者均随机取其1位健康亲属(父母、同胞或子女，一级亲属)的外周静脉血。胃癌患者的亲属，男58例，女21例，年龄6～70岁；食道癌患者的亲属，男58例，女18例，年龄14～75岁。
1.1.5 正常对照 100名对照为正常健康人，其一级亲属中无明确的癌症患者，男71例，女29例，年龄17～70岁。各取外周静脉血。
1.1.6 样本的民族及地区来源 检测的样本为中国汉族人。大肠癌患者为近三年来我所就诊的患者，主要来自江苏北部和西部地区， 安徽北部和东部地区；胃癌患者及其亲属、食道癌患者及亲属以及正常对照均取自江苏北部地区。
1.1.7 DNA提取 血样本以全血细胞提取DNA；组织样本研磨后，酚、氯仿法抽提DNA。
1.2 PCR-SSCP 每例样本均由1对引物特异性地扩增hMLH1基因第12外显子上游-4位碱基至第12外显子内第1251位碱基(216bp)。引物序列：5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′(上游)；5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′(下游)。
, 百拇医药
PCR反应体积25 μl，其中模板DNA 60 ng,4×dNTPs终浓度各0.2 mmol/L,MgCl2的浓度1.5 mmol/L,Taq酶1～1.5U。循环条件，94℃预变性5 min后，94℃40 s，55℃40 s，72℃60 s，35个循环周期，72℃延长10 min。取PCR产物6 μl加6 μl加样缓冲液，95℃变性5 min后立即置冰上，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE，电压70V，环境温度4℃，持续时间18～20 h。 电泳结束后凝胶用0.2%的硝酸银染色[6]。
1.3 DNA序列分析 SSCP分析出现异常带型的病例，相应的PCR产物直接测序(Amersham,Version 2.0 DNA Sequencing Kit)。
1.4 统计学方法 各组之间hMLH1基因Val384Asp检出率的比较、等位基因频率的比较及Odds Ratio(OR)值的计算采用Epi Info 6.04b统计软件。
, 百拇医药
2 结果
2.1 SSCP和DNA序列分析 100名正常对照者中6人出现异常电泳带型。相同的异常带型见于13/101的大肠癌患者、11/79的胃癌患者、7/76的食道癌患者、14/79的胃癌患者亲属和6/76的食道癌患者亲属(图1，表1)。DNA序列分析表明，这一异常带型的出现是由于hMLH1基因第12外显子内的第1151位碱基存在遗传性的碱基颠换(T→A，杂合型)，使该碱基所处的第384位密码子发生错义突变(GTT→GAT，Val384Asp,图2)。
2.2 分组分析 我们将大肠癌患者根据发病年龄(以45岁为界)分为两组；对胃癌、食道癌患者和胃癌患者亲属、食道癌患者亲属根据有无癌症家族史分别分为两组，计数Val384Asp的检出率(表2)。
2.3 统计分析的结果
2.3.1 3种消化道肿瘤患者组、2种肿瘤患者亲属组与健康人群比较 各肿瘤患者组、患者亲属组中hMLH1基因Val384Asp检出率分别与正常对照进行比较，结果仅胃癌患者亲属组与健康人群之间的差异具有显著性(P<0.05，表1)。
, http://www.100md.com
2.3.2 3种消化道肿瘤患者、2种肿瘤患者亲属分组后的组间比较 分组情况见表2。组间比较表明，胃癌患者亲属中具有癌症家族史的人群与无癌症家族史的人群之间具有显著差异(P<0.05，表2)。
2.3.3 大肠癌患者分组后与正常对照的比较 我们检出的hMLH1基因Val384Asp均为杂合型。我们以等位基因概念比较两组大肠癌患者中Val384Asp等位基因频率与健康人群的差异。结果表明，hMLH1基因Val384Asp在发病年龄较低(<45岁)的患者中检出率较高(P<0.05)；而发病年龄≥45岁的大肠癌患者中Val384Asp的检出率与正常对照之间无显著差异(P>0.05，表3)。
图1 hMLH1基因第12外显子的SSCP 1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异的SSCP带型
, http://www.100md.com
图2 hMLH1基因第12外显子序列分析 两例中国人大肠癌患者，携带hMLH1基因Val384Asp(杂合型)，箭头示存在于1151位碱基的颠换T→A，使384位密码子由GTT→GAT(Val384Asp)
Fig 1 SSCP of exon 12 in hMLH1 gene Lanes 1-4 and lanes 7-9 are the pattern of the wild genotypes； lanes 5,6 variant bands in two individuals who carry the missense mutation Val384Asp
Fig 2 Sequencing of exon 12 in hMLH1 gene Two colorectal cancer patients who carry missense mutation Val384Asp,arrows show a transversion T→A at nucleotide 1151
, 百拇医药
表1 各组中hMLH1基因Val384Asp的检出及与正常对照的比较*
Table 1 The comparison on the frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene between healthy individuals and investigated groups* Groups
(组 别)
Number of screening for Val384Asp
(Val384Asp检测人数)
P value
(P值)
, http://www.100md.com OR
Carriers
(携带者)
Non-carriers
(非携带者)
Total
(合计)
Healthy
(正常健康人)
6
94
100
CRC patients
, 百拇医药
(大肠癌患者)
13
88
101
0.097
2.31
GC patients
(胃癌患者)
11
68
79
0.073
2.53
, 百拇医药
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
14
65
79
0.014**
3.37
EC patients
(食道癌患者)
7
69
76
, 百拇医药
0.421
1.59
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
6
70
76
0.622
1.34
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；CRC：colorectal cancer;GC:gastric cancer;EC:esophageal cancer;**P<0.05
, 百拇医药
2.3.4 胃癌患者及其亲属与正常对照的比较 显著性差异存在于具有癌症家族史的胃癌患者与正常对照之间(P<0.05)、具有癌症家族史胃癌患者的亲属与正常对照之间(P<0.01，表3)。
2.3.5 食道癌患者及其亲属与对照的比较 两组食道癌患者及其亲属hMLH1基因Val384Asp的检出率与对照组之间均无显著差异(P>0.05，表3)。正常对照Val384Asp等位基因频率为3%(表3)。
表2 消化道肿瘤患者及其亲属分组后hMLH1基因Val384Asp检出率的组间比较*
Table 2 The comparison on the frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene between sub-groups in the investigated groups* Groups
, 百拇医药
(组 别)
Sub-groups
(分组)
Number of screening for Val384Asp
(Val384Asp检测人数)
P value
(P值)
Carriers
(携带者)
Non-carriers
(非携带者)
, 百拇医药
Total
(合计)
CRC patients
(大肠癌患者)
<45岁
≥45岁
6
7
24
64
30
71
0.198
, 百拇医药
GC patients
(胃癌患者)
CFH
NCFH
5
6
19
49
24
55
0.295
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
, 百拇医药
CFH
NCFH
8
6
16
49
24
55
0.021**
EC patients
(食道癌患者)
CFH
NCFH
, http://www.100md.com
2
5
25
44
27
49
1.000
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
CFH
NCFH
1
5
, 百拇医药
26
44
27
49
0.413
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；CFH：cancer family history(有癌症家族史)；NCFH：no cancer family history(无癌症家族史)；**P<0.05；the others are the same as in Table 1(相同内容见表1)表3 消化道肿瘤患者及其亲属中Val384Asp等位基因频率与正常对照之间的分层比较*
Table 3 The comparison on the alleles frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene
, 百拇医药
between the sub-group of investigated cases and healthy controls* Groups
(组 别)
Sub-groups
(分组)
Codon in hMLH1gene**
(密码子)
P value
(P值)
OR
384GAT
, 百拇医药
384GTT
Total
Healthy
(正常对照)
6***
194
200
CRC patients
(大肠癌患者)
<45岁
≥45岁
6
, 百拇医药
7
54
135
60
142
0.034****
0.359
3.59
1.68
GC patients
(胃癌患者)
CFH
NCFH
, 百拇医药
5
6
43
104
48
110
0.041***
0.358
3.76
1.87
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
, 百拇医药
CFH
NCFH
8
6
40
104
48
110
0.001***
0.358
6.47
1.87
EC patients
, http://www.100md.com
(食道癌患者)
CFH
NCFH
2
5
52
93
54
98
0.679
0.514
1.24
1.74
, http://www.100md.com
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
CFH
NCFH
1
5
53
93
54
98
1.000
0.514
0.61
, 百拇医药
1.74
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；**Number of alleles(等位基因数)；***The alleles frequency is three percent(等位基因频率为3%)；****P<0.05 or P<0.01;the others are the same as in Table 2(相同内容见表2)
3 讨论.
我们在已报道的工作中PCR扩增hMLH1基因第12外显子时用上游引物在第11内含子内[7]， PCR产物包括第11内含子的110个碱基，其中(TA)n、(T)n重复序列的多态性使其SSCP电泳带型亦呈现多态。这在客观上增加了待检DNA片段中突变的分析难度。本研究中，我们重新设计了引物序列，使PCR产物的5′端起始于第12外显子上游-4位点。PCR产物仅含4个属于第11内含子的碱基，避免了人群中广泛存在多态性的重复序列，SSCP电泳带型更易于进行突变分析。
, 百拇医药
我们在筛选错配修复基因遗传性突变的工作中，在中国人大肠癌患者重复检出hMLH1基因错义突变Val384Asp，而在样本量更大的德国人大肠癌患者未检出这一突变。结合3个民族的正常人群样本检测结果发现，错义突变Val 384 Asp可能是东亚人群hMLH1基因上的一个多态位点(已见于中国人、日本人)，一般人群中的等位基因频率约2.5%，即约5%的个体携带杂合型hMLH1基因Val384Asp，但可能极少见于欧洲人(已检测德国人)[8]。有种族分布差异的基因多态位点的发现可能在有关民族的迁移、人群的来源等人类学的研究中得到应用，同时某些基因多态位点的存在还可能和一定的疾病风险相联系。
hMLH1是细胞内错配修复系统的重要组成基因， 它的突变所导致的基因功能的丧失是HNPCC发病的主要原因之一[9]。然而，基因突变产生的结果较为复杂，有的突变并不影响基因的功能(无害突变)；有的突变可致基因产物的结构发生一定程度的改变而部分影响基因的功能，使机体对环境的“适应能力”降低，患病的风险增大(条件性致病)；有的突变可致基因完全失活(病理性突变)。因此在进行遗传性疾病的基因诊断过程中，对检出突变的评估是其中重要的一个环节[10，11]。不同物种的对比资料显示，Val384Asp不处于hMLH1基因的高度保守区内，有理由认为它的存在不会使基因完全失活。一般人群中约5%的个体携带Val384Asp(杂合型)也从另一角度证明这一错义突变不是“完全型”病理性突变。但第384位氨基酸残基是hMLH1基因相对可变区内的一个保守位点[4]，电中性的缬氨酸为带负电荷的天冬氨酸所替代可能会使基因产物的结构发生某种改变，从而影响到基因的功能。
, http://www.100md.com
Val384Asp病因学作用的确认最终要得到肿瘤遗传流行病学研究结果的支持。已有资料显示错配修复基因突变携带者大肠癌的发病年龄提前。HNPCC国际协作组将大肠癌发病年龄<50岁作为HNPCC临床诊断标准之一，我们在工作中也曾借用这一年龄标准将大肠癌患者分组研究[1，2，8]。然而，我国大肠癌流行病学一个非常显著的特征是发病年龄较欧美人群提前(平均提前5～10年)，这可能与多种因素有关。因此，研究Val384Asp对中国人大肠癌发病的影响，分组的年龄界限适当提前可能更符合中国人的特点。我们提出以45岁为界对大肠癌患者进行分组分析。我们知道，错配修复基因的突变在主要引起大肠癌发病的同时，亦可使突变基因携带者多种其它肿瘤的发病率增高，扩大观察范围将有助于确定hMLH1基因Val384Asp的性质。为此，我们选择了胃癌和尚无迹象表明其发病与错配修复基因的突变存在关系的食道癌患者，并同时观察他们的一级亲属。鉴于文献中报道的与错配修复基 因突变有关的胃癌往往和癌症家族史相联系，我们以有无癌症家族史对胃癌患者进行分组，并将这一分组的方法延用于食道癌患者以及胃癌和食道癌患者的一级亲属分析。结果表明，发病年龄<45岁的大肠癌患者中、具有癌症家族史的胃癌患者及其亲属中这一错义突变的检出率明显高于正常对照；而二组食道癌患者及其亲属与对照之间无显著差异。已经知道，绝大多数的大肠癌、胃癌病理属腺癌，而食道癌以鳞状上皮癌为主。起 源细胞的不同可能是食道癌患者及其亲属中未检出Val384Asp频率增高的原因。
, 百拇医药
多种因素(病因)、多种途径(过程)都可能最终导致肿瘤的发生。这不仅体现在不同器官的肿瘤之间，也体现在同种器官肿瘤的不同个体之间。然而在一种肿瘤中相同病因的个体，肿瘤的发病特征具有相似性[1，12]。这也是我们将癌症患者及其亲属hMLH1基因Val384Asp的检测结果进行分组分析的依据之一。我们的结果提示，错义突变Val384Asp将部分影响hMLH1基因的功能，在部分大肠癌、胃癌的发病中起到作用，并使突变基因携带者罹患大肠癌、胃癌的风险增高。另一方面，作为中国人hMLH1基因上的一个多态位点的检出，将可能为中国人大肠癌、胃癌发病因素的探讨及预防措施的设定提供有确切价值的信息，并可应用于患癌高风险人群的筛选。
基金项目：国家留学基金管理委员会研究项目(1998-003-21)和江苏省卫生厅重点项目(H9805)
参考文献
[1]de la Chapelle A,Peltomaki P.Genetics of hereditary colon cancer.Annu Rev Genet,1995,29∶329-348.
, 百拇医药
[2]Marra G,Boland CR.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer:the syndrome,the gene,and historical perspectives.J Natl Cancer Inst,1995,87∶1114-1125.
[3]Fishel R,Lescoe MK,Rao MRS,et al.The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colorectal cancer.Cell,1993,75∶1027-1038.
[4]Bronner CE,Baker SM,Morrison PT,et al.Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary nonpolyposis colon cancer.Nature,1994,368(6468)∶258-261.
, 百拇医药
[5]Nystrom-Lahti M,Wu Y,Moisio AL,et al.DNA mismatch repair gene mutations in 55 kindreds with verified or putative hereditary non-polyposis colorectal cancer.Hum Mol Genet,1996,5∶763-769.
[6]Wang YP,Friedl W,Lamberti Ch,et al.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer:causative role of a germline missense mutation in the hMLH1 gene confirmed by the independent occurrence of the same somatic mutation in tumor tissue.Hum Genet,1997,100∶362-364.
, 百拇医药
[7]Wang YP,Friedl W,Lamberti CH,et al.A novel missense mutation in the DNA mismatch repair gene hMLH1 present among East Asians but not among Europeans.Hum Hered,1998,48(2)∶87-91.
[8]Wang YP, Friedl W, Propping P, et al. Val 384Asp in hMLH1 gene in Chinese, Japanese and German and its etiological role in colorectal cancer. Chin J Med Genet,1998,15(1)∶263-266.[王亚平，Friedl W,Propping P,et al.中国人、日本人和德国人中hMLH1基因Val384Asp的检测及在大肠癌发病中的作用.中华医学遗传学杂志，1998，15(1)∶263-266.]
, http://www.100md.com
[9]Han HJ,Maruyama M,Baba S,et al.Genomic structure of human mismatch repair gene,hMLH1,and its mutation analysis in patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer(HNPCC).Hum Mol Genet,1995,4∶237-242.
[10]Gayther SA,Mangion J,Russell P,et al.Variation of risks of breast and ovarian cancer associated with different germline mutations of the BRCA2 gene.Nature Genet,1997,15∶103-105.
[11]Dunlop MG,Farrington SM,Carothers AD,et al.Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations.Hum Mol Genet,1997,6∶105-110.
[12]Caldas C,Ponder BAJ.Cancer genes and molecular oncology in the clinic.Lancet,1997,349(Suppl 2)∶16-18.
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药
单位：王亚平(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；周建农(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；李忠佑(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；王建东(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；李金田(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；高长明(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)；高萍(210009 南京，江苏省肿瘤防治研究所)
关键词：hMLH1基因；错义突变；Val384Asp；病因学；消化道肿瘤
中华医学遗传学杂志000205 【摘要】 目的 探讨中国人中存在的错配修复基因hMLH1 Val384Asp在大肠癌、胃癌、食道癌发病中的作用。方法 中国汉族人101例大肠癌患者、79例胃癌患者、76例食道癌患者、79例和76例胃癌和食道癌患者的亲属、100名正常对照，各取正常体细胞，提取基因组DNA。PCR-SSCP和DNA序列分析技术检测hMLH1基因的第12外显子，比较分析Val384Asp的检出率。结果 6%的正常人携带hMLH1基因Val384Asp；小于45岁的大肠癌患者中hMLH1基因Val384Asp的检出率高于正常对照(P<0.05)；显著性差异还存在于具有癌症家族史的胃癌患者及其亲属与正常对照的比较(P<0.05和P<0.01)；食道癌患者及其亲属与正常对照之间的比较无显著差异(P>0.05)。结论 中国汉族人中hMLH1基因Val384Asp等位基因频率约3%，这一错义突变可能在中国人部分大肠癌、胃癌的发病中起作用。
, http://www.100md.com
One of the etiological factors of digestive tract cancers in Chinese: the missense mutation Val384Asp in the hMLH1 gene*
WANG Yaping ZHOU Jiannong LI Zhongyou WANG Jiandong LI Jintian GAO Changming
GAO Ping.
(Jiangsu Institute of Cancer Research, Nanjing, Jiangsu,210009 P.R. China. E-mail:wangyapn@jlonline.com)
【Abstract】 Objective To investigate the etiological role of Val384Asp in the hMLH1 gene, which may be a polymorphism in Chinese, in colorectal,gastric and esophageal cancers. Methods Genomic DNA extracted from normal tissues were subjected to analysis in exon 12 of the hMLH1 gene by single strand conformation polymorphism(SSCP) followed by DNA sequencing of aberrant bands in 101 colorectal, 79 gastric and 76 esophageal cancer patients; in 79 and 76 first degree relatives of gastric cancer and esophageal cancer patients respectively; and in 100 healthy control individuals. Results Six percent of Chinese healthy individuals were the carriers of Val384Asp in the hMLH1 gene. There were significant differences in the frequencies of Val384Asp in the hMLH1 gene between the patients with colorectal cancer at young age(<45 years) and the control individuals (P<0.05), and between the gastric cancer patients with family history, the first degree relatives and the control group (P<0.05 and P<0.01 respectively). No difference was found between the esophageal cancer patients, their relatives and healthy controls.Conclusion The alleles frequency of Val384Asp in the hMLH1 gene in Chinese is three percent. This missense mutation may play a part in the etiology of colorectal and gastric cancers in Chinese.
, 百拇医药
【Key words】 hMLH1 gene; missense mutation; Val384Asp; etiology; digestive tract cancers
遗传性非息肉性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)是一种遗传预置性(predisposition)疾病，呈常染色体显性遗传。在HNPCC家庭成员中，除大肠癌聚集发生外，胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等的发病亦明显高于一般人群[1，2]。近年来，HNPCC的发生与错配修复基因突变之间的关系得以确认[3，4]。通过在HNPCC患者中检测错配修复基因的突变，对HNPCC患者的家庭成员进行遗传咨询和基因诊断成为可能。对于已发现的某些突变，评价它的病因作用并不困难，如移码突变、无义突变，然而对于某些由单个碱基置换而导致的错义突变，有时难以确定其临床意义[5，6]。我们最近首先在大肠癌患者检出错配修复基因hMLH1遗传性(germline)错义突变Val384Asp，初步研究表明这一突变可能影响其携带者大肠癌的发病年龄[7，8]。为进一步探明hMLH1基因val384Asp的病因学作用，我们对不同消化道肿瘤患者及其亲属中hMLH1基因Val384Asp的存在状况进行了比较。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 检测的样本
1.1.1 大肠癌患者 101例大肠癌患者，男60例，女41例。1例符合HNPCC临床诊断标准，2例由家族性多发性结肠息肉病恶性转化而来，余为散发性大肠癌患者。发病年龄23～77岁，其中小于45岁的患者30例，大于或等于45岁的患者71例。每例患者取外周静脉血(61例)或手术切除的远离癌灶的正常组织(40例，病理排除癌细胞浸润)。
1.1.2 胃癌患者 79例胃癌患者，男58例，女21例，年龄30～79例。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者24例；无明确癌症家族史的患者55例。每例取外周静脉血。
1.1.3 食道癌患者 76例食道癌患者，男42例，女34例，年龄40～78岁。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者27例，无明确癌症家族史的患者49例。每例取外周静脉血。
, 百拇医药
1.1.4 癌症患者亲属的样本 每例胃癌、食道癌患者均随机取其1位健康亲属(父母、同胞或子女，一级亲属)的外周静脉血。胃癌患者的亲属，男58例，女21例，年龄6～70岁；食道癌患者的亲属，男58例，女18例，年龄14～75岁。
1.1.5 正常对照 100名对照为正常健康人，其一级亲属中无明确的癌症患者，男71例，女29例，年龄17～70岁。各取外周静脉血。
1.1.6 样本的民族及地区来源 检测的样本为中国汉族人。大肠癌患者为近三年来我所就诊的患者，主要来自江苏北部和西部地区， 安徽北部和东部地区；胃癌患者及其亲属、食道癌患者及亲属以及正常对照均取自江苏北部地区。
1.1.7 DNA提取 血样本以全血细胞提取DNA；组织样本研磨后，酚、氯仿法抽提DNA。
1.2 PCR-SSCP 每例样本均由1对引物特异性地扩增hMLH1基因第12外显子上游-4位碱基至第12外显子内第1251位碱基(216bp)。引物序列：5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′(上游)；5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′(下游)。
, 百拇医药
PCR反应体积25 μl，其中模板DNA 60 ng,4×dNTPs终浓度各0.2 mmol/L,MgCl2的浓度1.5 mmol/L,Taq酶1～1.5U。循环条件，94℃预变性5 min后，94℃40 s，55℃40 s，72℃60 s，35个循环周期，72℃延长10 min。取PCR产物6 μl加6 μl加样缓冲液，95℃变性5 min后立即置冰上，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE，电压70V，环境温度4℃，持续时间18～20 h。 电泳结束后凝胶用0.2%的硝酸银染色[6]。
1.3 DNA序列分析 SSCP分析出现异常带型的病例，相应的PCR产物直接测序(Amersham,Version 2.0 DNA Sequencing Kit)。
1.4 统计学方法 各组之间hMLH1基因Val384Asp检出率的比较、等位基因频率的比较及Odds Ratio(OR)值的计算采用Epi Info 6.04b统计软件。
, 百拇医药
2 结果
2.1 SSCP和DNA序列分析 100名正常对照者中6人出现异常电泳带型。相同的异常带型见于13/101的大肠癌患者、11/79的胃癌患者、7/76的食道癌患者、14/79的胃癌患者亲属和6/76的食道癌患者亲属(图1，表1)。DNA序列分析表明，这一异常带型的出现是由于hMLH1基因第12外显子内的第1151位碱基存在遗传性的碱基颠换(T→A，杂合型)，使该碱基所处的第384位密码子发生错义突变(GTT→GAT，Val384Asp,图2)。
2.2 分组分析 我们将大肠癌患者根据发病年龄(以45岁为界)分为两组；对胃癌、食道癌患者和胃癌患者亲属、食道癌患者亲属根据有无癌症家族史分别分为两组，计数Val384Asp的检出率(表2)。
2.3 统计分析的结果
2.3.1 3种消化道肿瘤患者组、2种肿瘤患者亲属组与健康人群比较 各肿瘤患者组、患者亲属组中hMLH1基因Val384Asp检出率分别与正常对照进行比较，结果仅胃癌患者亲属组与健康人群之间的差异具有显著性(P<0.05，表1)。
, http://www.100md.com
2.3.2 3种消化道肿瘤患者、2种肿瘤患者亲属分组后的组间比较 分组情况见表2。组间比较表明，胃癌患者亲属中具有癌症家族史的人群与无癌症家族史的人群之间具有显著差异(P<0.05，表2)。
2.3.3 大肠癌患者分组后与正常对照的比较 我们检出的hMLH1基因Val384Asp均为杂合型。我们以等位基因概念比较两组大肠癌患者中Val384Asp等位基因频率与健康人群的差异。结果表明，hMLH1基因Val384Asp在发病年龄较低(<45岁)的患者中检出率较高(P<0.05)；而发病年龄≥45岁的大肠癌患者中Val384Asp的检出率与正常对照之间无显著差异(P>0.05，表3)。
图1 hMLH1基因第12外显子的SSCP 1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异的SSCP带型
, http://www.100md.com
图2 hMLH1基因第12外显子序列分析 两例中国人大肠癌患者，携带hMLH1基因Val384Asp(杂合型)，箭头示存在于1151位碱基的颠换T→A，使384位密码子由GTT→GAT(Val384Asp)
Fig 1 SSCP of exon 12 in hMLH1 gene Lanes 1-4 and lanes 7-9 are the pattern of the wild genotypes； lanes 5,6 variant bands in two individuals who carry the missense mutation Val384Asp
Fig 2 Sequencing of exon 12 in hMLH1 gene Two colorectal cancer patients who carry missense mutation Val384Asp,arrows show a transversion T→A at nucleotide 1151
, 百拇医药
表1 各组中hMLH1基因Val384Asp的检出及与正常对照的比较*
Table 1 The comparison on the frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene between healthy individuals and investigated groups* Groups
(组 别)
Number of screening for Val384Asp
(Val384Asp检测人数)
P value
(P值)
, http://www.100md.com OR
Carriers
(携带者)
Non-carriers
(非携带者)
Total
(合计)
Healthy
(正常健康人)
6
94
100
CRC patients
, 百拇医药
(大肠癌患者)
13
88
101
0.097
2.31
GC patients
(胃癌患者)
11
68
79
0.073
2.53
, 百拇医药
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
14
65
79
0.014**
3.37
EC patients
(食道癌患者)
7
69
76
, 百拇医药
0.421
1.59
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
6
70
76
0.622
1.34
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；CRC：colorectal cancer;GC:gastric cancer;EC:esophageal cancer;**P<0.05
, 百拇医药
2.3.4 胃癌患者及其亲属与正常对照的比较 显著性差异存在于具有癌症家族史的胃癌患者与正常对照之间(P<0.05)、具有癌症家族史胃癌患者的亲属与正常对照之间(P<0.01，表3)。
2.3.5 食道癌患者及其亲属与对照的比较 两组食道癌患者及其亲属hMLH1基因Val384Asp的检出率与对照组之间均无显著差异(P>0.05，表3)。正常对照Val384Asp等位基因频率为3%(表3)。
表2 消化道肿瘤患者及其亲属分组后hMLH1基因Val384Asp检出率的组间比较*
Table 2 The comparison on the frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene between sub-groups in the investigated groups* Groups
, 百拇医药
(组 别)
Sub-groups
(分组)
Number of screening for Val384Asp
(Val384Asp检测人数)
P value
(P值)
Carriers
(携带者)
Non-carriers
(非携带者)
, 百拇医药
Total
(合计)
CRC patients
(大肠癌患者)
<45岁
≥45岁
6
7
24
64
30
71
0.198
, 百拇医药
GC patients
(胃癌患者)
CFH
NCFH
5
6
19
49
24
55
0.295
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
, 百拇医药
CFH
NCFH
8
6
16
49
24
55
0.021**
EC patients
(食道癌患者)
CFH
NCFH
, http://www.100md.com
2
5
25
44
27
49
1.000
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
CFH
NCFH
1
5
, 百拇医药
26
44
27
49
0.413
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；CFH：cancer family history(有癌症家族史)；NCFH：no cancer family history(无癌症家族史)；**P<0.05；the others are the same as in Table 1(相同内容见表1)表3 消化道肿瘤患者及其亲属中Val384Asp等位基因频率与正常对照之间的分层比较*
Table 3 The comparison on the alleles frequencies of Val384Asp in hMLH1 gene
, 百拇医药
between the sub-group of investigated cases and healthy controls* Groups
(组 别)
Sub-groups
(分组)
Codon in hMLH1gene**
(密码子)
P value
(P值)
OR
384GAT
, 百拇医药
384GTT
Total
Healthy
(正常对照)
6***
194
200
CRC patients
(大肠癌患者)
<45岁
≥45岁
6
, 百拇医药
7
54
135
60
142
0.034****
0.359
3.59
1.68
GC patients
(胃癌患者)
CFH
NCFH
, 百拇医药
5
6
43
104
48
110
0.041***
0.358
3.76
1.87
GC patient's relatives
(胃癌患者的亲属)
, 百拇医药
CFH
NCFH
8
6
40
104
48
110
0.001***
0.358
6.47
1.87
EC patients
, http://www.100md.com
(食道癌患者)
CFH
NCFH
2
5
52
93
54
98
0.679
0.514
1.24
1.74
, http://www.100md.com
EC patient's relatives
(食道癌患者的亲属)
CFH
NCFH
1
5
53
93
54
98
1.000
0.514
0.61
, 百拇医药
1.74
*Mantel-Haenszel test or Fisher's exact test(Mantel-Haenszel检验或Fisher精确检验)；**Number of alleles(等位基因数)；***The alleles frequency is three percent(等位基因频率为3%)；****P<0.05 or P<0.01;the others are the same as in Table 2(相同内容见表2)
3 讨论.
我们在已报道的工作中PCR扩增hMLH1基因第12外显子时用上游引物在第11内含子内[7]， PCR产物包括第11内含子的110个碱基，其中(TA)n、(T)n重复序列的多态性使其SSCP电泳带型亦呈现多态。这在客观上增加了待检DNA片段中突变的分析难度。本研究中，我们重新设计了引物序列，使PCR产物的5′端起始于第12外显子上游-4位点。PCR产物仅含4个属于第11内含子的碱基，避免了人群中广泛存在多态性的重复序列，SSCP电泳带型更易于进行突变分析。
, 百拇医药
我们在筛选错配修复基因遗传性突变的工作中，在中国人大肠癌患者重复检出hMLH1基因错义突变Val384Asp，而在样本量更大的德国人大肠癌患者未检出这一突变。结合3个民族的正常人群样本检测结果发现，错义突变Val 384 Asp可能是东亚人群hMLH1基因上的一个多态位点(已见于中国人、日本人)，一般人群中的等位基因频率约2.5%，即约5%的个体携带杂合型hMLH1基因Val384Asp，但可能极少见于欧洲人(已检测德国人)[8]。有种族分布差异的基因多态位点的发现可能在有关民族的迁移、人群的来源等人类学的研究中得到应用，同时某些基因多态位点的存在还可能和一定的疾病风险相联系。
hMLH1是细胞内错配修复系统的重要组成基因， 它的突变所导致的基因功能的丧失是HNPCC发病的主要原因之一[9]。然而，基因突变产生的结果较为复杂，有的突变并不影响基因的功能(无害突变)；有的突变可致基因产物的结构发生一定程度的改变而部分影响基因的功能，使机体对环境的“适应能力”降低，患病的风险增大(条件性致病)；有的突变可致基因完全失活(病理性突变)。因此在进行遗传性疾病的基因诊断过程中，对检出突变的评估是其中重要的一个环节[10，11]。不同物种的对比资料显示，Val384Asp不处于hMLH1基因的高度保守区内，有理由认为它的存在不会使基因完全失活。一般人群中约5%的个体携带Val384Asp(杂合型)也从另一角度证明这一错义突变不是“完全型”病理性突变。但第384位氨基酸残基是hMLH1基因相对可变区内的一个保守位点[4]，电中性的缬氨酸为带负电荷的天冬氨酸所替代可能会使基因产物的结构发生某种改变，从而影响到基因的功能。
, http://www.100md.com
Val384Asp病因学作用的确认最终要得到肿瘤遗传流行病学研究结果的支持。已有资料显示错配修复基因突变携带者大肠癌的发病年龄提前。HNPCC国际协作组将大肠癌发病年龄<50岁作为HNPCC临床诊断标准之一，我们在工作中也曾借用这一年龄标准将大肠癌患者分组研究[1，2，8]。然而，我国大肠癌流行病学一个非常显著的特征是发病年龄较欧美人群提前(平均提前5～10年)，这可能与多种因素有关。因此，研究Val384Asp对中国人大肠癌发病的影响，分组的年龄界限适当提前可能更符合中国人的特点。我们提出以45岁为界对大肠癌患者进行分组分析。我们知道，错配修复基因的突变在主要引起大肠癌发病的同时，亦可使突变基因携带者多种其它肿瘤的发病率增高，扩大观察范围将有助于确定hMLH1基因Val384Asp的性质。为此，我们选择了胃癌和尚无迹象表明其发病与错配修复基因的突变存在关系的食道癌患者，并同时观察他们的一级亲属。鉴于文献中报道的与错配修复基 因突变有关的胃癌往往和癌症家族史相联系，我们以有无癌症家族史对胃癌患者进行分组，并将这一分组的方法延用于食道癌患者以及胃癌和食道癌患者的一级亲属分析。结果表明，发病年龄<45岁的大肠癌患者中、具有癌症家族史的胃癌患者及其亲属中这一错义突变的检出率明显高于正常对照；而二组食道癌患者及其亲属与对照之间无显著差异。已经知道，绝大多数的大肠癌、胃癌病理属腺癌，而食道癌以鳞状上皮癌为主。起 源细胞的不同可能是食道癌患者及其亲属中未检出Val384Asp频率增高的原因。
, 百拇医药
多种因素(病因)、多种途径(过程)都可能最终导致肿瘤的发生。这不仅体现在不同器官的肿瘤之间，也体现在同种器官肿瘤的不同个体之间。然而在一种肿瘤中相同病因的个体，肿瘤的发病特征具有相似性[1，12]。这也是我们将癌症患者及其亲属hMLH1基因Val384Asp的检测结果进行分组分析的依据之一。我们的结果提示，错义突变Val384Asp将部分影响hMLH1基因的功能，在部分大肠癌、胃癌的发病中起到作用，并使突变基因携带者罹患大肠癌、胃癌的风险增高。另一方面，作为中国人hMLH1基因上的一个多态位点的检出，将可能为中国人大肠癌、胃癌发病因素的探讨及预防措施的设定提供有确切价值的信息，并可应用于患癌高风险人群的筛选。
基金项目：国家留学基金管理委员会研究项目(1998-003-21)和江苏省卫生厅重点项目(H9805)
参考文献
[1]de la Chapelle A,Peltomaki P.Genetics of hereditary colon cancer.Annu Rev Genet,1995,29∶329-348.
, 百拇医药
[2]Marra G,Boland CR.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer:the syndrome,the gene,and historical perspectives.J Natl Cancer Inst,1995,87∶1114-1125.
[3]Fishel R,Lescoe MK,Rao MRS,et al.The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colorectal cancer.Cell,1993,75∶1027-1038.
[4]Bronner CE,Baker SM,Morrison PT,et al.Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary nonpolyposis colon cancer.Nature,1994,368(6468)∶258-261.
, 百拇医药
[5]Nystrom-Lahti M,Wu Y,Moisio AL,et al.DNA mismatch repair gene mutations in 55 kindreds with verified or putative hereditary non-polyposis colorectal cancer.Hum Mol Genet,1996,5∶763-769.
[6]Wang YP,Friedl W,Lamberti Ch,et al.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer:causative role of a germline missense mutation in the hMLH1 gene confirmed by the independent occurrence of the same somatic mutation in tumor tissue.Hum Genet,1997,100∶362-364.
, 百拇医药
[7]Wang YP,Friedl W,Lamberti CH,et al.A novel missense mutation in the DNA mismatch repair gene hMLH1 present among East Asians but not among Europeans.Hum Hered,1998,48(2)∶87-91.
[8]Wang YP, Friedl W, Propping P, et al. Val 384Asp in hMLH1 gene in Chinese, Japanese and German and its etiological role in colorectal cancer. Chin J Med Genet,1998,15(1)∶263-266.[王亚平，Friedl W,Propping P,et al.中国人、日本人和德国人中hMLH1基因Val384Asp的检测及在大肠癌发病中的作用.中华医学遗传学杂志，1998，15(1)∶263-266.]
, http://www.100md.com
[9]Han HJ,Maruyama M,Baba S,et al.Genomic structure of human mismatch repair gene,hMLH1,and its mutation analysis in patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer(HNPCC).Hum Mol Genet,1995,4∶237-242.
[10]Gayther SA,Mangion J,Russell P,et al.Variation of risks of breast and ovarian cancer associated with different germline mutations of the BRCA2 gene.Nature Genet,1997,15∶103-105.
[11]Dunlop MG,Farrington SM,Carothers AD,et al.Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations.Hum Mol Genet,1997,6∶105-110.
[12]Caldas C,Ponder BAJ.Cancer genes and molecular oncology in the clinic.Lancet,1997,349(Suppl 2)∶16-18.
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药