DNA循环测序中一些常见影响因素的研究
作者：何云贵 房海燕 夏昆 夏家辉
单位：；何云贵(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；房海燕(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；夏昆(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；夏家辉(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)
关键词：DNA；循环测序；因素
中华医学遗传学杂志000216 【摘要】 目的 研究DNA循环测序中一些常见因素的影响。方法 对循环测序中模板、引物、测序反应条件及其产物的纯化等常见因素进行了比较研究。结果 测序模板浓度过低，则核苷酸曲线的信∶噪比小，甚至不出现荧光信号。模板浓度过高，判读的核苷酸长度降低；引物的长度、G+C含量及Tm值对测序结果无明显影响；模板中的离子对测序反应有抑制作用；改变变性、退火及延伸温度，以及加入二甲基亚砜(DMSO)或甘油对某些DNA模板的序列测定有较好的效果；测序反应产物纯化后如有残余的荧光染料，则会干扰测序仪对核苷酸的自动判读，但序列能进行人工校正。结论 序列质量与模板的纯度、浓度有明显的关系。对一些具有特殊结构DNA，调整循环反应条件或使用添加剂能获得较好测序结果；利用70%乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。
, 百拇医药
The influence of some factors on DNA cycle sequencing*
HE Yungui FANG Haiyan XIA Kun XIA Jiahui
(National Laboratory of Medical Genetics, Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R.China.E-mail:nlmglcy@public.cs.hn.cn)
【Abstract】 Objective To study the influence of some factors on DNA cycle sequencing. Methods The effects of DNA templates, primers,cycle sequencing reaction conditions as well as purification methods were comparatively analyzed. Results When the DNA concentration was low, the nucleotide curve showed low ratio of signal to noise, even there were no fluorescent signals. While DNA concentration was too high,the readable length of nucleotides was short. Ions in the DNA template could result in bad sequencing reaction. The Tm value, length and G+C content of primers had no obvious influences on sequencing reaction.The alteration of the denaturation,annealing and extension temperature,or the addition of dimethl sulfoxide or glycerin facilitated sequencing some DNA templates. The fluorescent residues in the purified products of the sequence reaction could interfere the automatic reading of the sequencer,but did not influence the manually proofreading of the sequence. Conclusion The purity and concentration of DNA templates are closely related to sequence data quality. The modification of reaction parameters and usage of additives can help to obtain good result of sequencing some DNA with certain structure. The use of 70% ethanol is recommended to precipitate the extension product.
, 百拇医药
【Key words】 DNA; cycle sequencing; factor
DNA测序是分子生物学中最常用的技术之一。DNA循环自动测序操作简单灵敏度高，对双链DNA包括PCR产物，各种大片段的基因组DNA、cDNA克隆均能得到较好的测序效果[1-3]。我们在研究中发现，要得到重复性高、背景低且有较长序列的核苷酸曲线图，除严格按照说明书的标准操作，严格控制测序中的各个环节如测序所用水、凝胶的质量甚至电泳所用玻璃的质量和清洁度外，DNA双链模板制备，测序用引物和循环反应条件均对测序结果有一定的影响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 测序的DNA标本 PCR产物为901 bp的包括全部间隙连接蛋白β-3基因(GJB3，Genbank AF052692)编码区序列；质粒cDNA模板由SB公司提供；插入子为13 kb的GJB5基因组DNA序列的Lamda DASH单克隆(长约45 kb)；PAC DNA全长为120 kb，含一长约100 kb的插入子(含Alu重复序列)。
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1.2 测序模板DNA和引物的获得 “压碎与浸泡”法按《分子克隆指南》说明进行[4]。按试剂盒(QIAGEN公司)使用手册纯化回收PCR反应产物、质粒DNA和噬菌体DNA。PAC DNA的提取和透析方法参照Genome System操作说明进行。测序用引物利用Oligo 1000M DNA合成仪(Beckman)合成。
1.3 测序反应
1.3.1 测序反应体系 参照PE公司ABI PrismTm BigDyeTm Terminator Cycles Sequencing Ready Reaction Kit的说明进行。
1.3.2 测序反应循环条件 (1)：96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环，然后4℃保存。(2)：95℃变性5 min后，95℃ 30 s，50℃ 30 s，70℃ 1 min，50个循环。(3)：96℃变性5 min后，25个循环：95℃ 30 s，50℃ 10 s，55℃ 4 min。
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1.3.3 测序反应产物纯化 (1)乙醇/乙酸钠沉淀法(按1.3.1中的kit说明书进行)；(2)70%乙醇沉淀法：反应物中加入70%乙醇至终浓度为60±3%，4000 r/min离心30 min后去上清，750 r/min倒转离心1 min，室温干燥10 min；(3)按Edge Biosystems公司说明用96-well Gel Filtration Block进行纯化。
1.4 电泳分析 ABI 377测序仪(分析软件，version 2.2)进行电泳。
2 结果
2.1 DNA模板与测序结果的关系 测序反应体系中模板浓度过大，得到可靠序列长度明显降低且核苷酸曲线在高峰值后迅速降低(图1)。模板量较低时(如10 μl反应体系中仅有10 ng以下PCR产物模板量)，同一区段核苷酸曲线峰的信∶噪比明显减小(达2∶1)，有时甚至得不到核苷酸荧光信号。在PAC DNA的测序中，利用VSWP millipore filter透析模板后曲线背景降低且有更长的可靠序列(450 bp,100%)。如果PCR反应的特异性较低，利用PCR纯化试剂盒纯化所得的模板测序时会出现序列曲线峰混杂(图2)、不能判读甚至不出现荧光信号的现象，而利用“压碎与浸泡”法切下目的条带，回收模板所测的序列有更高的成功率。
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图1 循环反应体系中模板量过多时测序反应曲线峰图
Fig 1 The trace sequencing with high DNA template concentration
图2 循环反应体系中模板质量差测序反应曲线峰图
Fig 2 The trace sequencing with DNA template of poor purity
2.2 测序用引物与测序结果的关系 从表1可看出，所用引物的长度、Tm值和GC含量可有较大范围的变动。我们利用加GC夹(长40mers)的引物对PCR产物测序时也能得到可判读序列(资料未列出)，表明引物的这三项参数与测序没有明显的关系。
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2.3 测序反应循环参数改变以及变性剂的加入与测序的关系 利用1.3.2中的条件能测定绝大部分的DNA序列，可判读的序列达500 bp以上。我们发现在测定含Alu重复序列的PAC DNA时，条件(1)不能得到可读序列(图3)，条件(2)能得到明显改善的DNA序列，而条件(3)和条件(1)的测序结果相似。但在测定另一富含GT的PAC DNA模板时发现条件(3)的效果最好(450 bp,100%)。另外，在测定含GT、GC丰富或大片段PAC DNA时，如果添加变性剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油至终浓度质量分数为0.05～0.10，则以添加甘油为佳，而DMSO无明显改善；二同时加入则对测序结果没有明显帮助，有时反而使核苷酸曲线峰的信∶噪比降低、或者所得序列长度下降。DMSO对测序结果影响的不稳定在PCR产物的测序中也可观察到。
表1 部分测序引物及可判读的核苷酸长度
Table 1 Parts of primers and the readable length of nucleotides Primer
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(引物)
Primer sequences
(引物序列)
Length:mer
(长度：mer)
Tm value(℃)
(Tm值)
G+C value(%)
(G+C含量)
Template
(模板)
Result(bp)
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(结果)
SP6
5′atttaggtgacactatag
18
48
33.3
plasmid cDNA
>450
M13R
5′caggaaacagctatgacc
18
54
, 百拇医药
50.0
plasmid cDNA
>450
λgt103′
5′gtggcttatgagtatttcttccaggg
26
76
46.1
phage DNA
>450
AT324
5′caggtaggcacggcccccaccag
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23
76
73.9
PCR products
>450
CX31g8
5′catgggctgggctgtccgaaggc
23
78
69.5
PCR products
>450
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B3-F9
5′aaagaacaactggtttgagaag
22
60
36.3
PAC DNA
>450
Tm Value(Tm值)＝(G+C)×4+(A+T)×2;plasmid(质粒)；phage(噬菌体)；products(产物)
图3 利用循环反应条件(1)所测定的PAC DNA序列曲线峰图
, 百拇医药
Fig 3 The trace of PAC DNA sequencing with sequence reaction condition 1
2.4 3种测序产物纯化方法的比较 3种纯化方法中，利用方案(1)纯化测序反应产物，费时费力，而且未能充分去除的残余酒精经室温挥发后，残留的荧光染料在电泳时位于胶图上的1500点附近，在序列图上表现为宽度及高度均大大高于正常序列曲线峰一个干扰峰，且覆盖了正常序列曲线峰。虽然此干扰峰特征明显，但是测序仪不能识别正确序列，仅识别峰值高的干扰峰，人工判读时却可将正确的序列识别出来而不受干扰峰的影响。因此，此染料物质虽然不影响最终测序结果，但需人工进行判读校正自动测序结果。利用方案(3)纯化时，序列有时可从第1个碱基准确读起，但如果不进行大规模测序，则是不经济的。据我们的经验，70%乙醇沉淀法是首选的方法，效果好且经济，缺点是必须有类似4-15C(Sigma公司)类型的离心机设备。
3 讨论
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我们在测序中发现模板的浓度、纯度，模板自身的序列结构与测序有直接的关系。PCR纯化试剂盒纯化PCR产物时，如果不控制PCR反应的特异性，回收的模板用来测序通常得不到理想的结果。同样在PAC DNA的测序中，对比透析前后的测序核苷酸曲线峰图，可以发现，由于经过透析除去异丙醇沉淀处理时共沉淀下来的金属离子，同一区段的测序质量明显改善，具体表现为信∶噪比的提高和可判读的长度的增加。
测序引物长度短、GC含量低而引起其退火温度过低在测序中均会引起很弱的序列荧光信号、甚至没有信号的出现。但是我们发现引物的这些参数均有较大的变动范围。如果设计用来测序的引物，在排除引物自身的互补回文结构外，其长度不必太长，因为引物的合成率随长度增加而降低，而成本价格则升高。
在对含有某些重复序列或GT、GC含量较高或者具有某些特定二级结构的DNA模板序列的测定时常会遇到困难。我们通过改变变性、退火和延伸温度，增加循环周期数，或在反应体系中加入变性剂等来使DNA模板得以解链、双链线性化等来克服模板所带来的问题。另外，我们比较了测序反应产物的3种不同纯化方法后认为，利用70%乙醇纯化法是首选测序反应产物纯化方法。总的说来，虽然目前DNA循环自动测序是一应用普遍而操作简单的分子生物学技术，按照说明书的标准操作就能测定绝大部分DNA序列。但总结DNA测序中各种影响因素的作用，对测定一些具特异二级结构的DNA模板，解决测序中常见的问题并避免其反复发生具有参考价值。
, 百拇医药
基金项目：“863”计划(Z19-02-02-02)资助
参考文献
[1]Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, et al.DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci, 1988,85(24)∶9436-9640.
[2]Chen Q, Neville C, Mackenzie A, et al. Automated DNA sequencing requiring no DNA template purification. Biotechniques, 1996,21(3)∶453-457.
, 百拇医药
[3]Xiao CY, Zhang SZ, Wu H, et al.The influence of several factors on automated DNA sequencing. Chin J Med Genet, 1998,15(4)∶238-241.〔肖翠英，张思仲，武辉，等.DNA自动测序中几种影响因素的研究.中华医学遗传学杂志，1997，15(4)∶238-241.〕
[4]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis TM. eds. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Isolation of DNA Fragments from Polyaerylamide Gels. Cold Spring Harbor, New York:CSH Laboratory Press,1989.6.46-6.48.〔萨姆布鲁克等著，金冬雁等译.从聚丙烯酰胺中分离DNA片段.刘安等.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社.1996.332-333.〕
收稿日期：1999-06-10, 百拇医药
单位：；何云贵(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；房海燕(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；夏昆(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；夏家辉(410078长沙，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)
关键词：DNA；循环测序；因素
中华医学遗传学杂志000216 【摘要】 目的 研究DNA循环测序中一些常见因素的影响。方法 对循环测序中模板、引物、测序反应条件及其产物的纯化等常见因素进行了比较研究。结果 测序模板浓度过低，则核苷酸曲线的信∶噪比小，甚至不出现荧光信号。模板浓度过高，判读的核苷酸长度降低；引物的长度、G+C含量及Tm值对测序结果无明显影响；模板中的离子对测序反应有抑制作用；改变变性、退火及延伸温度，以及加入二甲基亚砜(DMSO)或甘油对某些DNA模板的序列测定有较好的效果；测序反应产物纯化后如有残余的荧光染料，则会干扰测序仪对核苷酸的自动判读，但序列能进行人工校正。结论 序列质量与模板的纯度、浓度有明显的关系。对一些具有特殊结构DNA，调整循环反应条件或使用添加剂能获得较好测序结果；利用70%乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。
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The influence of some factors on DNA cycle sequencing*
HE Yungui FANG Haiyan XIA Kun XIA Jiahui
(National Laboratory of Medical Genetics, Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R.China.E-mail:nlmglcy@public.cs.hn.cn)
【Abstract】 Objective To study the influence of some factors on DNA cycle sequencing. Methods The effects of DNA templates, primers,cycle sequencing reaction conditions as well as purification methods were comparatively analyzed. Results When the DNA concentration was low, the nucleotide curve showed low ratio of signal to noise, even there were no fluorescent signals. While DNA concentration was too high,the readable length of nucleotides was short. Ions in the DNA template could result in bad sequencing reaction. The Tm value, length and G+C content of primers had no obvious influences on sequencing reaction.The alteration of the denaturation,annealing and extension temperature,or the addition of dimethl sulfoxide or glycerin facilitated sequencing some DNA templates. The fluorescent residues in the purified products of the sequence reaction could interfere the automatic reading of the sequencer,but did not influence the manually proofreading of the sequence. Conclusion The purity and concentration of DNA templates are closely related to sequence data quality. The modification of reaction parameters and usage of additives can help to obtain good result of sequencing some DNA with certain structure. The use of 70% ethanol is recommended to precipitate the extension product.
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【Key words】 DNA; cycle sequencing; factor
DNA测序是分子生物学中最常用的技术之一。DNA循环自动测序操作简单灵敏度高，对双链DNA包括PCR产物，各种大片段的基因组DNA、cDNA克隆均能得到较好的测序效果[1-3]。我们在研究中发现，要得到重复性高、背景低且有较长序列的核苷酸曲线图，除严格按照说明书的标准操作，严格控制测序中的各个环节如测序所用水、凝胶的质量甚至电泳所用玻璃的质量和清洁度外，DNA双链模板制备，测序用引物和循环反应条件均对测序结果有一定的影响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 测序的DNA标本 PCR产物为901 bp的包括全部间隙连接蛋白β-3基因(GJB3，Genbank AF052692)编码区序列；质粒cDNA模板由SB公司提供；插入子为13 kb的GJB5基因组DNA序列的Lamda DASH单克隆(长约45 kb)；PAC DNA全长为120 kb，含一长约100 kb的插入子(含Alu重复序列)。
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1.2 测序模板DNA和引物的获得 “压碎与浸泡”法按《分子克隆指南》说明进行[4]。按试剂盒(QIAGEN公司)使用手册纯化回收PCR反应产物、质粒DNA和噬菌体DNA。PAC DNA的提取和透析方法参照Genome System操作说明进行。测序用引物利用Oligo 1000M DNA合成仪(Beckman)合成。
1.3 测序反应
1.3.1 测序反应体系 参照PE公司ABI PrismTm BigDyeTm Terminator Cycles Sequencing Ready Reaction Kit的说明进行。
1.3.2 测序反应循环条件 (1)：96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环，然后4℃保存。(2)：95℃变性5 min后，95℃ 30 s，50℃ 30 s，70℃ 1 min，50个循环。(3)：96℃变性5 min后，25个循环：95℃ 30 s，50℃ 10 s，55℃ 4 min。
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1.3.3 测序反应产物纯化 (1)乙醇/乙酸钠沉淀法(按1.3.1中的kit说明书进行)；(2)70%乙醇沉淀法：反应物中加入70%乙醇至终浓度为60±3%，4000 r/min离心30 min后去上清，750 r/min倒转离心1 min，室温干燥10 min；(3)按Edge Biosystems公司说明用96-well Gel Filtration Block进行纯化。
1.4 电泳分析 ABI 377测序仪(分析软件，version 2.2)进行电泳。
2 结果
2.1 DNA模板与测序结果的关系 测序反应体系中模板浓度过大，得到可靠序列长度明显降低且核苷酸曲线在高峰值后迅速降低(图1)。模板量较低时(如10 μl反应体系中仅有10 ng以下PCR产物模板量)，同一区段核苷酸曲线峰的信∶噪比明显减小(达2∶1)，有时甚至得不到核苷酸荧光信号。在PAC DNA的测序中，利用VSWP millipore filter透析模板后曲线背景降低且有更长的可靠序列(450 bp,100%)。如果PCR反应的特异性较低，利用PCR纯化试剂盒纯化所得的模板测序时会出现序列曲线峰混杂(图2)、不能判读甚至不出现荧光信号的现象，而利用“压碎与浸泡”法切下目的条带，回收模板所测的序列有更高的成功率。
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图1 循环反应体系中模板量过多时测序反应曲线峰图
Fig 1 The trace sequencing with high DNA template concentration
图2 循环反应体系中模板质量差测序反应曲线峰图
Fig 2 The trace sequencing with DNA template of poor purity
2.2 测序用引物与测序结果的关系 从表1可看出，所用引物的长度、Tm值和GC含量可有较大范围的变动。我们利用加GC夹(长40mers)的引物对PCR产物测序时也能得到可判读序列(资料未列出)，表明引物的这三项参数与测序没有明显的关系。
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2.3 测序反应循环参数改变以及变性剂的加入与测序的关系 利用1.3.2中的条件能测定绝大部分的DNA序列，可判读的序列达500 bp以上。我们发现在测定含Alu重复序列的PAC DNA时，条件(1)不能得到可读序列(图3)，条件(2)能得到明显改善的DNA序列，而条件(3)和条件(1)的测序结果相似。但在测定另一富含GT的PAC DNA模板时发现条件(3)的效果最好(450 bp,100%)。另外，在测定含GT、GC丰富或大片段PAC DNA时，如果添加变性剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油至终浓度质量分数为0.05～0.10，则以添加甘油为佳，而DMSO无明显改善；二同时加入则对测序结果没有明显帮助，有时反而使核苷酸曲线峰的信∶噪比降低、或者所得序列长度下降。DMSO对测序结果影响的不稳定在PCR产物的测序中也可观察到。
表1 部分测序引物及可判读的核苷酸长度
Table 1 Parts of primers and the readable length of nucleotides Primer
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(引物)
Primer sequences
(引物序列)
Length:mer
(长度：mer)
Tm value(℃)
(Tm值)
G+C value(%)
(G+C含量)
Template
(模板)
Result(bp)
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(结果)
SP6
5′atttaggtgacactatag
18
48
33.3
plasmid cDNA
>450
M13R
5′caggaaacagctatgacc
18
54
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50.0
plasmid cDNA
>450
λgt103′
5′gtggcttatgagtatttcttccaggg
26
76
46.1
phage DNA
>450
AT324
5′caggtaggcacggcccccaccag
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23
76
73.9
PCR products
>450
CX31g8
5′catgggctgggctgtccgaaggc
23
78
69.5
PCR products
>450
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B3-F9
5′aaagaacaactggtttgagaag
22
60
36.3
PAC DNA
>450
Tm Value(Tm值)＝(G+C)×4+(A+T)×2;plasmid(质粒)；phage(噬菌体)；products(产物)
图3 利用循环反应条件(1)所测定的PAC DNA序列曲线峰图
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Fig 3 The trace of PAC DNA sequencing with sequence reaction condition 1
2.4 3种测序产物纯化方法的比较 3种纯化方法中，利用方案(1)纯化测序反应产物，费时费力，而且未能充分去除的残余酒精经室温挥发后，残留的荧光染料在电泳时位于胶图上的1500点附近，在序列图上表现为宽度及高度均大大高于正常序列曲线峰一个干扰峰，且覆盖了正常序列曲线峰。虽然此干扰峰特征明显，但是测序仪不能识别正确序列，仅识别峰值高的干扰峰，人工判读时却可将正确的序列识别出来而不受干扰峰的影响。因此，此染料物质虽然不影响最终测序结果，但需人工进行判读校正自动测序结果。利用方案(3)纯化时，序列有时可从第1个碱基准确读起，但如果不进行大规模测序，则是不经济的。据我们的经验，70%乙醇沉淀法是首选的方法，效果好且经济，缺点是必须有类似4-15C(Sigma公司)类型的离心机设备。
3 讨论
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我们在测序中发现模板的浓度、纯度，模板自身的序列结构与测序有直接的关系。PCR纯化试剂盒纯化PCR产物时，如果不控制PCR反应的特异性，回收的模板用来测序通常得不到理想的结果。同样在PAC DNA的测序中，对比透析前后的测序核苷酸曲线峰图，可以发现，由于经过透析除去异丙醇沉淀处理时共沉淀下来的金属离子，同一区段的测序质量明显改善，具体表现为信∶噪比的提高和可判读的长度的增加。
测序引物长度短、GC含量低而引起其退火温度过低在测序中均会引起很弱的序列荧光信号、甚至没有信号的出现。但是我们发现引物的这些参数均有较大的变动范围。如果设计用来测序的引物，在排除引物自身的互补回文结构外，其长度不必太长，因为引物的合成率随长度增加而降低，而成本价格则升高。
在对含有某些重复序列或GT、GC含量较高或者具有某些特定二级结构的DNA模板序列的测定时常会遇到困难。我们通过改变变性、退火和延伸温度，增加循环周期数，或在反应体系中加入变性剂等来使DNA模板得以解链、双链线性化等来克服模板所带来的问题。另外，我们比较了测序反应产物的3种不同纯化方法后认为，利用70%乙醇纯化法是首选测序反应产物纯化方法。总的说来，虽然目前DNA循环自动测序是一应用普遍而操作简单的分子生物学技术，按照说明书的标准操作就能测定绝大部分DNA序列。但总结DNA测序中各种影响因素的作用，对测定一些具特异二级结构的DNA模板，解决测序中常见的问题并避免其反复发生具有参考价值。
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基金项目：“863”计划(Z19-02-02-02)资助
参考文献
[1]Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, et al.DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci, 1988,85(24)∶9436-9640.
[2]Chen Q, Neville C, Mackenzie A, et al. Automated DNA sequencing requiring no DNA template purification. Biotechniques, 1996,21(3)∶453-457.
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[3]Xiao CY, Zhang SZ, Wu H, et al.The influence of several factors on automated DNA sequencing. Chin J Med Genet, 1998,15(4)∶238-241.〔肖翠英，张思仲，武辉，等.DNA自动测序中几种影响因素的研究.中华医学遗传学杂志，1997，15(4)∶238-241.〕
[4]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis TM. eds. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Isolation of DNA Fragments from Polyaerylamide Gels. Cold Spring Harbor, New York:CSH Laboratory Press,1989.6.46-6.48.〔萨姆布鲁克等著，金冬雁等译.从聚丙烯酰胺中分离DNA片段.刘安等.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社.1996.332-333.〕
收稿日期：1999-06-10, 百拇医药