细胞松弛素B对多头绒泡菌有丝分裂的影响
作者：宋朝霞 邢苗 曾宪录
单位：深圳大学生物工程系，深圳 518060
关键词：肌动蛋白；细胞松弛素B；多头绒泡菌；有丝分裂周期
遗传学报000114
摘要：将细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)注入同步化的多头绒泡菌原质团，在光镜和电镜下跟踪观察其有丝分裂进程，发现多头绒泡菌进入有丝分裂的时间推迟，与未经CB处理的样品相比，在S期注入CB的样品进入有丝分裂的时间推迟35min；在G2早期注入CB的样品则推迟20min；在G2中期注入的推迟45min；在G2晚期注入的推迟60min，说明抑制肌动蛋白的功能则使有丝分裂受到明显影响。CB处理样品进入有丝分裂后的整个时间进程和核结构的动态变化与未经CB处理的基本相同，表明CB处理对有丝分裂的影响可能主要是推迟有丝分裂的启动。在G2晚期进行CB处理对有丝分裂启动的影响最为明显，说明在多头绒泡菌G2晚期可能存在着有丝分裂的检验点。
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中图分类号：Q343 文献标识码：A
文章编号：0379-4172(2000)01-0083-0089
Effects of Cytochalasin B upon Mitosis of Physarum polycephalum
SONG Zhao-Xia，XING Miao，ZENG Xian-Lu
(Shenzhen University,Shenzhen 518060,China)
Abstract:Cytochalasin B,known as a functional inhibitor of actin,was microinjected into naturally synchronous plasmodia of Physarum polycephalum,and the mitotic behaviours of both CB-treated specimens and the control were examined with light and electron microscopy.Mitosis in the CB-treated specimens began about 20 to 60 minutes later than that of the control.It was delayed 35 minutes in the specimens treated with CB in the S phase of the cell cycle,and the delayed time was 20 minutes and 45 minutes,respectively.In the specimens treated with CB in early and middle G2 phase,the longest delay was 60 minutes found in the specimens treated in late G2 phase,indicating that mitosis was affected in Physarum polycephalum when the function of actin was inhibited by CB treatment.The CB-treated specimens and the control showed similarities in the process of mitosis and dynamic changes of nuclear structures,suggesting that the main effect of CB treatment upon mitosis may be to delay the triggering of the mitosis.
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Key words:Actin;cytochalasin B；mitotic cycle; Physarum polycephalum
细胞松弛素(Cytochalasins)是肌动蛋白聚合的抑制剂，结合在F-肌动蛋白的正(+)端，阻止F-肌动蛋白的功能[9].研究者们用细胞松弛素B或D(Cytochalasin B,CB; Cytochalasin D,CD)或二氢细胞松弛素B(Dihydrocytochalasin B， DCB)对肌动蛋白的功能进行研究[10，11，16]，发现在细胞质中肌动蛋白构成细胞骨架的微丝，与胞质流动、变形运动、细胞形态的维持、细胞膜的动态变化、细胞器的运动等多种生命活动有关[12，17]。在细胞核中肌动蛋白可能与细胞核的定位和定向移动[10]、胞质分裂时分裂沟的形成[11]、多线染色体结构的维系等有关[13]。用注射抗肌动蛋白抗体或肌动蛋白结合蛋白的方法得到的结果表明，肌动蛋白可影响染色体的集缩，染色体结构状态的调整及基因转录[9]。关于肌动蛋白是否参与细胞周期调控的研究报道还很少。
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多头绒泡菌属粘菌门绒泡菌科。其生活史包括单细胞的变形虫，多核的原质团和孢子形成等阶段。直径为5～6cm的原质团包含大约108个细胞核，这些细胞核在自然条件下进行高度同步的核内有丝分裂，因此多头绒泡菌是研究细胞周期生化事件的理想材料[14]。曾宪录等人证明多头绒泡菌细胞核中存在肌动蛋白[7]。为了进一步研究肌动蛋白的功能，本文将细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)注射到同步化的多头绒泡菌原质团中，在光学和电子显微镜下对CB处理组和对照组样品的有丝分裂过程进行了观察，发现CB处理可推迟细胞进入有丝分裂的时间。
1 材料和方法
1.1 菌株 多头绒泡菌(Physarum polycephalum)菌株TU291由法国利母慈大学细胞生物学实验室 Philipe Albert博士惠赠。
1.2 培养基 MSD培养基。A液：柠檬酸3.54g；FeCl2.4H2O 0.06g；KH2PO4 0.2g；MgSO4.7H2O 0.6g；MnCl2.4H2O 0.084g；ZnSO4.7H2O 0.04g；CaCl2.2H2O 0.6g；胰蛋白10g。用30%KOH调pH至4.6，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌后4℃保存。B液：高铁血红素0.05g溶于100ml 1% NaOH中，高压灭菌后4℃保存。使用时，按0.3ml A液+20ml B液的比例混合。
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1.3 多头绒泡菌的悬浮培养 按照DanielⅠ[15]的方法，在250ml锥形瓶中，加入20ml MSD培养基，1ml菌液。24℃～26℃摇床培养，每3天继代1次。
1.4 多头绒泡菌的同步化培养 在直径为12cm的培养皿中进行同步化培养。将滤纸置于铺满玻璃珠的培养皿中，高压灭菌。离心收集悬浮培养的微原质团，经无菌蒸馏水洗涤后，铺于滤纸中央，26℃培养2h后，加入13ml左右MSD培养基。26℃暗培养16h左右。此时达到完全同步化。
1.5 细胞松弛素B(CB)处理 在细胞周期的第2、4、6、8h分别切下相等面积(2cm×1cm)的长有原质团的滤纸条，用显微操作仪向原质团注射CB溶液(1mmol/L，用2%二甲基亚砜DMSO配制)，每个原质团注射CB溶液2μl，约含CB1.0μg。注射后将原质团放入培养皿中继续培养。对照组样品中注射同体积的2%DMSO。
, http://www.100md.com 1.6 对多头绒泡菌细胞周期的光镜观察 跟踪CB处理组和对照组的细胞周期进程，每5～10min取材1次。卡宝品红染色，压片，OLYMPUS显微镜观察，照相。
1.7 对多头绒泡菌细胞周期的电镜观察 将CB处理组和对照组G2晚期、有丝分裂早前期、前期及中期的样品置于2.5%戊二醛固定液中固定12h。0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次30min。1%锇酸中后固定2h，双蒸水洗3次，每次20min。乙醇-丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋，包埋
块用LKB-5型超薄切片机切片。切片经醋酸铀-柠檬酸铅染色，Hitachti-600型透射电子显微镜下观察、照相。
2 结果
2.1 细胞松弛素B对多头绒泡菌细胞周期的影响 多头绒泡菌细胞周期由S期、G2期和M期组成，没有G1期。我们将M期/S期交界处的时间定为0h；S期的时长为3h，时间为0至第3h；G2期的时长为6h，时间为第3至第9h；M期时长为1h，时间为第9至第10h(图1)。
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图1 多头绒泡菌细胞周期
Fig.1 The cell cycle of Physarum polycephlum
在细胞周期的第2h(S期)、4h(G2早期)、6h(G2中期)和8h(G2晚期)将CB分别注入不同的原质团，对不同时间组的CB处理样品和对照组样品进行光镜跟踪观察，发现CB处理样品比对照组晚20～60min进入有丝分裂期。现以在G2晚期注入CB这一时间组为例说明如下。
注入CB时，核仁位于细胞核中央，染色较浅且均匀，染色质位于核仁周围(图版I-A)。对照样品处于有丝分裂早期前时(进入有丝分裂约10min)，核仁出现侧偏(图版I-B)；此时实验组仍处于G2晚期。进入有丝分裂约30min时，对照组进入前期，核仁移至边缘并开始解体，染色质松散；此时实验组核仁仍位于核中央即处于G2晚期(图版I-C1和C2)。60min时，对照组核仁消失，染色质集缩，出现染色体轮廓，进入早中期；实验组进入早前期，核仁偏移(图版I-D1和D2)。65min时，对照组为中期，染色体排列于赤道板上；实验组进入前期，核仁移至核的边缘并开始解体，染色质松散(图版I-E1和E2)。70min时，对照组进入后期和末期(后期和末期时间很短，仅为6min左右)，随即形成两个子细胞核(图版I-F)。115min时，实验组进入早中期(图版I-G)。120min时，实验组进入中期(图版I-H)。130min，实验组进入后期和末期(图版I-I)。与对照样品相比，在G2晚期注入CB的实验样品进入有丝分裂的时间推迟约60min。
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在多头绒泡菌细胞周期不同时间点注射CB所造成的时间推迟的程度不同。与对照组相比，S期注入CB，进入有丝分裂的时间推迟35min左右；G2早期注入，有丝分裂推迟20min左右；G2中期注入，推迟45min左右(表1)。
表1 CB对多头绒泡菌有丝分裂的迟滞效应
Table 1 Delay of entry into mitosis caused by Cytochalasin B in Physarum polycephlum CB注射时间
Time in cell
cycle when CB
is microinjected(h)
注射时细胞
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周期时相
Phase in cell
cycle when CB
is microinject
microinjected
对照组进入
M期时间
Time of entry
into mitotic
phase in
control(h)
, 百拇医药
实验组进入
M期时间
Time of entry into
mitotic phase in
CB treated
pecimens(h)+(min)
延迟时间
Delay(min)
2.0
S期
S phase
9.0
, 百拇医药
9.0+35
35
4.0
G2早期early
G2 phase
9.0
9.0+20
20
6.0
G2中期
middle
G2 phase
9.0
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9.0+45
45
8.0
G2晚期
late
G2 phase
9.0
9.0+60
60
2.2 CB处理样品和对照样品的细胞核超微结构 对G2晚期、有丝分裂早前期、前期及中期的CB处理样品和对照样品的细胞核进行了电镜观察，发现二者的超微结构在上述各个时相均无明显差别。在G2晚期，核仁位于细胞核中部，染色质呈密集团块状位于核仁周围的核质中(图版II-A1和A2)。中期时，由染色质集缩形成的染色体排列于赤道板上(图版II-B1和B2)。多头绒泡菌行核内有丝分裂，因此在中期时细胞核仍保持完整，核膜清晰可见(图版II-B1和B2)。CB处理样品的中期细胞核切面为侧面观，可见清晰的纺锤体结构，染色体位于纺锤体中，排列于赤道板上，纺锤体的微管汇于两极(图版II-B2)。对照样品中期细胞核切面为极面观，未见到纺锤体结构，只观察到排列于赤道板上的染色体(图版II-B1)。
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3 讨论
肌动蛋白存在于动物、植物的细胞核和染色体(染色质)中[1～6]，是细胞核或染色体骨架的组成成分之一[7]。有关肌动蛋白在细胞核中的功能研究还不多。Lestourgeon等人观察到，当细胞核体积增加或核内染色体集缩时肌动蛋白的含量增加，因此认为肌动蛋白可能参与染色质多种结构状态的维持和调节过程[4]。Rugger等人发现将抗肌动蛋白抗体注射入非洲爪蟾卵母细胞可抑制染色体的集缩过程，因此认为肌动蛋白与染色体集缩有关[8]。Scheer等人发现将抗肌动蛋白抗体或肌动蛋白结合蛋白注射入细胞可引起灯刷染色体侧环收缩，因此推测肌动蛋白与灯刷染色体侧环伸展和基因转录有关[9]。还有一些研究结果表明，肌动蛋白可能与细胞核的定位和定向移动[10]、胞质分裂时分裂沟的形成[11]、染色体的运动[12]、多线染色体结构的维系[13]等有关。关于肌动蛋白是否参与其他一些细胞生命活动过程(如细胞分裂周期的调控、细胞分化等)，目前的研究报道还很少。
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本文观察到经CB处理的多头绒泡菌细胞核进入有丝分裂的时间迟于对照组，这表明一旦肌动蛋白的功能被抑制，多头绒泡菌有丝分裂就受到明显的影响。在有丝分裂周期各个时相(S期、G2早期、G2中期和G2晚期)进行CB处理的样品中，前期到中期的时间以及中期到后末期的时间与对照组的基本相同。另外，对照样品在有丝分裂过程中发生核仁偏移和解体、染色体集缩、染色体排列在赤道板上以及向两极移动等变化，CB处理样品中也发生同样的变化。这说明CB对多头绒泡菌有丝分裂周期的影响主要在有丝分裂的启动上，即肌动蛋白可能与有丝分裂的启动有关，而CB处理使有丝分裂的启动受阻。
本文在细胞周期的不同时相将CB注入多头绒泡菌原质团，发现CB对有丝分裂启动的影响程度与注射CB时多头绒泡菌所处的细胞周期时相有关，在G2晚期时进行CB处理对有丝分裂启动的影响最为明显。这种CB效应的细胞周期时相依赖性说明，多头绒泡菌的G2晚期可能存在着有丝分裂启动的关键点或检验点。Belyavsky和Sauer指出多头绒泡菌有丝分裂周期中可能存在两个检验点，一个在进入S期后的1h左右，另一个则在G2晚期[18]。在这两个检验点进行处理，会导致有丝分裂的加速或延迟。本文根据CB处理和细胞学观察结果做出的关于检验点的推测与上述作者根据生化分析结果提出的有关观点[18]是一致的。
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关于CB抑制肌动蛋白的功能为什么会影响有丝分裂的启动，目前还不清楚。有关细胞周期调控的研究结果表明，有丝分裂促进因子(mitotic promoting factor,MPF)由起催化作用的亚单位CDK(如p34cdc2)和起调控作用的亚单位周期素(cyclin)组成[19]，多头绒泡菌含有cdc2类似蛋白[20]，这种蛋白的活化至少需要DNA复制和细胞骨架构建等两个关键信号[21]，p34cdc2是组蛋白H1激酶的亚单位之一，而组蛋白Hl的磷酸化与染色体集缩偶联[18]。根据上述研究结果和肌动蛋白是收缩蛋白的特点，我们推测，染色体集缩可能是多头绒泡菌中cdc2活化的另一个关键信号，当CB处理抑制肌动蛋白的功能时，可能导致染色体集缩过程受阻，从而抑制了组蛋白H1的磷酸化以及cdc2的活化，进而使有丝分裂的启动推迟。这一推测还有待于进一步的实验来验证。
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图版说明
图版I
细胞松弛素B对多头绒泡菌细胞周期的影响×2200。
A：在G2晚期注射CB时多头绒泡菌原质团细胞核的形态。
经卡宝品红染色着色较浅的核仁，位于细胞核(箭头)中央。
着色较深的染色质颗粒位于核仁周边；
B：对照样品早前期的细胞核。核仁(箭头)偏移；
C1：对照样品的前期细胞核。核仁(箭头a)
移至细胞核边缘并开始解体，染色质(箭头b)松散；
, http://www.100md.com C2：CB处理样品。核仁位于G2晚期的细胞核(箭头)中央；
D1：早中期的对照样品细胞核。箭头所示为染色体；
D2：CB处理的早前期细胞核样品。核仁(箭头)偏移；E1：对
照样品中期细胞核。染色体簇(箭头)排列于赤道板上；
E2：CB处理样品。核仁(箭头a)移至细胞核边缘并开始解体，染色质(箭头b)松散；F：对照样品后期(箭头a)和末期
(箭头b)细胞核；G：CB处理样品早中期细胞核。
箭头所示为初具轮廓的染色体；H：CB处理样品中期细胞核。染色体簇(箭头)
排列于赤道板上；I：CB处理样品后期和末期细胞核，箭头示末期
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Explanation of Plates
Plate I
Effects of cytochalasin B (CB) upon the mitotic cycle of
Physarum polycephalum.Stained with Carbol fuchsine.×2200.
A:Nuclei in late G2 phase when CB was microinjected into the plasmodia.
The nucleolus is located in the center of the nucleus (arrow) and chromatin granules
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are scattered around the nucleolus.The chromatin granules are stained heavilier
than the nucleolus; B:Nuclei of the control in early prophase.The nucleolus (arrow)migrates
to the periphery of the nucleus; C1:Nuclei of the control in prophase.
The nucleolus (arrow a.) is in disintegration,and the chromatin granules (arrow b)
become decondensed; C2:Nuclei of CB-treated specimens in G2 phase.
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The nucleolus is situated in the center of the nucleus (arrow);
D1:Nuclei of the control in pre-metaphase.Arrows shows chromosomes;
D2:Nuclei of CB-treated specimens in early prophase.The nucleolus (arrow) moves
to the nuclear periphery; E1:Nuclei of the control in metaphase.
Chromosomes are clustered and lined at the equatorial plate (arrows);
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E2:Nuclei of CB-treated specimens in prophase.The nucleolus (arrow a) is in
disintegration,and the chromatin granules (arrow b) become decondensed;
F:Nuclei of the control are in anaphase (arrow a) and telophase (arrow b);
G:Nuclei of CB-treated specimens in pre-metaphase.Arrows show chromosomes
in condensation; H:Nuclei of CB-treated specimens in metaphase
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.Arrows show chromosome clusters lining on equatorial plate;
I:Nuclei of CB-treated specimens in telophase.Two clusters of chromosomes
in one nucleus (arrows) are paralleled
图版II
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对照样品和CB处理样品的细胞核的超微结构×20000。
A1和A2：对照样品(A1)和CB处理样品(A2)
G2晚期细胞核的超微结构基本相同。核仁(a箭头)和
染色质团块(b箭头)的电子密度都很高。B1和B2：对照样品(B1)和
CB处理样品(B2)中期细胞核的超微结构基本相同。染色体簇(a箭头)
的电子密度较高，核仁消失，核膜(b箭头)依然存在。
CB处理样品为侧面观，纺锤体(c箭头)清晰可见
Plate II
Ultrastructure of nuclei in CB-treated specimens and control×20000.A1&A3：
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G2 phase nuclei in control (A1) and CB-treated specimens (A2) show similarity in ultrastructure.
The nucleoli (arrow a) and condensed chromatin (arrows b) are highly contrasted.
B1 & B2:Metaphase nuclei in control (B1) and CB-treated specimens (B2)
share common features in their ultrastructure.Nucleolus has disappeared,chromosome
,clusters (arrows a) are contrasted and the nuclear membrane (arrows b) still exists.
, 百拇医药
Spindle fibres (B2,arrow c) are clearly observed in the longitudinal section of the CB-treated nucleus.
参考文献
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Abstract:Cytochalasin B,known as a functional inhibitor of actin,was microinjected into naturally synchronous plasmodia of Physarum polycephalum,and the mitotic behaviours of both CB-treated specimens and the control were examined with light and electron microscopy.Mitosis in the CB-treated specimens began about 20 to 60 minutes later than that of the control.It was delayed 35 minutes in the specimens treated with CB in the S phase of the cell cycle,and the delayed time was 20 minutes and 45 minutes,respectively.In the specimens treated with CB in early and middle G2 phase,the longest delay was 60 minutes found in the specimens treated in late G2 phase,indicating that mitosis was affected in Physarum polycephalum when the function of actin was inhibited by CB treatment.The CB-treated specimens and the control showed similarities in the process of mitosis and dynamic changes of nuclear structures,suggesting that the main effect of CB treatment upon mitosis may be to delay the triggering of the mitosis.
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Key words:Actin;cytochalasin B；mitotic cycle; Physarum polycephalum
细胞松弛素(Cytochalasins)是肌动蛋白聚合的抑制剂，结合在F-肌动蛋白的正(+)端，阻止F-肌动蛋白的功能[9].研究者们用细胞松弛素B或D(Cytochalasin B,CB; Cytochalasin D,CD)或二氢细胞松弛素B(Dihydrocytochalasin B， DCB)对肌动蛋白的功能进行研究[10，11，16]，发现在细胞质中肌动蛋白构成细胞骨架的微丝，与胞质流动、变形运动、细胞形态的维持、细胞膜的动态变化、细胞器的运动等多种生命活动有关[12，17]。在细胞核中肌动蛋白可能与细胞核的定位和定向移动[10]、胞质分裂时分裂沟的形成[11]、多线染色体结构的维系等有关[13]。用注射抗肌动蛋白抗体或肌动蛋白结合蛋白的方法得到的结果表明，肌动蛋白可影响染色体的集缩，染色体结构状态的调整及基因转录[9]。关于肌动蛋白是否参与细胞周期调控的研究报道还很少。
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1 材料和方法
1.1 菌株 多头绒泡菌(Physarum polycephalum)菌株TU291由法国利母慈大学细胞生物学实验室 Philipe Albert博士惠赠。
1.2 培养基 MSD培养基。A液：柠檬酸3.54g；FeCl2.4H2O 0.06g；KH2PO4 0.2g；MgSO4.7H2O 0.6g；MnCl2.4H2O 0.084g；ZnSO4.7H2O 0.04g；CaCl2.2H2O 0.6g；胰蛋白10g。用30%KOH调pH至4.6，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌后4℃保存。B液：高铁血红素0.05g溶于100ml 1% NaOH中，高压灭菌后4℃保存。使用时，按0.3ml A液+20ml B液的比例混合。
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1.3 多头绒泡菌的悬浮培养 按照DanielⅠ[15]的方法，在250ml锥形瓶中，加入20ml MSD培养基，1ml菌液。24℃～26℃摇床培养，每3天继代1次。
1.4 多头绒泡菌的同步化培养 在直径为12cm的培养皿中进行同步化培养。将滤纸置于铺满玻璃珠的培养皿中，高压灭菌。离心收集悬浮培养的微原质团，经无菌蒸馏水洗涤后，铺于滤纸中央，26℃培养2h后，加入13ml左右MSD培养基。26℃暗培养16h左右。此时达到完全同步化。
1.5 细胞松弛素B(CB)处理 在细胞周期的第2、4、6、8h分别切下相等面积(2cm×1cm)的长有原质团的滤纸条，用显微操作仪向原质团注射CB溶液(1mmol/L，用2%二甲基亚砜DMSO配制)，每个原质团注射CB溶液2μl，约含CB1.0μg。注射后将原质团放入培养皿中继续培养。对照组样品中注射同体积的2%DMSO。
, http://www.100md.com 1.6 对多头绒泡菌细胞周期的光镜观察 跟踪CB处理组和对照组的细胞周期进程，每5～10min取材1次。卡宝品红染色，压片，OLYMPUS显微镜观察，照相。
1.7 对多头绒泡菌细胞周期的电镜观察 将CB处理组和对照组G2晚期、有丝分裂早前期、前期及中期的样品置于2.5%戊二醛固定液中固定12h。0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次30min。1%锇酸中后固定2h，双蒸水洗3次，每次20min。乙醇-丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋，包埋
块用LKB-5型超薄切片机切片。切片经醋酸铀-柠檬酸铅染色，Hitachti-600型透射电子显微镜下观察、照相。
2 结果
2.1 细胞松弛素B对多头绒泡菌细胞周期的影响 多头绒泡菌细胞周期由S期、G2期和M期组成，没有G1期。我们将M期/S期交界处的时间定为0h；S期的时长为3h，时间为0至第3h；G2期的时长为6h，时间为第3至第9h；M期时长为1h，时间为第9至第10h(图1)。
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图1 多头绒泡菌细胞周期
Fig.1 The cell cycle of Physarum polycephlum
在细胞周期的第2h(S期)、4h(G2早期)、6h(G2中期)和8h(G2晚期)将CB分别注入不同的原质团，对不同时间组的CB处理样品和对照组样品进行光镜跟踪观察，发现CB处理样品比对照组晚20～60min进入有丝分裂期。现以在G2晚期注入CB这一时间组为例说明如下。
注入CB时，核仁位于细胞核中央，染色较浅且均匀，染色质位于核仁周围(图版I-A)。对照样品处于有丝分裂早期前时(进入有丝分裂约10min)，核仁出现侧偏(图版I-B)；此时实验组仍处于G2晚期。进入有丝分裂约30min时，对照组进入前期，核仁移至边缘并开始解体，染色质松散；此时实验组核仁仍位于核中央即处于G2晚期(图版I-C1和C2)。60min时，对照组核仁消失，染色质集缩，出现染色体轮廓，进入早中期；实验组进入早前期，核仁偏移(图版I-D1和D2)。65min时，对照组为中期，染色体排列于赤道板上；实验组进入前期，核仁移至核的边缘并开始解体，染色质松散(图版I-E1和E2)。70min时，对照组进入后期和末期(后期和末期时间很短，仅为6min左右)，随即形成两个子细胞核(图版I-F)。115min时，实验组进入早中期(图版I-G)。120min时，实验组进入中期(图版I-H)。130min，实验组进入后期和末期(图版I-I)。与对照样品相比，在G2晚期注入CB的实验样品进入有丝分裂的时间推迟约60min。
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在多头绒泡菌细胞周期不同时间点注射CB所造成的时间推迟的程度不同。与对照组相比，S期注入CB，进入有丝分裂的时间推迟35min左右；G2早期注入，有丝分裂推迟20min左右；G2中期注入，推迟45min左右(表1)。
表1 CB对多头绒泡菌有丝分裂的迟滞效应
Table 1 Delay of entry into mitosis caused by Cytochalasin B in Physarum polycephlum CB注射时间
Time in cell
cycle when CB
is microinjected(h)
注射时细胞
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周期时相
Phase in cell
cycle when CB
is microinject
microinjected
对照组进入
M期时间
Time of entry
into mitotic
phase in
control(h)
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实验组进入
M期时间
Time of entry into
mitotic phase in
CB treated
pecimens(h)+(min)
延迟时间
Delay(min)
2.0
S期
S phase
9.0
, 百拇医药
9.0+35
35
4.0
G2早期early
G2 phase
9.0
9.0+20
20
6.0
G2中期
middle
G2 phase
9.0
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9.0+45
45
8.0
G2晚期
late
G2 phase
9.0
9.0+60
60
2.2 CB处理样品和对照样品的细胞核超微结构 对G2晚期、有丝分裂早前期、前期及中期的CB处理样品和对照样品的细胞核进行了电镜观察，发现二者的超微结构在上述各个时相均无明显差别。在G2晚期，核仁位于细胞核中部，染色质呈密集团块状位于核仁周围的核质中(图版II-A1和A2)。中期时，由染色质集缩形成的染色体排列于赤道板上(图版II-B1和B2)。多头绒泡菌行核内有丝分裂，因此在中期时细胞核仍保持完整，核膜清晰可见(图版II-B1和B2)。CB处理样品的中期细胞核切面为侧面观，可见清晰的纺锤体结构，染色体位于纺锤体中，排列于赤道板上，纺锤体的微管汇于两极(图版II-B2)。对照样品中期细胞核切面为极面观，未见到纺锤体结构，只观察到排列于赤道板上的染色体(图版II-B1)。
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3 讨论
肌动蛋白存在于动物、植物的细胞核和染色体(染色质)中[1～6]，是细胞核或染色体骨架的组成成分之一[7]。有关肌动蛋白在细胞核中的功能研究还不多。Lestourgeon等人观察到，当细胞核体积增加或核内染色体集缩时肌动蛋白的含量增加，因此认为肌动蛋白可能参与染色质多种结构状态的维持和调节过程[4]。Rugger等人发现将抗肌动蛋白抗体注射入非洲爪蟾卵母细胞可抑制染色体的集缩过程，因此认为肌动蛋白与染色体集缩有关[8]。Scheer等人发现将抗肌动蛋白抗体或肌动蛋白结合蛋白注射入细胞可引起灯刷染色体侧环收缩，因此推测肌动蛋白与灯刷染色体侧环伸展和基因转录有关[9]。还有一些研究结果表明，肌动蛋白可能与细胞核的定位和定向移动[10]、胞质分裂时分裂沟的形成[11]、染色体的运动[12]、多线染色体结构的维系[13]等有关。关于肌动蛋白是否参与其他一些细胞生命活动过程(如细胞分裂周期的调控、细胞分化等)，目前的研究报道还很少。
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本文观察到经CB处理的多头绒泡菌细胞核进入有丝分裂的时间迟于对照组，这表明一旦肌动蛋白的功能被抑制，多头绒泡菌有丝分裂就受到明显的影响。在有丝分裂周期各个时相(S期、G2早期、G2中期和G2晚期)进行CB处理的样品中，前期到中期的时间以及中期到后末期的时间与对照组的基本相同。另外，对照样品在有丝分裂过程中发生核仁偏移和解体、染色体集缩、染色体排列在赤道板上以及向两极移动等变化，CB处理样品中也发生同样的变化。这说明CB对多头绒泡菌有丝分裂周期的影响主要在有丝分裂的启动上，即肌动蛋白可能与有丝分裂的启动有关，而CB处理使有丝分裂的启动受阻。
本文在细胞周期的不同时相将CB注入多头绒泡菌原质团，发现CB对有丝分裂启动的影响程度与注射CB时多头绒泡菌所处的细胞周期时相有关，在G2晚期时进行CB处理对有丝分裂启动的影响最为明显。这种CB效应的细胞周期时相依赖性说明，多头绒泡菌的G2晚期可能存在着有丝分裂启动的关键点或检验点。Belyavsky和Sauer指出多头绒泡菌有丝分裂周期中可能存在两个检验点，一个在进入S期后的1h左右，另一个则在G2晚期[18]。在这两个检验点进行处理，会导致有丝分裂的加速或延迟。本文根据CB处理和细胞学观察结果做出的关于检验点的推测与上述作者根据生化分析结果提出的有关观点[18]是一致的。
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关于CB抑制肌动蛋白的功能为什么会影响有丝分裂的启动，目前还不清楚。有关细胞周期调控的研究结果表明，有丝分裂促进因子(mitotic promoting factor,MPF)由起催化作用的亚单位CDK(如p34cdc2)和起调控作用的亚单位周期素(cyclin)组成[19]，多头绒泡菌含有cdc2类似蛋白[20]，这种蛋白的活化至少需要DNA复制和细胞骨架构建等两个关键信号[21]，p34cdc2是组蛋白H1激酶的亚单位之一，而组蛋白Hl的磷酸化与染色体集缩偶联[18]。根据上述研究结果和肌动蛋白是收缩蛋白的特点，我们推测，染色体集缩可能是多头绒泡菌中cdc2活化的另一个关键信号，当CB处理抑制肌动蛋白的功能时，可能导致染色体集缩过程受阻，从而抑制了组蛋白H1的磷酸化以及cdc2的活化，进而使有丝分裂的启动推迟。这一推测还有待于进一步的实验来验证。
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图版说明
图版I
细胞松弛素B对多头绒泡菌细胞周期的影响×2200。
A：在G2晚期注射CB时多头绒泡菌原质团细胞核的形态。
经卡宝品红染色着色较浅的核仁，位于细胞核(箭头)中央。
着色较深的染色质颗粒位于核仁周边；
B：对照样品早前期的细胞核。核仁(箭头)偏移；
C1：对照样品的前期细胞核。核仁(箭头a)
移至细胞核边缘并开始解体，染色质(箭头b)松散；
, http://www.100md.com C2：CB处理样品。核仁位于G2晚期的细胞核(箭头)中央；
D1：早中期的对照样品细胞核。箭头所示为染色体；
D2：CB处理的早前期细胞核样品。核仁(箭头)偏移；E1：对
照样品中期细胞核。染色体簇(箭头)排列于赤道板上；
E2：CB处理样品。核仁(箭头a)移至细胞核边缘并开始解体，染色质(箭头b)松散；F：对照样品后期(箭头a)和末期
(箭头b)细胞核；G：CB处理样品早中期细胞核。
箭头所示为初具轮廓的染色体；H：CB处理样品中期细胞核。染色体簇(箭头)
排列于赤道板上；I：CB处理样品后期和末期细胞核，箭头示末期
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Explanation of Plates
Plate I
Effects of cytochalasin B (CB) upon the mitotic cycle of
Physarum polycephalum.Stained with Carbol fuchsine.×2200.
A:Nuclei in late G2 phase when CB was microinjected into the plasmodia.
The nucleolus is located in the center of the nucleus (arrow) and chromatin granules
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are scattered around the nucleolus.The chromatin granules are stained heavilier
than the nucleolus; B:Nuclei of the control in early prophase.The nucleolus (arrow)migrates
to the periphery of the nucleus; C1:Nuclei of the control in prophase.
The nucleolus (arrow a.) is in disintegration,and the chromatin granules (arrow b)
become decondensed; C2:Nuclei of CB-treated specimens in G2 phase.
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The nucleolus is situated in the center of the nucleus (arrow);
D1:Nuclei of the control in pre-metaphase.Arrows shows chromosomes;
D2:Nuclei of CB-treated specimens in early prophase.The nucleolus (arrow) moves
to the nuclear periphery; E1:Nuclei of the control in metaphase.
Chromosomes are clustered and lined at the equatorial plate (arrows);
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E2:Nuclei of CB-treated specimens in prophase.The nucleolus (arrow a) is in
disintegration,and the chromatin granules (arrow b) become decondensed;
F:Nuclei of the control are in anaphase (arrow a) and telophase (arrow b);
G:Nuclei of CB-treated specimens in pre-metaphase.Arrows show chromosomes
in condensation; H:Nuclei of CB-treated specimens in metaphase
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.Arrows show chromosome clusters lining on equatorial plate;
I:Nuclei of CB-treated specimens in telophase.Two clusters of chromosomes
in one nucleus (arrows) are paralleled
图版II
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对照样品和CB处理样品的细胞核的超微结构×20000。
A1和A2：对照样品(A1)和CB处理样品(A2)
G2晚期细胞核的超微结构基本相同。核仁(a箭头)和
染色质团块(b箭头)的电子密度都很高。B1和B2：对照样品(B1)和
CB处理样品(B2)中期细胞核的超微结构基本相同。染色体簇(a箭头)
的电子密度较高，核仁消失，核膜(b箭头)依然存在。
CB处理样品为侧面观，纺锤体(c箭头)清晰可见
Plate II
Ultrastructure of nuclei in CB-treated specimens and control×20000.A1&A3：
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G2 phase nuclei in control (A1) and CB-treated specimens (A2) show similarity in ultrastructure.
The nucleoli (arrow a) and condensed chromatin (arrows b) are highly contrasted.
B1 & B2:Metaphase nuclei in control (B1) and CB-treated specimens (B2)
share common features in their ultrastructure.Nucleolus has disappeared,chromosome
,clusters (arrows a) are contrasted and the nuclear membrane (arrows b) still exists.
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Spindle fibres (B2,arrow c) are clearly observed in the longitudinal section of the CB-treated nucleus.
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