利用花色素苷合成调节基因C1-R作为基因枪转化效果指示的研究
作者：单丽波 李义文 赵铁汉 梁辉 欧阳俊闻 贾双娥 贾旭
单位：中国科学院遗传研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京 100101
关键词：花色素苷；瞬时表达；基因枪；植物转化；GUS
遗传学报000111
摘要：报道了玉米花色素苷合成调节基因C1-R在小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、烟草叶片中的瞬时表达情况。由于调节基因C1-R激活了植物体细胞内花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活体观察到花色素苷的表达。结果表明，对于目前仍主要通过基因枪法转化的几类主要粮食作物——小麦、玉米、水稻、枪击48h后，放大2倍便清晰可见红色斑点，且其表达强度远高于GUS的表达，证明C1-R可作为一个很好的衡量打枪效果的指示，同时还证明其在双子叶植物——烟草叶片的基因枪转化瞬时表达体系中也起同样的作用。
, 百拇医药
中图分类号：Q75 文献标识码：A
文章编号：0379-4172(2000)01-0065-0069
Estimation of Biolistic Transformation Effect by Transient Expression of C1-R Regulatory Genes of Anthocyanin Biosynthesis
SHAN Li-Bo,LI Yi-Wen,ZHAO Tie-Han,LIANG Hui,OUYANG Jun-Wen,JIA Shuang-E,JIA Xu
(Institute of Genetics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)
, 百拇医药 Abstract:In the present study,the transient expression of maize C1-R regulatory genes of anthocyanin biosynthesis in maize calli,wheat immature embroys,rice calli and tobacco leaves were described.C1-R regulatory genes could activate anthocyanin biosynthesis in vivo and the pigmented cells were visible.For major crops,including maize,wheat and rice,which were transformed mainly by biolistic method,C1-R genes were novel visible markers,and the expression was easier to detect than GUS gene.And these genes also worked well in transient expression in biolistic transformation system of tobacco leaves.
, 百拇医药
Key words:anthocyanin;transientexpression;biolistictransformation;plant transformation;GUS
目前，转化技术已成为植物遗传操作中的一项常规手段。对于一些主要的单子叶作物如小麦、玉米、水稻，基因枪法仍是主要转化方法。在某些转化机理的研究中，即使是对于农杆菌易于转化的双子叶植物如烟草、拟南芥，基因枪法仍占有举足轻重的地位[1]。但由于基因枪的高成本以及枪击后线性增加的工作量，研究人员必然迫切要求提高枪击质量。目前，基因枪法中衡量打枪效果的常规方法，一是在解剖镜下镜检金粉的分布情况，但金粉分布均匀与否与转化效果并无必然联系，因而只是粗略评估打枪效果的一个方面。二是通过GUS染色， 由于被检材料需染色处理，这不仅程序繁琐， 而且材料经处理而致死[2]。因此，用这两种方法来评价基因枪转化效果常常具有一定的局限性。
, 百拇医药
花色素苷合成调节基因C1-R是花色素苷合成代谢途径中的一个调节基因，其编码的蛋白为花色素苷合成酶转录过程中的一个激活因子，能在活组织内开启花色素苷的合成[3]。各种植物都有在体内不停地进行着复杂的花色素苷合成的功能。如果使调节基因C1-R在CaMV35启动子控制下，不仅能使其组成型表达，且不受单、双子叶植物物种的影响[4]。Ludwig等曾报道将CaMV35S启动子-玉米花色素苷调节基因编码序列-Nos终止子嵌合基因，通过基因枪法转化玉米不同器官组织，并观察其瞬时表达效果，结果在胚芽鞘、中胚轴、胚根鞘、根、盾片节及叶毛中均观测到了红色细胞[5]。Taylor等人在珍珠粟的研究上也曾有过类似报道[6]。Lloyd等用农杆菌转化法将调节基因C1-R转化烟草和拟南芥，转化植株的花柱、花萼和根部均有红色细胞出现[7]。上述研究尽管成功地转化了C1-R基因，但未见有报道将其作为衡量打枪效果的指标，尤其用于小麦、水稻的转化。由于C1-R基因表达后不需任何生色底物就可活体显现红色，有可能作为某种反应的指示。本研究观察了C1-R基因在小麦、玉米、水稻和烟草中的瞬时表达情况，并与GUS的表达作了比较，试图将C1-R基因瞬时表达效果作为衡量基因枪转化效果的早期指标。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 春小麦(Triticum aestivum L.)Bobwhite(本室保存)。
1.1.2 玉米(Zea mays L.)P9-10/Z31(中国农大戴景瑞实验室提供)。
1.1.3 水稻(Oryza sativa L.)中花9号(中科院遗传所田文忠实验室提供)。
1.1.4 烟草(Nicotiana tabacum L.)Nc89(中科院遗传所朱祯实验室提供)。
1.1.5 质粒pC1，pBperu含 CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因(Stanford大学Lloyd实验室提供)。
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1.1.6 质粒pBI101 含CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因(中科院遗传所李家洋实验室提供)。
1.2 方法
1.2.1小麦幼胚 小麦授粉后12～14d，取下未成熟种子，经70%乙醇灭菌3min，剥出幼胚，盾片朝上，接种于补加2mg/L 2，4-D的MS基本培养基上，26℃预培养3d。
1.2.2 玉米愈伤组织 取授粉约12d的幼胚，灭菌后接种于补加2mg/L 2，4-D的N6培养基诱导愈伤，经2～3次继代后用于打枪。
1.2.3 水稻愈伤组织 成熟种子灭菌后，取出种胚并接种于补加2mg/L 2，4-D的N6培养基上诱导愈伤，愈伤经2～3次继代后用于打枪。
1.2.4 烟草叶片 取幼嫩烟草叶片，表面灭菌后置MS培养基上打枪。
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1.2.5 基因枪轰击 基因枪采用Bio-Rad PDS 1 000/He型，轰击压力1 100Psi，按每枪500g金粉与1μg DNA配制子弹，金粉直径1μm，具体操作按Klein等人的方法[1]。
1.2.6 GUS组织化学染色 将被试材料置X-Glu反应液中37℃温育6h，70%乙醇室温5h脱色，具体操作按Taylor等人的方法[8]。
2 结果与分析
2.1 C1-R基因在小麦、玉米、水稻、烟草叶片中的表达
枪击24h后，解剖镜下放大2倍即可观察到花色素苷的表达，但由于在高渗培养基中，红色细胞数目较少，至48～72h后，即可清晰观察，如图版所示。对于小麦和玉米，愈伤组织表面的红色细胞清晰可辨，各自独立分布且颜色呈红色，极易计数(图版-1，2)。而水稻愈伤组织表面出现趋向浅橙色的细胞，26℃培养温度下不易辨清独立表达的红色细胞(图版-3)，但于4℃过夜后有利于色素积累，可清晰观察到绛红色斑点。烟草叶片在枪击24h后，看不出任何表达的迹象，待72h后逐渐清晰，斑点偏紫黑色(图版-4)，连叶毛的末端也呈现鲜红色，清晰可见(图版-5)。
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2.2 恢复培养时间与C1-R基因相对表达量之间的关系
枪击后1，2，3……天分别统计小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织和烟草叶片表面出现的红色斑点数，以斑点数的多少以及斑点颜色的深浅来评估C1-R基因的表达水平。统计结果表明，在不同材料中C1-R基因的表达时间和表达强度均不相同(图1)。玉米的最早，在恢复培养的第1d就能观察到红斑，第2d斑点数达到高峰，斑点颜色最深。 小麦在恢复培养后第2d也达到高峰，斑点颜色较深，也极易观察。而水稻枪击24h后表达并不强，72h后才急剧上升，虽然斑点的界限不象小麦和玉米的那样清楚，但仍可清楚的辨别。烟草叶片枪击24h后看不出任何表达迹象，至72～90h后达到高峰。这些结果表明，尽管C1-R基因在这些材料中表达的时间和水平各有差异，但表达高峰滞留期均为5d。由此可以认为，一般在恢复培养48h后即可观察C1-R基因的表达，从而估计打枪效果。
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图1 恢复培养时间与Cl-R基因相对表达量之间的关系
Fig.1 The relationship between post-bombardment cultrue time
of wheat immature embryos and the expression of genes Cl-R
2.3 小麦幼胚胚龄及预培养时间对C1-R基因表达的影响
在实验中还观察到同为小麦幼胚，预培养4d枪击48h后统计每块幼胚的红斑数。对于胚龄8d，幼胚直径0.5～1.2mm者，C1朢基因表达强度远远高于胚龄14d、幼胚直径1.5～2.0mm者。偏小者平均每块幼胚红色斑点数多至40～60个，而偏大者仅为5～7个。而预培养时间亦严重影响C1朢基因的表达。不经预培养的幼胚，平均每块幼胚的红色斑点不超过10个，而经预培养1～2d再枪击者红色斑点数明显增多。原因可能是偏幼嫩胚和经预培养胚的表面细胞组织较松软，子弹易于射入，被转化细胞相对较多，且细胞增殖较快，所以瞬时表达效果较明显。但由于幼嫩者后期分化能力减弱，亦或由于子弹(金粉)过多地射入细胞，对细胞损伤过大，使其在后期分化得苗率中效果反而不好。但经预培养对提高转化频率的效果是肯定的[1]。因此，基因枪转化法中选择适宜发育期的受体非常重要。这些现象启示我们，可以根据打枪后C1-R基因的表达状况来选择适宜的受体的状态。
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2.4 子弹的制备及点膜均匀度与C1-R基因表达的关系
子弹的制备及点膜均匀度均严重影响打枪效果。实验中观察到子弹结块膜点得不均匀时，红色斑点仅在射击的局部区域出现，有红色斑点的幼胚仅不足5%。而膜点得均匀时，整个射击范围内每块幼胚上均有数个红色斑点。而常规利用GUS染色并不能直接明了地观察枪击效果。利用C1-R基因作指示，有其独特的优点。它不需任何处理，可直接“原位”观察、了解子弹是否结块和点膜是否均匀。根据我们的经验，制备子弹时，应将金粉与DNA悬液边涡旋边依次加入CaCl2、亚精胺，其间不可间断并持续涡旋3min，以防金粉结块。点膜时若子弹有结块现象，需将其打散并均匀点于膜上。
2.5 C1-R朢基因与GUS基因表达强度的比较
将pC1朆peru与pBI101等量共转化。枪击72h后，首先统计具花色素苷活性的红色细胞数。然后全部进行GUS检测，统计蓝色细胞数。结果表明，枪击后红色细胞数均远高于蓝色细胞数(图2)，这主要源于花色素苷合成调节因子C1-R为植物自身体内花色素苷合成代谢的一个调节开关，主要负责调节花色素苷的表达量，一旦开启就以级联放大式表达，所以受体细胞对该外源基因极其敏感[3]，而GUS染色法是通过GUS基因表达产物——β葡萄糖醛酸酶水解外源生色底物而发挥作用的[2]。
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图2 花色素苷与GUS基因表达强度的比较
Fig.2 Comparision of the expression of anthocyanin
gene with that of GUS gene
3 讨论
Groff等曾报道，枪击后DNA一般仅能到达组织表面1～5层细胞内，最深不过12层。且大部分DNA仅游离于细胞质内并不能正确整合至基因组中，而是随着细胞不断增殖和分化而随之丢失[8]。在我们的实验中发现，虽然红色细胞数目极多，即枪击后外源基因瞬时表达效果极佳，然而最终获得稳定的转化体却很少，其中一个原因可能也是大部分外源基因仅游离于细胞质中，真正能正确整合至基因组中可稳定遗传的机率极小。
然而，在用C1-R基因作为基因枪转化效果指示的实验中，从理论上讲，仍有可能获得调节基因C1-R与目的基因同时稳定整合至基因组中的共转化株。 那么它的生物安全性怎样呢？Lloyd等人报道转C1-R基因烟草及拟南芥的花被、花萼和根部均有红色细胞，而其他性状并不受影响。由于该调节基因来源于玉米，更增加了使用的安全性。此外，若能获得调节基因C1-R稳定整合和稳定遗传的转基因小麦，这一直观的表型选择标记，无疑对小麦的遗传学研究和品种选育将是非常有价值的。
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参考文献
[1]Klein T et al.Gene Transfer to Plants.1995,Part IV,115～162.
[2]Jefferson R A et al.GUS fusions:b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.,1987,6:3901～3907.
[3]Holton A et al.Genetics and biochemistry of anthocyanun biosynthesis.Plant Cell,1995,7:107～108.
[4]Klein T M et al.Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced into intact maize tissues by microprojectiles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6681～6685.
, 百拇医药
[5]Ludwig et al.A regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation.Science,1989,247:449～
450.
[6]Taylor M G et al.Histology of,and physical factors affecting,transient GUS expression in pearl millet[Pennisetum glaucum L.R.Br.]embryos following microprojectile bombardment.Plant Cell Rep.,1991,10:120～125.
[7]Lloyd M et al.Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulators R and C1.Science,1992,258:1773～1775.
[8]Groff S A et al.Transactivation of anthocyanin biosynthetic genes following transfer of B regulatory genesinto maize tissues.EMBO J.,1990,9:2517～2522., 百拇医药
单位：中国科学院遗传研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京 100101
关键词：花色素苷；瞬时表达；基因枪；植物转化；GUS
遗传学报000111
摘要：报道了玉米花色素苷合成调节基因C1-R在小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、烟草叶片中的瞬时表达情况。由于调节基因C1-R激活了植物体细胞内花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活体观察到花色素苷的表达。结果表明，对于目前仍主要通过基因枪法转化的几类主要粮食作物——小麦、玉米、水稻、枪击48h后，放大2倍便清晰可见红色斑点，且其表达强度远高于GUS的表达，证明C1-R可作为一个很好的衡量打枪效果的指示，同时还证明其在双子叶植物——烟草叶片的基因枪转化瞬时表达体系中也起同样的作用。
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中图分类号：Q75 文献标识码：A
文章编号：0379-4172(2000)01-0065-0069
Estimation of Biolistic Transformation Effect by Transient Expression of C1-R Regulatory Genes of Anthocyanin Biosynthesis
SHAN Li-Bo,LI Yi-Wen,ZHAO Tie-Han,LIANG Hui,OUYANG Jun-Wen,JIA Shuang-E,JIA Xu
(Institute of Genetics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)
, 百拇医药 Abstract:In the present study,the transient expression of maize C1-R regulatory genes of anthocyanin biosynthesis in maize calli,wheat immature embroys,rice calli and tobacco leaves were described.C1-R regulatory genes could activate anthocyanin biosynthesis in vivo and the pigmented cells were visible.For major crops,including maize,wheat and rice,which were transformed mainly by biolistic method,C1-R genes were novel visible markers,and the expression was easier to detect than GUS gene.And these genes also worked well in transient expression in biolistic transformation system of tobacco leaves.
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Key words:anthocyanin;transientexpression;biolistictransformation;plant transformation;GUS
目前，转化技术已成为植物遗传操作中的一项常规手段。对于一些主要的单子叶作物如小麦、玉米、水稻，基因枪法仍是主要转化方法。在某些转化机理的研究中，即使是对于农杆菌易于转化的双子叶植物如烟草、拟南芥，基因枪法仍占有举足轻重的地位[1]。但由于基因枪的高成本以及枪击后线性增加的工作量，研究人员必然迫切要求提高枪击质量。目前，基因枪法中衡量打枪效果的常规方法，一是在解剖镜下镜检金粉的分布情况，但金粉分布均匀与否与转化效果并无必然联系，因而只是粗略评估打枪效果的一个方面。二是通过GUS染色， 由于被检材料需染色处理，这不仅程序繁琐， 而且材料经处理而致死[2]。因此，用这两种方法来评价基因枪转化效果常常具有一定的局限性。
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花色素苷合成调节基因C1-R是花色素苷合成代谢途径中的一个调节基因，其编码的蛋白为花色素苷合成酶转录过程中的一个激活因子，能在活组织内开启花色素苷的合成[3]。各种植物都有在体内不停地进行着复杂的花色素苷合成的功能。如果使调节基因C1-R在CaMV35启动子控制下，不仅能使其组成型表达，且不受单、双子叶植物物种的影响[4]。Ludwig等曾报道将CaMV35S启动子-玉米花色素苷调节基因编码序列-Nos终止子嵌合基因，通过基因枪法转化玉米不同器官组织，并观察其瞬时表达效果，结果在胚芽鞘、中胚轴、胚根鞘、根、盾片节及叶毛中均观测到了红色细胞[5]。Taylor等人在珍珠粟的研究上也曾有过类似报道[6]。Lloyd等用农杆菌转化法将调节基因C1-R转化烟草和拟南芥，转化植株的花柱、花萼和根部均有红色细胞出现[7]。上述研究尽管成功地转化了C1-R基因，但未见有报道将其作为衡量打枪效果的指标，尤其用于小麦、水稻的转化。由于C1-R基因表达后不需任何生色底物就可活体显现红色，有可能作为某种反应的指示。本研究观察了C1-R基因在小麦、玉米、水稻和烟草中的瞬时表达情况，并与GUS的表达作了比较，试图将C1-R基因瞬时表达效果作为衡量基因枪转化效果的早期指标。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 春小麦(Triticum aestivum L.)Bobwhite(本室保存)。
1.1.2 玉米(Zea mays L.)P9-10/Z31(中国农大戴景瑞实验室提供)。
1.1.3 水稻(Oryza sativa L.)中花9号(中科院遗传所田文忠实验室提供)。
1.1.4 烟草(Nicotiana tabacum L.)Nc89(中科院遗传所朱祯实验室提供)。
1.1.5 质粒pC1，pBperu含 CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因(Stanford大学Lloyd实验室提供)。
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1.1.6 质粒pBI101 含CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因(中科院遗传所李家洋实验室提供)。
1.2 方法
1.2.1小麦幼胚 小麦授粉后12～14d，取下未成熟种子，经70%乙醇灭菌3min，剥出幼胚，盾片朝上，接种于补加2mg/L 2，4-D的MS基本培养基上，26℃预培养3d。
1.2.2 玉米愈伤组织 取授粉约12d的幼胚，灭菌后接种于补加2mg/L 2，4-D的N6培养基诱导愈伤，经2～3次继代后用于打枪。
1.2.3 水稻愈伤组织 成熟种子灭菌后，取出种胚并接种于补加2mg/L 2，4-D的N6培养基上诱导愈伤，愈伤经2～3次继代后用于打枪。
1.2.4 烟草叶片 取幼嫩烟草叶片，表面灭菌后置MS培养基上打枪。
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1.2.5 基因枪轰击 基因枪采用Bio-Rad PDS 1 000/He型，轰击压力1 100Psi，按每枪500g金粉与1μg DNA配制子弹，金粉直径1μm，具体操作按Klein等人的方法[1]。
1.2.6 GUS组织化学染色 将被试材料置X-Glu反应液中37℃温育6h，70%乙醇室温5h脱色，具体操作按Taylor等人的方法[8]。
2 结果与分析
2.1 C1-R基因在小麦、玉米、水稻、烟草叶片中的表达
枪击24h后，解剖镜下放大2倍即可观察到花色素苷的表达，但由于在高渗培养基中，红色细胞数目较少，至48～72h后，即可清晰观察，如图版所示。对于小麦和玉米，愈伤组织表面的红色细胞清晰可辨，各自独立分布且颜色呈红色，极易计数(图版-1，2)。而水稻愈伤组织表面出现趋向浅橙色的细胞，26℃培养温度下不易辨清独立表达的红色细胞(图版-3)，但于4℃过夜后有利于色素积累，可清晰观察到绛红色斑点。烟草叶片在枪击24h后，看不出任何表达的迹象，待72h后逐渐清晰，斑点偏紫黑色(图版-4)，连叶毛的末端也呈现鲜红色，清晰可见(图版-5)。
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2.2 恢复培养时间与C1-R基因相对表达量之间的关系
枪击后1，2，3……天分别统计小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织和烟草叶片表面出现的红色斑点数，以斑点数的多少以及斑点颜色的深浅来评估C1-R基因的表达水平。统计结果表明，在不同材料中C1-R基因的表达时间和表达强度均不相同(图1)。玉米的最早，在恢复培养的第1d就能观察到红斑，第2d斑点数达到高峰，斑点颜色最深。 小麦在恢复培养后第2d也达到高峰，斑点颜色较深，也极易观察。而水稻枪击24h后表达并不强，72h后才急剧上升，虽然斑点的界限不象小麦和玉米的那样清楚，但仍可清楚的辨别。烟草叶片枪击24h后看不出任何表达迹象，至72～90h后达到高峰。这些结果表明，尽管C1-R基因在这些材料中表达的时间和水平各有差异，但表达高峰滞留期均为5d。由此可以认为，一般在恢复培养48h后即可观察C1-R基因的表达，从而估计打枪效果。
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图1 恢复培养时间与Cl-R基因相对表达量之间的关系
Fig.1 The relationship between post-bombardment cultrue time
of wheat immature embryos and the expression of genes Cl-R
2.3 小麦幼胚胚龄及预培养时间对C1-R基因表达的影响
在实验中还观察到同为小麦幼胚，预培养4d枪击48h后统计每块幼胚的红斑数。对于胚龄8d，幼胚直径0.5～1.2mm者，C1朢基因表达强度远远高于胚龄14d、幼胚直径1.5～2.0mm者。偏小者平均每块幼胚红色斑点数多至40～60个，而偏大者仅为5～7个。而预培养时间亦严重影响C1朢基因的表达。不经预培养的幼胚，平均每块幼胚的红色斑点不超过10个，而经预培养1～2d再枪击者红色斑点数明显增多。原因可能是偏幼嫩胚和经预培养胚的表面细胞组织较松软，子弹易于射入，被转化细胞相对较多，且细胞增殖较快，所以瞬时表达效果较明显。但由于幼嫩者后期分化能力减弱，亦或由于子弹(金粉)过多地射入细胞，对细胞损伤过大，使其在后期分化得苗率中效果反而不好。但经预培养对提高转化频率的效果是肯定的[1]。因此，基因枪转化法中选择适宜发育期的受体非常重要。这些现象启示我们，可以根据打枪后C1-R基因的表达状况来选择适宜的受体的状态。
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2.4 子弹的制备及点膜均匀度与C1-R基因表达的关系
子弹的制备及点膜均匀度均严重影响打枪效果。实验中观察到子弹结块膜点得不均匀时，红色斑点仅在射击的局部区域出现，有红色斑点的幼胚仅不足5%。而膜点得均匀时，整个射击范围内每块幼胚上均有数个红色斑点。而常规利用GUS染色并不能直接明了地观察枪击效果。利用C1-R基因作指示，有其独特的优点。它不需任何处理，可直接“原位”观察、了解子弹是否结块和点膜是否均匀。根据我们的经验，制备子弹时，应将金粉与DNA悬液边涡旋边依次加入CaCl2、亚精胺，其间不可间断并持续涡旋3min，以防金粉结块。点膜时若子弹有结块现象，需将其打散并均匀点于膜上。
2.5 C1-R朢基因与GUS基因表达强度的比较
将pC1朆peru与pBI101等量共转化。枪击72h后，首先统计具花色素苷活性的红色细胞数。然后全部进行GUS检测，统计蓝色细胞数。结果表明，枪击后红色细胞数均远高于蓝色细胞数(图2)，这主要源于花色素苷合成调节因子C1-R为植物自身体内花色素苷合成代谢的一个调节开关，主要负责调节花色素苷的表达量，一旦开启就以级联放大式表达，所以受体细胞对该外源基因极其敏感[3]，而GUS染色法是通过GUS基因表达产物——β葡萄糖醛酸酶水解外源生色底物而发挥作用的[2]。
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图2 花色素苷与GUS基因表达强度的比较
Fig.2 Comparision of the expression of anthocyanin
gene with that of GUS gene
3 讨论
Groff等曾报道，枪击后DNA一般仅能到达组织表面1～5层细胞内，最深不过12层。且大部分DNA仅游离于细胞质内并不能正确整合至基因组中，而是随着细胞不断增殖和分化而随之丢失[8]。在我们的实验中发现，虽然红色细胞数目极多，即枪击后外源基因瞬时表达效果极佳，然而最终获得稳定的转化体却很少，其中一个原因可能也是大部分外源基因仅游离于细胞质中，真正能正确整合至基因组中可稳定遗传的机率极小。
然而，在用C1-R基因作为基因枪转化效果指示的实验中，从理论上讲，仍有可能获得调节基因C1-R与目的基因同时稳定整合至基因组中的共转化株。 那么它的生物安全性怎样呢？Lloyd等人报道转C1-R基因烟草及拟南芥的花被、花萼和根部均有红色细胞，而其他性状并不受影响。由于该调节基因来源于玉米，更增加了使用的安全性。此外，若能获得调节基因C1-R稳定整合和稳定遗传的转基因小麦，这一直观的表型选择标记，无疑对小麦的遗传学研究和品种选育将是非常有价值的。
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参考文献
[1]Klein T et al.Gene Transfer to Plants.1995,Part IV,115～162.
[2]Jefferson R A et al.GUS fusions:b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.,1987,6:3901～3907.
[3]Holton A et al.Genetics and biochemistry of anthocyanun biosynthesis.Plant Cell,1995,7:107～108.
[4]Klein T M et al.Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced into intact maize tissues by microprojectiles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6681～6685.
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[5]Ludwig et al.A regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation.Science,1989,247:449～
450.
[6]Taylor M G et al.Histology of,and physical factors affecting,transient GUS expression in pearl millet[Pennisetum glaucum L.R.Br.]embryos following microprojectile bombardment.Plant Cell Rep.,1991,10:120～125.
[7]Lloyd M et al.Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulators R and C1.Science,1992,258:1773～1775.
[8]Groff S A et al.Transactivation of anthocyanin biosynthetic genes following transfer of B regulatory genesinto maize tissues.EMBO J.,1990,9:2517～2522., 百拇医药