用丰富培基作为选择压力在酿酒酵母PRO＋转化子中稳定遗传的分泌型表达载体
作者：谢恒月 唐鹰 姜伟东 贺恒益 刘明 匡达人
单位：中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 200031
关键词：用丰富培基作为选择压力；稳定遗传的分泌型载体；Pro+转化子；ρHCG-CDNA在酵母中表达
遗传学报000413
摘要：构建了一个含酿酒酵母PRO3基因的分泌型表达载体pCBy310，在pCBy310上插入ρHCG(人绒毛膜促性腺激素ρ亚基)-cDNA以形成一个重组质粒pCBy314。利用酿酒酵母脯氨酸合成酶基因缺陷株的独特属性，即它们不能在丰富培基中生长，pCBy314在酿酒酵母Pro3-缺陷株(MB299-A)的转化子可以在丰富培基中生长，而且保持有丝分裂稳定性。在优化条件(但尚非最佳条件)下，ρHCG在培液中的产量是650g/L。说明YPD可以用为选择培基，而且酿酒酵母在YPD中比在选择培基中生长更旺盛，可以提高表达产物的产量，加之YPD的成分简单又便宜。因此得出结论，PRO基因可以广泛地用于构建在酿酒酵母中克隆和表达外源基因的载体，以便用丰富培基作为选择压力直接筛选。
, 百拇医药
中图分类号：Q782 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-369-376
Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Secretory Expression Vector
Maintained Stably in Pro3+ Transformants
in Rich Medium
XIE Heng-Yue, TANG Ying, JIANG Wei-Dong, HE Heng-Yi,LIU Ming, KUANG Da-Ren
(Shanghai Institute of Cell Biology， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
Abstract: A yeast (Saccharomyces cerevisiae) secretory expression vector containing PRO3 gene was constructed (pCBy310). ρHCG(Human choriogonadotropin ρ subunit)-cDNA was inserted into pCBy310 to form a recombinant plasmid pCBy314. Since yeast proline auxotroph will not survive in rich medium (YPD), YPD could be used as a selection pressure, and pCBy314 could be maintained mitotically stable in transformants of yeast Pro3- auxotroph (MB299-7A) in rich medium. At an improved,yet not optimized cultural condition, the expression of ρHCG in culture medium was 650g/L. Our results showed not only that YPD could be used as a selection medium,but also that yeast grew better in YPD so as to increase the gene expression product, and that the component of YPD was simple and cheap. Our data suggested that PRO genes might be used widely in constructing vectors to clone and express foreign genes in yeast so that rich medium can be used as a selection pressure for direct selection.
, 百拇医药
Key words: rich medium used as a selection pressure; mitotically stable secretory expression vector; yeast Pro3+ transformants; expression of β-HCG-cDNA in yeast
酵母是一种单细胞真核生物，具有完整的糖基化和分泌系统，已广泛应用于真核基因表达调控的研究。但在其中合成的外源蛋白产物的稳定性、毒性及反馈抑制等则还有一些具体问题。基因表达产物若能被分泌到宿主体外，则不失为一个理想的解决办法。这个办法既可以简化产物纯化的麻烦步骤，又可以克服外源蛋白被胞内众多蛋白酶所降解，同时也可以避免大量有害外源蛋白堆积在胞内引起的伤害。
酵母中有几种分泌系统，α-栆蜃樱é袞Factor)是其中颇具吸引力的一种。其基因(MFα-1和MFα-2)的功能与结构已研究得比较清楚[1～3]，有好几种外源基因产物，在α-因子前导序列指导下得到合成与分泌,例如人EGF(表皮生长因子epidermal growth factor)[4]、ρHCG(人绒毛膜促性腺素、ρ亚基human chorionic gonadotropin ρ subunit)[5，6]等。曾经有过报道，EGF表达产物量达到10mg/L，产物分泌率高达99%。
, 百拇医药
1979年，Brandriss发现酿酒酵母脯氨酸营养缺陷菌株的独特属性，即它们不能在丰富培基(YPD)中生长，她据此分离出这3个基因的突变体[7]，而这个独特属性的道理则是2年后才得以释明[8]，因为丰富培基中的铵离子(NH+4)抑制了脯氨酸从酿酒酵母的细胞膜外到细胞内的运输系统。
我们实验室用构建在穿梭载体(YRp7)上的酵母基因组文库[9，10]，对大肠杆菌ProC-营养缺陷株进行功能互补，从而克隆了酿酒酵母PRO3基因。这个含有PRO3基因的质粒，命名为pCBy203[9，10]。
我们使用酿酒酵母丰富培基(YPD)作为外源质粒的选择压力，其原理是：利用了酵母脯氨酸营养缺陷型突变株Pro3-受体菌(MB299-7a)在YPD中不能生存，只有当带有PRO3基因的质粒进入受体菌成为Pro3+转化子后，才能制造内源脯氨酸，从而不依赖于培基中的外源脯氨酸，这个Pro3+菌才得以存活下来。因此幸存的都是Pro3+转化子。
, 百拇医药
本文构建的表达型载体综合了分泌型与用丰富培基作为选择压力直接筛选的优点。我们选用ρHCG-CDNA作为报告基因，Stevens在国际上首次获得ρHCG的C端37aa(氨基酸，amino acid)，并鉴定了其免疫活性[11]。美国的Fiddes等已将ρHCG-CDNA在细菌中克隆[12]。两者均有作为免疫避孕疫苗的潜力，ρHCG的表达有潜在的应用价值。
1 材料和方法
1.1菌株
E. coli HB101(F-r-m- recA13 leuB6 SupE44 thi-7), 本实验室库存。
E. coli X28 (proC29 metB1 relA -spoT hsdR- Tcr)由Bachmann赠送(E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, USA)。
, 百拇医药
S. cerevisiae MB299-7A (α- pro3-76 lys cir°)[7，8]由Brandriss赠送(Dept. microbiol.,New Jersey Medical school, Newark, New Jersey, USA)。
1.2 质粒
pCBy203，内含酿酒酵母PRO3基因[9，10]；pCBy301，内含MFα-1的前导序列[5，6]；pCBy304，内含MFα-的前导序列及ρHCG-CDNA[5，6]；pCBy310、pCBy314，本文构建；酿酒酵母基因组文库，见参考文献[9，10]。
1.3 培基
培养细菌用的LB及MS，参照文献[13]；培养酵母用的YPD及SD，参照文献[14]；培基SL：SD (Synthetic yeast nitrogen base without amino acid 67%; dextrose 2%)和lys 100g/ml，选择培基；培基SLP：SL和pro 100g/ml，完全培基。
, 百拇医药
1.4 分子生物学技术
如限制酶切、DNA连接酶连接、粘性末端补平、质粒提取、Apr筛选等，均参照文献[13]。
1.5 酵母转化
参照文献[14，15]。
1.6 ρHCG表达水平检测
用ρHCG放射免疫分析(Radio immunoassay, RIA)试剂盒(购自上海生物制品研究所)，按盒内所附说明书进行，每次均做平行标准曲线。
1.7 质粒pCBy314的有丝分裂稳定性实验
从SL平板上挑取1个pCBy314酵母转化子单菌落(均为Pro3+转化子)，接种至分别含50ml SL、SLP及YPD的三角瓶中，培养24h和48h后，按时由瓶中转接至分别含SL、SLP及YPD的平板上，对其上的菌落计数。 计算在SL和YPD平板上的菌落数与完全培基SLP平板上的菌落数之比，即为含载体的转化子的百分比。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 pCBy310载体的构建(表1)
酵母分泌型表达载体pCBy301[5，6]，含有MFα-的前导序列，我们曾用它在酵母中表达过ρHCG。但是如果没有选择压力，则表现出有丝分裂不稳定性，20世代后仅10%的细胞仍保留着这个质粒。
表1 pCBy314在酵母转化子中的有丝分裂稳定性
Table 1 Mitotic stability of plasmid pCBy314 in yeast transformants growing in different medium 序号
No.
培基
, 百拇医药
Medium
培养时间
Cultural hours
平板用培基
Plate medium
菌落计数
No. of colony
保留pCBy314的转化子的比例(%)
Percent of trasnsformants retauning pCBy314
A
完全培基,SLP
, http://www.100md.com
Complete medium
24h
YPD
28
12.8
SL
21
9.6
SLP
219
48h
YPD
58
, 百拇医药
5.7
SL
52
5.1
SLP
1014
24h
YPD
224
79
B
选择培养基,SL
Selectionmedium
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SL
216
76
SLP
283
48h
YPD
596
88
SL
483
71
SLP
, 百拇医药 677
24h
YPD
151
52
C
丰富培养基
Rich medium
SL
93
32
SLP
292
, 百拇医药
48h
YPD
274
83
SL
49
45
SLP
329
为了构建1个稳定的分泌型，又能用丰富培基作为选择压力的表达载体，我们从pCBy203[9，10]切下PRO3基因，接进pCBy301，构建成pCBy310(图1)。pCBy310含有PRO3基因作为选择标记。这个基因使得我们有可能用YPD作为选择压力。pCBy310也含有酵母2m ori，所以它以多拷贝形式存在于细胞质中。
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图1 pCBy310的构建
Fig.1 Construction of pasmid pCBy310
一般来说，在酿酒酵母中表达外源基因，第1，必须要用 选择压力，包括抗生素、选择性基本培基(selection minimal medium)等，但是抗酵母的抗生素对人也是有害的，因为二者均为真核生物。第2，选择性基本培基的组成包括氨基酸、维生素及酶类等等，都非常昂贵，提高了产物成本。要配齐各种营养物，独缺筛选用的那种营养物，配制又很麻烦。而YPD的成分只有3种，配制简易。第3，酵母在丰富培基中比在选择性基本培基中生长更为旺盛，从而可提高产量。
2.2 pCBy310在E. coli及S. cerevisia中的功能
, 百拇医药 用pCBy310转化E. coli X28(ProC-)，筛选Apr及Pro3+转化子。对这些转化子中的质粒进行鉴定，发现这些质粒与转化前的pCBy310具有相同的限制性酶切图谱。 这说明酵母pCBy310中的PRO3与X28的PROC-功能上互补(图未显示)。
图2 重组质粒pCBy314的构建
Fig.2 Construction of recombinant plasmid pCBy314
βHCG 154 aa cDNA
用pCBy310转化酿酒酵母MB299-7A(Pro3-)，在丰富培基中生长48h后，得到大量的Pro3+转化子。提示pCBy310上的PRO3基因在MB299-7A中是有功能的。
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因为从转化子中可以抽提出质粒来，所以pCBy310在转化子中是游离于细胞质中的，而非整合至任何染色体上。所以这些初步结果说明，丰富培基可以作为筛选Pro+转化子的选择压力用。
2.3 插入表达载体pCBy310中的外源基因的表达
2.3.1 pCBy314的构建与鉴定 ρHCG-CDNA被挑选来作为外源基因插入pCBy310，原因是因为我们实验室已经在酿酒酵母中表达过并分泌过ρHCG[5，6]，而且ρHCG定量检测的RIA试剂盒使ρHCG成为一个测试方便的标记基因。
pCBy314的构建是将ρHCG-CDNA插入pCBy310(图2)。pCBy314限制位点分析的电泳酶切图谱说明，pCBy310上的功能区和HindIII切点都完好(图未显示)。
2.3.2pCBy314在酵母菌中的稳定性 在实际应用丰富培基作为选择压力来筛选pCBy314转化子之前，必须给出明确证据来说明：(1)生长于YPD中的pCBy314转化子中的pCBy314的有丝分裂稳定性；(2)这种稳定性并不是由于pCBy314整合进宿主菌的染色体。
, 百拇医药
为此设计了以下实验来检查pCBy314在酵母转化子中的有丝分裂稳定性(方法见“材
料和方法”节)结果见表1。
表1A说明pCBy314是作为胞质内游离的附加体(cpisome)存在的，在没有选择压力的情况下呈现有丝分裂不稳定性。这就启示pCBy314没有整合到宿主染色体上。在没有选择压力下是不可能稳定遗传的。还说明YPD与SL一样可以用为选择压力，而且在YPD中，转化子生长更为旺盛。表1B及表1C都再次说明YPD可以作为选择压力，而且酵母在其中生长得更旺盛。
2.3.3 ρHCG在酵母中的表达 表2A.为ρHCG表达量及其分泌至培养液中的量：让pCBy310和pCBy314二者的酵母转化子在YPD中生长4d，同时让MB299-7A在完全培基SLP中也生长4d。然后用RIA试剂盒，检测培养液离心后的上清液中ρHCG表达量(见“方法与材料”节，表2A)。
, 百拇医药
表2 βHCG在酵母中的表达量
Table 2 Expression of βHCG in yeast S.cerevisiac 菌株
Strain
培养基
Medium
培养天数
Days after culture
培养液中βHCG量(μg/L)
Amount of βHCG in culture medium
A
, 百拇医药
1.受体菌MB299-7A
Recipient MB299-7A
SLP
4
0
2.pCBy310转化子
pCBy310 yeast transformants
YPD
4
0
3.pCBy314转化子
pCBy310 yeast transformants
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YPD
4
>50
B
pCBy314转化子
pCBy314 yeast transformants
YPD
SL
12
12
62
35
C
, 百拇医药
pCBy314转化子
pCBy314 yeast transformants
优化条件
650
MB299-7A和pCBy310转化子用来作为负对照。表2A说明：MB299-7A及pCBy310转化子中没有内源ρHCG，pCBy314转化子培养液中的ρHCG是ρHCG-CDNA插入pCBy310的结果，而且插入的读框及取向都正确。表2B比较转化子在YPD和SL中的ρHCG表达量：让转化子在YPD及SL中都生长12d，用RIA试剂盒检测ρHCG表达量，分别为62μg/L和35μg/L。表2B说明YPD比SL提供更有效的选择压力和更好的酵母生长条件。
表2C在优化但尚非最佳条件下，酵母抽提粉1.2%，蛋白冻1.8%，葡萄糖2.5%，培养时间18d，ρHCG表达量为650μg/L，ρHCG分泌百分比为95%。可见ρHCG产量尚有提高潜力。
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以上数据说明：脯氨酸合成酶基因在酿酒酵母基因工程中可以广泛地用来构建克隆和表达外源基因的载体。在我们实验室里已经构建了一系列这样的载体，使得用丰富培基直接选择变得更为灵活(见本文及文献[9，10，16～19])。
致谢：深切感谢MC Brandriss赠送的酵母Pro-突变菌株，BJ Bachmann赠送的大肠杆菌X28，VC Stevens赠送的ρHCG及其C端37aa片段的高纯度抗体。
参考文献
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, 百拇医药
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[18]姜伟东，匡达人. 编码P5C还原酶的啤酒酵母7209-1A(a)PRO3基因的分子克隆，表达及鉴定. 科学通报.1986，(10)：1423～1424.
[19]Weidong Jiang, Daren Kuang. Cloning Expression and Characterization of Yeast PRO3 Gene of Yeast S. cerevisiae. 7209-1A(a) Encoding P5C Reductase. Kexue Tongbao, 1987, 32/(24):1710～1711., 百拇医药
单位：中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 200031
关键词：用丰富培基作为选择压力；稳定遗传的分泌型载体；Pro+转化子；ρHCG-CDNA在酵母中表达
遗传学报000413
摘要：构建了一个含酿酒酵母PRO3基因的分泌型表达载体pCBy310，在pCBy310上插入ρHCG(人绒毛膜促性腺激素ρ亚基)-cDNA以形成一个重组质粒pCBy314。利用酿酒酵母脯氨酸合成酶基因缺陷株的独特属性，即它们不能在丰富培基中生长，pCBy314在酿酒酵母Pro3-缺陷株(MB299-A)的转化子可以在丰富培基中生长，而且保持有丝分裂稳定性。在优化条件(但尚非最佳条件)下，ρHCG在培液中的产量是650g/L。说明YPD可以用为选择培基，而且酿酒酵母在YPD中比在选择培基中生长更旺盛，可以提高表达产物的产量，加之YPD的成分简单又便宜。因此得出结论，PRO基因可以广泛地用于构建在酿酒酵母中克隆和表达外源基因的载体，以便用丰富培基作为选择压力直接筛选。
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中图分类号：Q782 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-369-376
Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Secretory Expression Vector
Maintained Stably in Pro3+ Transformants
in Rich Medium
XIE Heng-Yue, TANG Ying, JIANG Wei-Dong, HE Heng-Yi,LIU Ming, KUANG Da-Ren
(Shanghai Institute of Cell Biology， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031, China)
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Abstract: A yeast (Saccharomyces cerevisiae) secretory expression vector containing PRO3 gene was constructed (pCBy310). ρHCG(Human choriogonadotropin ρ subunit)-cDNA was inserted into pCBy310 to form a recombinant plasmid pCBy314. Since yeast proline auxotroph will not survive in rich medium (YPD), YPD could be used as a selection pressure, and pCBy314 could be maintained mitotically stable in transformants of yeast Pro3- auxotroph (MB299-7A) in rich medium. At an improved,yet not optimized cultural condition, the expression of ρHCG in culture medium was 650g/L. Our results showed not only that YPD could be used as a selection medium,but also that yeast grew better in YPD so as to increase the gene expression product, and that the component of YPD was simple and cheap. Our data suggested that PRO genes might be used widely in constructing vectors to clone and express foreign genes in yeast so that rich medium can be used as a selection pressure for direct selection.
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Key words: rich medium used as a selection pressure; mitotically stable secretory expression vector; yeast Pro3+ transformants; expression of β-HCG-cDNA in yeast
酵母是一种单细胞真核生物，具有完整的糖基化和分泌系统，已广泛应用于真核基因表达调控的研究。但在其中合成的外源蛋白产物的稳定性、毒性及反馈抑制等则还有一些具体问题。基因表达产物若能被分泌到宿主体外，则不失为一个理想的解决办法。这个办法既可以简化产物纯化的麻烦步骤，又可以克服外源蛋白被胞内众多蛋白酶所降解，同时也可以避免大量有害外源蛋白堆积在胞内引起的伤害。
酵母中有几种分泌系统，α-栆蜃樱é袞Factor)是其中颇具吸引力的一种。其基因(MFα-1和MFα-2)的功能与结构已研究得比较清楚[1～3]，有好几种外源基因产物，在α-因子前导序列指导下得到合成与分泌,例如人EGF(表皮生长因子epidermal growth factor)[4]、ρHCG(人绒毛膜促性腺素、ρ亚基human chorionic gonadotropin ρ subunit)[5，6]等。曾经有过报道，EGF表达产物量达到10mg/L，产物分泌率高达99%。
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1979年，Brandriss发现酿酒酵母脯氨酸营养缺陷菌株的独特属性，即它们不能在丰富培基(YPD)中生长，她据此分离出这3个基因的突变体[7]，而这个独特属性的道理则是2年后才得以释明[8]，因为丰富培基中的铵离子(NH+4)抑制了脯氨酸从酿酒酵母的细胞膜外到细胞内的运输系统。
我们实验室用构建在穿梭载体(YRp7)上的酵母基因组文库[9，10]，对大肠杆菌ProC-营养缺陷株进行功能互补，从而克隆了酿酒酵母PRO3基因。这个含有PRO3基因的质粒，命名为pCBy203[9，10]。
我们使用酿酒酵母丰富培基(YPD)作为外源质粒的选择压力，其原理是：利用了酵母脯氨酸营养缺陷型突变株Pro3-受体菌(MB299-7a)在YPD中不能生存，只有当带有PRO3基因的质粒进入受体菌成为Pro3+转化子后，才能制造内源脯氨酸，从而不依赖于培基中的外源脯氨酸，这个Pro3+菌才得以存活下来。因此幸存的都是Pro3+转化子。
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本文构建的表达型载体综合了分泌型与用丰富培基作为选择压力直接筛选的优点。我们选用ρHCG-CDNA作为报告基因，Stevens在国际上首次获得ρHCG的C端37aa(氨基酸，amino acid)，并鉴定了其免疫活性[11]。美国的Fiddes等已将ρHCG-CDNA在细菌中克隆[12]。两者均有作为免疫避孕疫苗的潜力，ρHCG的表达有潜在的应用价值。
1 材料和方法
1.1菌株
E. coli HB101(F-r-m- recA13 leuB6 SupE44 thi-7), 本实验室库存。
E. coli X28 (proC29 metB1 relA -spoT hsdR- Tcr)由Bachmann赠送(E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, USA)。
, 百拇医药
S. cerevisiae MB299-7A (α- pro3-76 lys cir°)[7，8]由Brandriss赠送(Dept. microbiol.,New Jersey Medical school, Newark, New Jersey, USA)。
1.2 质粒
pCBy203，内含酿酒酵母PRO3基因[9，10]；pCBy301，内含MFα-1的前导序列[5，6]；pCBy304，内含MFα-的前导序列及ρHCG-CDNA[5，6]；pCBy310、pCBy314，本文构建；酿酒酵母基因组文库，见参考文献[9，10]。
1.3 培基
培养细菌用的LB及MS，参照文献[13]；培养酵母用的YPD及SD，参照文献[14]；培基SL：SD (Synthetic yeast nitrogen base without amino acid 67%; dextrose 2%)和lys 100g/ml，选择培基；培基SLP：SL和pro 100g/ml，完全培基。
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1.4 分子生物学技术
如限制酶切、DNA连接酶连接、粘性末端补平、质粒提取、Apr筛选等，均参照文献[13]。
1.5 酵母转化
参照文献[14，15]。
1.6 ρHCG表达水平检测
用ρHCG放射免疫分析(Radio immunoassay, RIA)试剂盒(购自上海生物制品研究所)，按盒内所附说明书进行，每次均做平行标准曲线。
1.7 质粒pCBy314的有丝分裂稳定性实验
从SL平板上挑取1个pCBy314酵母转化子单菌落(均为Pro3+转化子)，接种至分别含50ml SL、SLP及YPD的三角瓶中，培养24h和48h后，按时由瓶中转接至分别含SL、SLP及YPD的平板上，对其上的菌落计数。 计算在SL和YPD平板上的菌落数与完全培基SLP平板上的菌落数之比，即为含载体的转化子的百分比。
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2 结果与讨论
2.1 pCBy310载体的构建(表1)
酵母分泌型表达载体pCBy301[5，6]，含有MFα-的前导序列，我们曾用它在酵母中表达过ρHCG。但是如果没有选择压力，则表现出有丝分裂不稳定性，20世代后仅10%的细胞仍保留着这个质粒。
表1 pCBy314在酵母转化子中的有丝分裂稳定性
Table 1 Mitotic stability of plasmid pCBy314 in yeast transformants growing in different medium 序号
No.
培基
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Medium
培养时间
Cultural hours
平板用培基
Plate medium
菌落计数
No. of colony
保留pCBy314的转化子的比例(%)
Percent of trasnsformants retauning pCBy314
A
完全培基,SLP
, http://www.100md.com
Complete medium
24h
YPD
28
12.8
SL
21
9.6
SLP
219
48h
YPD
58
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5.7
SL
52
5.1
SLP
1014
24h
YPD
224
79
B
选择培养基,SL
Selectionmedium
, http://www.100md.com
SL
216
76
SLP
283
48h
YPD
596
88
SL
483
71
SLP
, 百拇医药 677
24h
YPD
151
52
C
丰富培养基
Rich medium
SL
93
32
SLP
292
, 百拇医药
48h
YPD
274
83
SL
49
45
SLP
329
为了构建1个稳定的分泌型，又能用丰富培基作为选择压力的表达载体，我们从pCBy203[9，10]切下PRO3基因，接进pCBy301，构建成pCBy310(图1)。pCBy310含有PRO3基因作为选择标记。这个基因使得我们有可能用YPD作为选择压力。pCBy310也含有酵母2m ori，所以它以多拷贝形式存在于细胞质中。
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图1 pCBy310的构建
Fig.1 Construction of pasmid pCBy310
一般来说，在酿酒酵母中表达外源基因，第1，必须要用 选择压力，包括抗生素、选择性基本培基(selection minimal medium)等，但是抗酵母的抗生素对人也是有害的，因为二者均为真核生物。第2，选择性基本培基的组成包括氨基酸、维生素及酶类等等，都非常昂贵，提高了产物成本。要配齐各种营养物，独缺筛选用的那种营养物，配制又很麻烦。而YPD的成分只有3种，配制简易。第3，酵母在丰富培基中比在选择性基本培基中生长更为旺盛，从而可提高产量。
2.2 pCBy310在E. coli及S. cerevisia中的功能
, 百拇医药 用pCBy310转化E. coli X28(ProC-)，筛选Apr及Pro3+转化子。对这些转化子中的质粒进行鉴定，发现这些质粒与转化前的pCBy310具有相同的限制性酶切图谱。 这说明酵母pCBy310中的PRO3与X28的PROC-功能上互补(图未显示)。
图2 重组质粒pCBy314的构建
Fig.2 Construction of recombinant plasmid pCBy314
βHCG 154 aa cDNA用pCBy310转化酿酒酵母MB299-7A(Pro3-)，在丰富培基中生长48h后，得到大量的Pro3+转化子。提示pCBy310上的PRO3基因在MB299-7A中是有功能的。
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因为从转化子中可以抽提出质粒来，所以pCBy310在转化子中是游离于细胞质中的，而非整合至任何染色体上。所以这些初步结果说明，丰富培基可以作为筛选Pro+转化子的选择压力用。
2.3 插入表达载体pCBy310中的外源基因的表达
2.3.1 pCBy314的构建与鉴定 ρHCG-CDNA被挑选来作为外源基因插入pCBy310，原因是因为我们实验室已经在酿酒酵母中表达过并分泌过ρHCG[5，6]，而且ρHCG定量检测的RIA试剂盒使ρHCG成为一个测试方便的标记基因。
pCBy314的构建是将ρHCG-CDNA插入pCBy310(图2)。pCBy314限制位点分析的电泳酶切图谱说明，pCBy310上的功能区和HindIII切点都完好(图未显示)。
2.3.2pCBy314在酵母菌中的稳定性 在实际应用丰富培基作为选择压力来筛选pCBy314转化子之前，必须给出明确证据来说明：(1)生长于YPD中的pCBy314转化子中的pCBy314的有丝分裂稳定性；(2)这种稳定性并不是由于pCBy314整合进宿主菌的染色体。
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为此设计了以下实验来检查pCBy314在酵母转化子中的有丝分裂稳定性(方法见“材
料和方法”节)结果见表1。
表1A说明pCBy314是作为胞质内游离的附加体(cpisome)存在的，在没有选择压力的情况下呈现有丝分裂不稳定性。这就启示pCBy314没有整合到宿主染色体上。在没有选择压力下是不可能稳定遗传的。还说明YPD与SL一样可以用为选择压力，而且在YPD中，转化子生长更为旺盛。表1B及表1C都再次说明YPD可以作为选择压力，而且酵母在其中生长得更旺盛。
2.3.3 ρHCG在酵母中的表达 表2A.为ρHCG表达量及其分泌至培养液中的量：让pCBy310和pCBy314二者的酵母转化子在YPD中生长4d，同时让MB299-7A在完全培基SLP中也生长4d。然后用RIA试剂盒，检测培养液离心后的上清液中ρHCG表达量(见“方法与材料”节，表2A)。
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表2 βHCG在酵母中的表达量
Table 2 Expression of βHCG in yeast S.cerevisiac 菌株
Strain
培养基
Medium
培养天数
Days after culture
培养液中βHCG量(μg/L)
Amount of βHCG in culture medium
A
, 百拇医药
1.受体菌MB299-7A
Recipient MB299-7A
SLP
4
0
2.pCBy310转化子
pCBy310 yeast transformants
YPD
4
0
3.pCBy314转化子
pCBy310 yeast transformants
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YPD
4
>50
B
pCBy314转化子
pCBy314 yeast transformants
YPD
SL
12
12
62
35
C
, 百拇医药
pCBy314转化子
pCBy314 yeast transformants
优化条件
650
MB299-7A和pCBy310转化子用来作为负对照。表2A说明：MB299-7A及pCBy310转化子中没有内源ρHCG，pCBy314转化子培养液中的ρHCG是ρHCG-CDNA插入pCBy310的结果，而且插入的读框及取向都正确。表2B比较转化子在YPD和SL中的ρHCG表达量：让转化子在YPD及SL中都生长12d，用RIA试剂盒检测ρHCG表达量，分别为62μg/L和35μg/L。表2B说明YPD比SL提供更有效的选择压力和更好的酵母生长条件。
表2C在优化但尚非最佳条件下，酵母抽提粉1.2%，蛋白冻1.8%，葡萄糖2.5%，培养时间18d，ρHCG表达量为650μg/L，ρHCG分泌百分比为95%。可见ρHCG产量尚有提高潜力。
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以上数据说明：脯氨酸合成酶基因在酿酒酵母基因工程中可以广泛地用来构建克隆和表达外源基因的载体。在我们实验室里已经构建了一系列这样的载体，使得用丰富培基直接选择变得更为灵活(见本文及文献[9，10，16～19])。
致谢：深切感谢MC Brandriss赠送的酵母Pro-突变菌株，BJ Bachmann赠送的大肠杆菌X28，VC Stevens赠送的ρHCG及其C端37aa片段的高纯度抗体。
参考文献
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