蝰科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)线粒体12S rRNA基因序列分析及其系统发育
作者：周继亮 姚永刚 黄美华 杨大同 吕顺清 张亚平
单位：周继亮 黄美华(浙江大学医学院基础医学系，杭州 310031)；姚永刚 张亚平 周继亮(中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室，昆明 650223)；杨大同 吕顺清(中国科学院昆明动物研究所系统动物学研究室，昆明 650223)
关键词：蝮亚科；12S rRNA；序列分析；分子系统树
遗传学报000401
摘要：对蝮亚科(蛇岛蝮Gloydius shedaoensis Zhao、黑眉蝮Gloydius saxatilis Emelianov、乌苏里蝮Gloydius ussurriensis Emelianov、竹叶青Trimeresurus stejnegeri Schmidt和分别来自不同地区的尖吻蝮Deinagkistrodon acutus Guenther、短尾蝮Gloydius brevicaudus Stejneger各两条)6种蛇共8个个体测定、分析了约370bp线粒体12S rRNA基因序列，以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇Dinodon semicarinatus序列为外群构建分子系统树。分子数据结果支持尖吻蝮形态学的属级分类地位；提示蛇岛蝮位于黑眉蝮的蛇岛亚种分类地位，同时探讨了蛇岛蝮的起源问题；并提示短尾蝮和乌苏里蝮同位于种级分类地位。
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中图分类号：Q595.62 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-283-289
Phylogenetic Relationships Among Viperidae, Crotalinae Based on Mitochondrial 12S rRNA Sequence Variations
ZHOU Ji-iang, HUANG Mei-ua
(Department of Fundamental Medicine, Medical College, Zhejiang University, Hangzhou 310031, China)
ZHOU Ji-iang, YAO Yong-ang,ZHANG Ya-ing
, 百拇医药 (Open Laboratory of Cellular and Molecular Evolution, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)
YANG Da-ong, L Shun-ing
(Institute of System Zoology, Chinese Academy of Sciences,Kunming 650223, China)
Abstract: This paper analyzed the phylogenetic relationships and classification of pit vipers (Viperidae, Crotalinae) based on mitochondrial 12S rRNA gene sequence variations. We have sequenced mtDNA 12S rRNA gene about 370bp fragment from Gloydius saxatilis Emelianov, Gloydius shedaoensis Zhao, Gloydius ussurriensis (Emelianov), Trimeresurus stejnegeri Schmidt and Deinagkistrodon acutus, Gloydius brevicaudus (Stejneger) from two different localities, respectively. Combined with the
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sequence of Dinodon semicarinatus from GenBank, we have constructed two molecular phylogenetic trees using both Maximum杙arsimony analysis and Neighbor杍oining. Our results support the following conclusions: (1) Deinagkistrodon is a valid genus; (2) we also discussed the origin of Gloydius shedaoensis and showed it is a subspecies of Gloydius saxatilis; (3) Gloydius brevicaudsu and Gloydius ussurriensis are classified two species.
Key words: crotalinae; 12S rRNA gene; sequence analysis; molecular phylogenetic tree
, 百拇医药
蝮亚科(Crotalinae)属爬行纲(Reptilia)、有鳞目(Squamata)、蛇亚目(Serpentes)、蝰科(Viperidae)。分布于亚洲、美洲和欧洲大陆。中国有20多个种与亚种。蝮亚科蛇类有很高的经济价值，其中尖吻蝮是中国传统名贵中药材。近年来，由于生态环境恶化和过度捕杀，其资源日益减少，值得重视。蝮蛇属的分类还存在很多争议，主要集中在种和亚种之分[1, 2]。国内外不少学者应用形态特征、鳞片扫描[3]、蛇毒蛋白成分[4]和核型[5]等对其进行分类，但到目前仍主要基于形态学性状的差异，所用方法也是传统的分类法。由于动物线粒体DNA(mtDNA)与核基因存在平行进化关系、严格的母系遗传并且其突变率高、突变固定后形成的DNA多态位点可反映出群体遗传结构、种群分化和种属关系等；另外，mtDNA在动物个体内具有组织均一性、细胞内含量丰富、易于抽提等特点，使其成为研究属、种间系统发育较好的遗传标记[6]。1996年Fred等曾用线粒体ND4基因序列对蝰科蝮亚科属间关系进行了探讨，但对亚洲蝮蛇属的种间关系尚未涉及[7]。线粒体12S rRNA在蛋白合成过程中有重要作用。近年来，应用12S rRNA基因序列研究动物系统发育的文献颇多，主要集中于高等哺乳动物[8,9]，爬行动物报道较少[10]。本研究拟通过测定、分析线粒体12S rRNA基因部分序列，为蝰科蝮亚科的系统发育和分类提供分子生物学依据。
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1 材料和方法
1.1 实验材料
本实验所用材料如表1。
表1 本实验采用的标本
Table 1 The samples used in this research 物种名
The name of speceis
样品状况
Status of samples
采集地点
Locality
采集时间
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Time
1.尖吻蝮
Deinagkistrodon acutus(Guenther)
1
新鲜肝脏
Fresh liver
浙江遂昌县
Suichang Country,Zhejiang Provinvce
1997.9
2.尖吻蝮
Deinagkistrodon acutus (Guenther)
2
, 百拇医药
福尔马林固定肌肉
Formalin-fixed muscle
浙江泰顺县
Taishun Country,Zhejiang Provinvce
1998.5
3.短尾蝮
Gloydius brevicaudus1
新鲜肝脏
Fresh liver
浙江临安县
, 百拇医药
Linan Country,Zhejiang Provinvce
1997.9
4.短尾蝮
Gloydius brevicaudus(Stejeneger)(幼蛇)2
新鲜肌肉
Fresh muscle
陕西宁强县
Ningqiang Country,Shannxi Provinvce
1998.10
5.黑眉蝮
, 百拇医药
Gloydius saxatilis Emelianov
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed muscle
辽宁清原县
Qingyuang Country,Liaoning Provinvce
1997.9
6.蛇岛蝮
Gloydius shedaoensis Zhao
, 百拇医药
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed liver
辽宁蛇岛
Shedao Island,Liaoning Provinvce
1997.9
7.乌苏里蝮
Gloydius ussurriensis (Emelianov)
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed liver
, 百拇医药
吉林永吉县
Yongji Country,Jilin Provinvce
1997.9
8.竹叶青
Trimeresurrs stejeneger Schmidit
新鲜肝脏
Fresh liver
浙江天台县
Tiantai Country,Zhejiang Provinvce
, 百拇医药 1998.5
1.2 DNA的扩增与序列测定
从新鲜组织和液氮冻存组织提取总DNA的方法如下：取肝脏40mg，剪碎后加入500l STE液，其中含有0.2mg的蛋白酶K和1% SDS，56℃温育12h以上，然后用酚、酚氯仿(11)和氯仿分别抽提。乙醇洗涤沉淀。最后用适量TE 8.0缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1mmol/L EDTA)溶解，放置-20℃待用。福尔马林固定组织总DNA的提取参见Andrew等方法[11]并加以改进。PCR引物为L1091/H1478[12]。PCR试剂由上海华美公司提供。反应总体积为50l，每个反应为40个循环，每个循环包括94℃变性60s，36℃退火60s，72℃延伸120s。首次循环前94℃预变性120s，最后一次循环后72℃延伸10min。每次反应设立不含DNA模板的空白对照。扩增得到的PCR产物用2%的琼脂糖(美国FMC公司)割胶经小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收，并取适量回收产物作测序反应。反应产物经Sephadex G-0柱(美国FMC公司)纯化后96℃热变性2min直接作为序列分析的模板。测序试剂采用Perkin朎lmer公司DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit。序列分析仪为美国ABI公司377型全自动序列分析仪。DNA双链至少独立扩增2次以上并分别测序，以确保DNA序列的可靠性。
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1.3 DNA序列数据的处理
我们采用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.) MegAlign程序排列DNA同源序列，并经人工仔细核查。所有序列均被视为无序特征。在此基础上采用PAUP 3.1.1[13]开启式(Heuristic)功能搜寻最简约树；采用Mega 1.02软件[14]选用Kimura双因子参数模型，用“Neigbor杍oining phylogram”方法对得到的DNA序列数据进行聚类分析。以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇(Dinodon semicarinatus) (GenBank序列号：AB008539)[10]为外群构建系统树。系统树各分枝的置信度(Bootstrap)由1 000次重复检验。DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
2 结果
2.1 蝰科蝮亚科序列及变异情况
, 百拇医药 实验共获得蝰科蝮亚科6种蛇、8个个体的长约370bp线粒体12S rRNA基因序列。DNA序列已输入GenBank，序列编号为AF182524和AF124152～AF124158。应用Mega 1.02软件Statistic程序分析序列变异情况(表2)。我们所得到的各物种编码12S rRNA基因片段中A、T、C、G碱基平均含量分别为37.0%、21.2%、24.1%、17.7%。其中A+T含量(58.2%)明显高于G+C(41.8%)含量，这与脊椎动物线粒体DNA L链的碱基组成相一致。由于12S rRNA基因是一非编码基因，在我们所得片段中碱基有较多插入和缺失，其中尖吻蝮5′端有一段8bp缺失。并且转换数高于颠换数，转换发生的频率大约是颠换的2.7倍。其中C
T间的转换比AG间的转换发生得多，AT和AC的颠换明显高于TG和CG。
, 百拇医药
表2 蝰科蝮亚科线粒体12S rRNA基因序列的变异
(对角线以上和以下分别为核苷酸的取代数和颠换数)
Table 2 Mitochondrial 12S rRNA gene sequence variations of pit vipers (Numbers of mucleotide substitutions and numbers of transversions are shown above and below the diagonal,respectively) OTUs
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
9
1.D.semicarinatus
66
66
72
73
75
76
74
68
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2.D.acutus 1
24
0
34
35
38
43
35
44
3.D.acutus 2
24
0
34
, 百拇医药
35
38
43
35
44
4.G.brevicaudus 1
23
9
9
3
15
18
15
, 百拇医药
27
5.G.brevicaudus 2
23
9
9
0
14
17
12
28
6.G.saxatilis
24
6
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6
3
3
6
16
24
7.G.shedaoensis
23
8
8
2
2
1
19
, 百拇医药
28
8.G.ussurriensis
23
10
10
2
2
3
2
30
9.T.stejnegeri
22
9
, 百拇医药
9
9
9
8
7
9
2.2 基于12S rRNA基因部分序列构建的系统树
基于我们得到的序列数据，以半棱鳞链蛇(D. semicarinatus)为外群，构建NJ树和最简约树(图1，a、b)。NJ树置信度1 000次循环检验结果表明分支的最高和最低值分别为100和58，各分枝的枝长和置信度如图1，a所示。简约法构建的最短12S rRNA基因树仅有一棵(图1，b)，其长度为139。两棵树所显示的各供试种的位置和关系几乎一致。
, 百拇医药
图1 基于蝰科蝮亚科12S rRNA基因序列构建的分子系统树
a.基于Kimura双因子参数模型构建的NJ树.枝长代表分歧程度,枝上数值为1000次自助统计得到的对该枝的支持百分数.b.用简约法构建的最简约树.枝上数值为1000次自助重抽样统计得到的对该枝的支持百分数.枝下数值分别为各枝枝长,枝长为139,并代表分歧程度.CI=0.827,HI=0.173
Fig.1 The molecular phylogenetic tree based on 12S r RNA gene seqence variations of pit vipers (Viperidae,Crotalinae)
a.Neighbor-joining phylogram constructed using the Kimura-2-parameters in Mega(1.02).The bootstrap confidence values of each branch are shown above the branch.b.The maximum-parsimony tree derived from heuristic search in PAUP Ver 3.1.1 (Swofford,1993) based on partial 12S rRNA sequence data.All nucleotide substitution characters were specified as unordered and given as equal weight.Bootstrap analysis consisted of 1000 replications.The bootstrp confidence values of each branch and branch lenths are indicated above and below the branch,respectively.Branch lenth is 139.CI=0.827,HI=0.173,respectively
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3 讨论
从我们序列结果可以看出，分别取自浙江遂昌和浙江泰顺的两条尖吻蝮序列无任何差异，而取自浙江临安和陕西宁强的两条短尾蝮的12S rRNA基因序列片段存在差异。从地理分布来看，浙江遂昌和浙江泰顺均属于浙南地区，两地之间没有高山和大河的阻断，严格意义上来说这两条尖吻蝮属同一地区。而取自浙江临安和陕西宁强的两条短尾蝮则相反。这说明地域分布影响了蝮蛇的基因交流，并且12S rRNA基因在蝮蛇种下存在变异。从图1，a、b可以看出，最简约树和NJ树所反映的蝮亚科进化分枝几乎是一致的。所有亚洲蝮属的蛇种首先汇聚，然后与竹叶青聚合，再与尖吻蝮聚集。用简约法构建的分子系统树并没有将乌苏里蝮与其他蝮蛇分开，这可能提示我们得到的序列数据还不够充分。RNA基因茎区和环区的进化速率有所差异，但两区均含有系统发育的信息。利用RNA基因重建系统发育关系时需对两区特别加权，但在有些物种中对这两区的区别加权并无显著效果[15]。因此本文仍赋于茎区和环区相同的加权值，并且得到了分辨率非常好的分子系统树。总之，我们的研究结果显示12S rRNA基因序列对蝮亚科种间系统发育的研究非常有效。
, 百拇医药
3.1 尖吻蝮属的属级分类地位
尖吻蝮(D. acutus)原隶属于蛇目、蝰科、蝮亚科、蝮属，分布于长江中、下游以及中国台湾省和越南北部地区，大约相当于北纬25度～31度之间。《中国爬行动物系统检索》[16]将尖吻蝮归於蝮亚科(Crotalinae)、蝮属(Agkistrodon)，而后Hoge和Romano朒oge将分布于亚洲境内的蝮蛇定名为亚洲蝮属Gloydius[17]，1998年《中国动物志·蛇亚目》[18]一书也采用这一属称。1979年Gloyd首次提出将尖吻蝮从蝮属分离出来另立一新属，称为尖吻蝮属(Deinagkistrodon)[19]。其独立为一属的依据为：(1)尖吻蝮体型较大，可长达1.5m左右；(2)吻鳞与鼻间鳞延伸向上翅形成尖吻；(3)成体背中央及上背侧的鳞片有极发达的结节状突起；(4)靠近尾尖的最下行鳞高大于宽；(5)卵生。这些形态学的特征与蝮蛇有明显区别。1986年《中国两栖爬行动物鉴定手册》[20]和《中国动物志·蛇亚目》[18]将尖吻蝮单独定为尖吻蝮属，此属下只有一种，即尖吻蝮。我们的分子系统树(图1，a、b)表明，尖吻蝮枝位于竹叶青枝和亚洲蝮属枝的外侧，这提示尖吻蝮要先于竹叶青和亚洲蝮属从蝮亚科的共同祖先分化出来。从NJ法计算得到的尖吻蝮与亚洲蝮中遗传距离指数最远的物种是蛇岛蝮，其值为0.1248%。而竹叶青与亚洲蝮属中的乌苏里蝮距离最远，其值只有0.0808%。据此，如果承认竹叶青属的属级分类地位，则按进化生物学观点也应承认尖吻蝮独立为一属。由此可见，我们的分子数据结果支持尖吻蝮从亚洲蝮属中分离并独立成一属。这与鳞片皮纹学[21]、蛇毒蛋白电泳[4]和蝮亚科ND4基因进化[7]等研究结果相一致。
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3.2 蛇岛蝮的起源及分类地位
蛇岛蝮是中国特有的蛇种，仅分布于辽宁省旅顺港附近的蛇岛。1979年赵尔宓到蛇岛考察并查看大量蛇岛蝮标本后将蛇岛蝮定为一新种，并且提示黑眉蝮与其有较近亲缘关系[22,23]。从我们得到的分子系统树(图1，a、b)可以看出蛇岛蝮与黑眉蝮汇聚在一起，具有最近亲缘关系，而与短尾蝮关系较远。根据古生物学和古地质学资料，亚洲蝮属在中新世就分布于胶辽古陆；当晚第三纪中新世后期，受喜玛拉雅造山运动的影响，蛇岛脱离大陆形成岛屿。但是，由于受亚冰期的影响渤海湾海岸线出现摆动，这就意味着蛇岛并未与大陆长期完全隔离。地史资料记载蛇岛最后一次孤立于海中距今大概只有15 000年左右。残留于蛇岛上的蝮蛇逐渐繁衍形成现在一特有种群。由于缺乏必要的化石资料，目前蛇类分歧年代仍不得而知。在哺乳动物中12S rRNA进化速率与细胞色素b (cytochrome b, cyt b)编码基因相似[24]，而cyt b基因进化速率大约为10%/百万年[25]。我们据此来推算蛇岛蝮与亚洲蝮属其他各种的分歧时间：蛇岛蝮与黑眉蝮、短尾蝮的分歧时间分别为1 700、4 400或4 700年，这正是位于第四纪后期爬行动物物种分化和扩张时期。蛇岛蝮与最近亲缘关系的黑眉蝮分歧时间(1 700年)远小于蛇岛最后一次与大陆分离时间(15 000年左右)，这提示蛇岛蝮是先出现地理隔离后才与黑眉蝮产生分化的，说明海岸线摆
, 百拇医药
动对蛇岛蝮在分化过程中与其他蝮蛇的基因交流影响甚小；并且从进化角度讲，15 000千年左右的地理隔离时间对一物种形成是微不足道的，即蛇岛蝮与黑眉蝮在分化过程中并没有形成真正意义上的生殖隔离和地理隔离。而且我们应用的分子钟引自高等哺乳动物，而蛇类的世代时间远短于哺乳动物，以此估算的蛇岛蝮与黑眉蝮分歧时间可能会偏高。综上所述，我们的分子数据结果提示蛇岛蝮正处于物种分化阶段，还没有形成有效种，其位于黑眉蝮的蛇岛亚种分类地位。季达明等[26]从形态学上的研究结果也支持蛇岛蝮是黑眉蝮的亚种的观点。
3.3 亚洲蝮属其他蛇种的分类地位
从图1，a、b可以看出，乌苏里蝮在亚洲蝮属的聚类中独立为一枝，而取自不同地区的两条短尾蝮汇聚在一起。依据以上推算时间，乌苏里蝮与短尾蝮的分歧时间分别为0.00378或0.00288百万年。结合我们cyt b基因的研究结果(待发表)，我们的分子数据支持短尾蝮和乌苏里蝮的种级分类地位。Toriba核型方面的研究也与此观点相吻合[5]。由于取材的限制，日本蝮、中介蝮与本研究中的蛇种的关系有待于进一步研究。
, 百拇医药
致谢：在本论文完成过程中得到浙江大学医学院基础医学系顾肃敏副教授、陈小青、董福明等同志和分子病理实验室来茂德教授的大力帮助，一并感谢。
参考文献
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Abstract: This paper analyzed the phylogenetic relationships and classification of pit vipers (Viperidae, Crotalinae) based on mitochondrial 12S rRNA gene sequence variations. We have sequenced mtDNA 12S rRNA gene about 370bp fragment from Gloydius saxatilis Emelianov, Gloydius shedaoensis Zhao, Gloydius ussurriensis (Emelianov), Trimeresurus stejnegeri Schmidt and Deinagkistrodon acutus, Gloydius brevicaudus (Stejneger) from two different localities, respectively. Combined with the
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Key words: crotalinae; 12S rRNA gene; sequence analysis; molecular phylogenetic tree
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蝮亚科(Crotalinae)属爬行纲(Reptilia)、有鳞目(Squamata)、蛇亚目(Serpentes)、蝰科(Viperidae)。分布于亚洲、美洲和欧洲大陆。中国有20多个种与亚种。蝮亚科蛇类有很高的经济价值，其中尖吻蝮是中国传统名贵中药材。近年来，由于生态环境恶化和过度捕杀，其资源日益减少，值得重视。蝮蛇属的分类还存在很多争议，主要集中在种和亚种之分[1, 2]。国内外不少学者应用形态特征、鳞片扫描[3]、蛇毒蛋白成分[4]和核型[5]等对其进行分类，但到目前仍主要基于形态学性状的差异，所用方法也是传统的分类法。由于动物线粒体DNA(mtDNA)与核基因存在平行进化关系、严格的母系遗传并且其突变率高、突变固定后形成的DNA多态位点可反映出群体遗传结构、种群分化和种属关系等；另外，mtDNA在动物个体内具有组织均一性、细胞内含量丰富、易于抽提等特点，使其成为研究属、种间系统发育较好的遗传标记[6]。1996年Fred等曾用线粒体ND4基因序列对蝰科蝮亚科属间关系进行了探讨，但对亚洲蝮蛇属的种间关系尚未涉及[7]。线粒体12S rRNA在蛋白合成过程中有重要作用。近年来，应用12S rRNA基因序列研究动物系统发育的文献颇多，主要集中于高等哺乳动物[8,9]，爬行动物报道较少[10]。本研究拟通过测定、分析线粒体12S rRNA基因部分序列，为蝰科蝮亚科的系统发育和分类提供分子生物学依据。
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1 材料和方法
1.1 实验材料
本实验所用材料如表1。
表1 本实验采用的标本
Table 1 The samples used in this research 物种名
The name of speceis
样品状况
Status of samples
采集地点
Locality
采集时间
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Time
1.尖吻蝮
Deinagkistrodon acutus(Guenther)
1新鲜肝脏
Fresh liver
浙江遂昌县
Suichang Country,Zhejiang Provinvce
1997.9
2.尖吻蝮
Deinagkistrodon acutus (Guenther)
2, 百拇医药
福尔马林固定肌肉
Formalin-fixed muscle
浙江泰顺县
Taishun Country,Zhejiang Provinvce
1998.5
3.短尾蝮
Gloydius brevicaudus
1新鲜肝脏
Fresh liver
浙江临安县
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Linan Country,Zhejiang Provinvce
1997.9
4.短尾蝮
Gloydius brevicaudus(Stejeneger)(幼蛇)2
新鲜肌肉
Fresh muscle
陕西宁强县
Ningqiang Country,Shannxi Provinvce
1998.10
5.黑眉蝮
, 百拇医药
Gloydius saxatilis Emelianov
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed muscle
辽宁清原县
Qingyuang Country,Liaoning Provinvce
1997.9
6.蛇岛蝮
Gloydius shedaoensis Zhao
, 百拇医药
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed liver
辽宁蛇岛
Shedao Island,Liaoning Provinvce
1997.9
7.乌苏里蝮
Gloydius ussurriensis (Emelianov)
液氮冻存肝脏
Nitrogen-fixed liver
, 百拇医药
吉林永吉县
Yongji Country,Jilin Provinvce
1997.9
8.竹叶青
Trimeresurrs stejeneger Schmidit
新鲜肝脏
Fresh liver
浙江天台县
Tiantai Country,Zhejiang Provinvce
, 百拇医药 1998.5
1.2 DNA的扩增与序列测定
从新鲜组织和液氮冻存组织提取总DNA的方法如下：取肝脏40mg，剪碎后加入500l STE液，其中含有0.2mg的蛋白酶K和1% SDS，56℃温育12h以上，然后用酚、酚氯仿(11)和氯仿分别抽提。乙醇洗涤沉淀。最后用适量TE 8.0缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1mmol/L EDTA)溶解，放置-20℃待用。福尔马林固定组织总DNA的提取参见Andrew等方法[11]并加以改进。PCR引物为L1091/H1478[12]。PCR试剂由上海华美公司提供。反应总体积为50l，每个反应为40个循环，每个循环包括94℃变性60s，36℃退火60s，72℃延伸120s。首次循环前94℃预变性120s，最后一次循环后72℃延伸10min。每次反应设立不含DNA模板的空白对照。扩增得到的PCR产物用2%的琼脂糖(美国FMC公司)割胶经小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收，并取适量回收产物作测序反应。反应产物经Sephadex G-0柱(美国FMC公司)纯化后96℃热变性2min直接作为序列分析的模板。测序试剂采用Perkin朎lmer公司DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit。序列分析仪为美国ABI公司377型全自动序列分析仪。DNA双链至少独立扩增2次以上并分别测序，以确保DNA序列的可靠性。
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1.3 DNA序列数据的处理
我们采用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.) MegAlign程序排列DNA同源序列，并经人工仔细核查。所有序列均被视为无序特征。在此基础上采用PAUP 3.1.1[13]开启式(Heuristic)功能搜寻最简约树；采用Mega 1.02软件[14]选用Kimura双因子参数模型，用“Neigbor杍oining phylogram”方法对得到的DNA序列数据进行聚类分析。以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇(Dinodon semicarinatus) (GenBank序列号：AB008539)[10]为外群构建系统树。系统树各分枝的置信度(Bootstrap)由1 000次重复检验。DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
2 结果
2.1 蝰科蝮亚科序列及变异情况
, 百拇医药 实验共获得蝰科蝮亚科6种蛇、8个个体的长约370bp线粒体12S rRNA基因序列。DNA序列已输入GenBank，序列编号为AF182524和AF124152～AF124158。应用Mega 1.02软件Statistic程序分析序列变异情况(表2)。我们所得到的各物种编码12S rRNA基因片段中A、T、C、G碱基平均含量分别为37.0%、21.2%、24.1%、17.7%。其中A+T含量(58.2%)明显高于G+C(41.8%)含量，这与脊椎动物线粒体DNA L链的碱基组成相一致。由于12S rRNA基因是一非编码基因，在我们所得片段中碱基有较多插入和缺失，其中尖吻蝮5′端有一段8bp缺失。并且转换数高于颠换数，转换发生的频率大约是颠换的2.7倍。其中C
T间的转换比AG间的转换发生得多，AT和AC的颠换明显高于TG和CG。, 百拇医药
表2 蝰科蝮亚科线粒体12S rRNA基因序列的变异
(对角线以上和以下分别为核苷酸的取代数和颠换数)
Table 2 Mitochondrial 12S rRNA gene sequence variations of pit vipers (Numbers of mucleotide substitutions and numbers of transversions are shown above and below the diagonal,respectively) OTUs
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
9
1.D.semicarinatus
66
66
72
73
75
76
74
68
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2.D.acutus 1
24
0
34
35
38
43
35
44
3.D.acutus 2
24
0
34
, 百拇医药
35
38
43
35
44
4.G.brevicaudus 1
23
9
9
3
15
18
15
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27
5.G.brevicaudus 2
23
9
9
0
14
17
12
28
6.G.saxatilis
24
6
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6
3
3
6
16
24
7.G.shedaoensis
23
8
8
2
2
1
19
, 百拇医药
28
8.G.ussurriensis
23
10
10
2
2
3
2
30
9.T.stejnegeri
22
9
, 百拇医药
9
9
9
8
7
9
2.2 基于12S rRNA基因部分序列构建的系统树
基于我们得到的序列数据，以半棱鳞链蛇(D. semicarinatus)为外群，构建NJ树和最简约树(图1，a、b)。NJ树置信度1 000次循环检验结果表明分支的最高和最低值分别为100和58，各分枝的枝长和置信度如图1，a所示。简约法构建的最短12S rRNA基因树仅有一棵(图1，b)，其长度为139。两棵树所显示的各供试种的位置和关系几乎一致。
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图1 基于蝰科蝮亚科12S rRNA基因序列构建的分子系统树
a.基于Kimura双因子参数模型构建的NJ树.枝长代表分歧程度,枝上数值为1000次自助统计得到的对该枝的支持百分数.b.用简约法构建的最简约树.枝上数值为1000次自助重抽样统计得到的对该枝的支持百分数.枝下数值分别为各枝枝长,枝长为139,并代表分歧程度.CI=0.827,HI=0.173
Fig.1 The molecular phylogenetic tree based on 12S r RNA gene seqence variations of pit vipers (Viperidae,Crotalinae)
a.Neighbor-joining phylogram constructed using the Kimura-2-parameters in Mega(1.02).The bootstrap confidence values of each branch are shown above the branch.b.The maximum-parsimony tree derived from heuristic search in PAUP Ver 3.1.1 (Swofford,1993) based on partial 12S rRNA sequence data.All nucleotide substitution characters were specified as unordered and given as equal weight.Bootstrap analysis consisted of 1000 replications.The bootstrp confidence values of each branch and branch lenths are indicated above and below the branch,respectively.Branch lenth is 139.CI=0.827,HI=0.173,respectively
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3 讨论
从我们序列结果可以看出，分别取自浙江遂昌和浙江泰顺的两条尖吻蝮序列无任何差异，而取自浙江临安和陕西宁强的两条短尾蝮的12S rRNA基因序列片段存在差异。从地理分布来看，浙江遂昌和浙江泰顺均属于浙南地区，两地之间没有高山和大河的阻断，严格意义上来说这两条尖吻蝮属同一地区。而取自浙江临安和陕西宁强的两条短尾蝮则相反。这说明地域分布影响了蝮蛇的基因交流，并且12S rRNA基因在蝮蛇种下存在变异。从图1，a、b可以看出，最简约树和NJ树所反映的蝮亚科进化分枝几乎是一致的。所有亚洲蝮属的蛇种首先汇聚，然后与竹叶青聚合，再与尖吻蝮聚集。用简约法构建的分子系统树并没有将乌苏里蝮与其他蝮蛇分开，这可能提示我们得到的序列数据还不够充分。RNA基因茎区和环区的进化速率有所差异，但两区均含有系统发育的信息。利用RNA基因重建系统发育关系时需对两区特别加权，但在有些物种中对这两区的区别加权并无显著效果[15]。因此本文仍赋于茎区和环区相同的加权值，并且得到了分辨率非常好的分子系统树。总之，我们的研究结果显示12S rRNA基因序列对蝮亚科种间系统发育的研究非常有效。
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3.1 尖吻蝮属的属级分类地位
尖吻蝮(D. acutus)原隶属于蛇目、蝰科、蝮亚科、蝮属，分布于长江中、下游以及中国台湾省和越南北部地区，大约相当于北纬25度～31度之间。《中国爬行动物系统检索》[16]将尖吻蝮归於蝮亚科(Crotalinae)、蝮属(Agkistrodon)，而后Hoge和Romano朒oge将分布于亚洲境内的蝮蛇定名为亚洲蝮属Gloydius[17]，1998年《中国动物志·蛇亚目》[18]一书也采用这一属称。1979年Gloyd首次提出将尖吻蝮从蝮属分离出来另立一新属，称为尖吻蝮属(Deinagkistrodon)[19]。其独立为一属的依据为：(1)尖吻蝮体型较大，可长达1.5m左右；(2)吻鳞与鼻间鳞延伸向上翅形成尖吻；(3)成体背中央及上背侧的鳞片有极发达的结节状突起；(4)靠近尾尖的最下行鳞高大于宽；(5)卵生。这些形态学的特征与蝮蛇有明显区别。1986年《中国两栖爬行动物鉴定手册》[20]和《中国动物志·蛇亚目》[18]将尖吻蝮单独定为尖吻蝮属，此属下只有一种，即尖吻蝮。我们的分子系统树(图1，a、b)表明，尖吻蝮枝位于竹叶青枝和亚洲蝮属枝的外侧，这提示尖吻蝮要先于竹叶青和亚洲蝮属从蝮亚科的共同祖先分化出来。从NJ法计算得到的尖吻蝮与亚洲蝮中遗传距离指数最远的物种是蛇岛蝮，其值为0.1248%。而竹叶青与亚洲蝮属中的乌苏里蝮距离最远，其值只有0.0808%。据此，如果承认竹叶青属的属级分类地位，则按进化生物学观点也应承认尖吻蝮独立为一属。由此可见，我们的分子数据结果支持尖吻蝮从亚洲蝮属中分离并独立成一属。这与鳞片皮纹学[21]、蛇毒蛋白电泳[4]和蝮亚科ND4基因进化[7]等研究结果相一致。
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3.2 蛇岛蝮的起源及分类地位
蛇岛蝮是中国特有的蛇种，仅分布于辽宁省旅顺港附近的蛇岛。1979年赵尔宓到蛇岛考察并查看大量蛇岛蝮标本后将蛇岛蝮定为一新种，并且提示黑眉蝮与其有较近亲缘关系[22,23]。从我们得到的分子系统树(图1，a、b)可以看出蛇岛蝮与黑眉蝮汇聚在一起，具有最近亲缘关系，而与短尾蝮关系较远。根据古生物学和古地质学资料，亚洲蝮属在中新世就分布于胶辽古陆；当晚第三纪中新世后期，受喜玛拉雅造山运动的影响，蛇岛脱离大陆形成岛屿。但是，由于受亚冰期的影响渤海湾海岸线出现摆动，这就意味着蛇岛并未与大陆长期完全隔离。地史资料记载蛇岛最后一次孤立于海中距今大概只有15 000年左右。残留于蛇岛上的蝮蛇逐渐繁衍形成现在一特有种群。由于缺乏必要的化石资料，目前蛇类分歧年代仍不得而知。在哺乳动物中12S rRNA进化速率与细胞色素b (cytochrome b, cyt b)编码基因相似[24]，而cyt b基因进化速率大约为10%/百万年[25]。我们据此来推算蛇岛蝮与亚洲蝮属其他各种的分歧时间：蛇岛蝮与黑眉蝮、短尾蝮的分歧时间分别为1 700、4 400或4 700年，这正是位于第四纪后期爬行动物物种分化和扩张时期。蛇岛蝮与最近亲缘关系的黑眉蝮分歧时间(1 700年)远小于蛇岛最后一次与大陆分离时间(15 000年左右)，这提示蛇岛蝮是先出现地理隔离后才与黑眉蝮产生分化的，说明海岸线摆
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动对蛇岛蝮在分化过程中与其他蝮蛇的基因交流影响甚小；并且从进化角度讲，15 000千年左右的地理隔离时间对一物种形成是微不足道的，即蛇岛蝮与黑眉蝮在分化过程中并没有形成真正意义上的生殖隔离和地理隔离。而且我们应用的分子钟引自高等哺乳动物，而蛇类的世代时间远短于哺乳动物，以此估算的蛇岛蝮与黑眉蝮分歧时间可能会偏高。综上所述，我们的分子数据结果提示蛇岛蝮正处于物种分化阶段，还没有形成有效种，其位于黑眉蝮的蛇岛亚种分类地位。季达明等[26]从形态学上的研究结果也支持蛇岛蝮是黑眉蝮的亚种的观点。
3.3 亚洲蝮属其他蛇种的分类地位
从图1，a、b可以看出，乌苏里蝮在亚洲蝮属的聚类中独立为一枝，而取自不同地区的两条短尾蝮汇聚在一起。依据以上推算时间，乌苏里蝮与短尾蝮的分歧时间分别为0.00378或0.00288百万年。结合我们cyt b基因的研究结果(待发表)，我们的分子数据支持短尾蝮和乌苏里蝮的种级分类地位。Toriba核型方面的研究也与此观点相吻合[5]。由于取材的限制，日本蝮、中介蝮与本研究中的蛇种的关系有待于进一步研究。
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致谢：在本论文完成过程中得到浙江大学医学院基础医学系顾肃敏副教授、陈小青、董福明等同志和分子病理实验室来茂德教授的大力帮助，一并感谢。
参考文献
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