T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能
作者：李月琴 朱嘉明 李弘剑 谢卫兵 周天鸿 王彤歌
单位：李月琴 朱嘉明 李弘剑 谢卫兵 周天鸿(暨南大学生物工程系，广州 510632)；王彤歌(暨南大学附属医院， 广州 510630)
关键词：T7启动子；顺式作用因子；真核生物RNA聚合酶；转录起始
遗传学报000512
摘要：根据α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制，以氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)作为报道基因进行体内表达实验，证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA聚合酶所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶沪动技术,分别以TATA框,CAAT框,GC框和八核苷酸序列(octamer)为竞争性寡核苷酸分子，发现人工合成的T7启动子可能与TFD起始转录因子结合，形成DNA-核蛋白质结合物。TATA框和八核苷酸序列分别接入T7启动子上游，CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶对T7启动子的转录起始作用。实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶的顺式作用因子。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q754 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2000)05-0455-07
The Function of T7 Promoter as cis-Acting Elements for
Polymerase II in Eukaryotic Cell
LI YueQin ZHU JiaMing LI HongJian XIE WeiBing ZHOU TianHong
(Department of Biotechnology Jinan University, Guangzhou 510632, China)
WANG TongGe
(Affiliated Hospital of Jinan University Medical College, Guangzhou 510630, China)
, 百拇医药
Abstract:Using the chlorampheniol acetyltransterase gene as reporter, the function of phage T7 promoter in mammalian cells was studied by inhibition of transcription with α-amanitin. The experiment proved that the reporter under T7 promoter was transcribed by RNA polymerase II. Competitive electropho retic mobility shift assay (CEMSA) with TATA box, CAAT box, GC box and octamer showed that the TATA box was competitive molecular for synthetic T7 promoter. It is possible that T7 promoter is bound with TF D transcription factor. The TATA box and octamer were inserted into Pvu site upstream from the T7 promoter of pT7CAT. Two recombinant plasmids, pT7TATACAT and pT7OCTCAT, were constructed and transfected into CHO cells. CAT-activity test showed that T7 promoter strength was increased by octamer factor, not by TATA box. These results suggested that T7 promoter functions as cis-acting elements of RNA polymerase transcriptional system in eucaryotic cells.
, http://www.100md.com
Key words: T7 promoter； cis-acting element; RNA polymerase ; Initiation of transcriptionss
T7噬菌体晚期转录系统是特殊的表达系统，其启动子为III型启动子，不能被宿主大肠杆菌
RNA聚合酶识别，只为噬菌体本身编码的T7 RNA聚合酶所识别[1]。T7启动子/T7 RNA聚合酶系统已得到较为深入的研究，并被广泛应用于基因工程中。近年又发现了T7 型启动子也能被哺乳类动物细胞转录系统所启动[2,3]。原核生物和真核生物转录系统具有明显的差异，T7启动子能为两个系统的RNA聚合酶所识别，其独特性值得注意。真核生物转录系统依赖于顺式作用因子(cis-cting element)和反式作用因子(trans-cting element)的相互作用。现已发现多种真核生物转录系统的顺式和反式作用因子，如顺式作用因子TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列(octamer)等，反式作用因子如TBP、CTF、SPl等[4]。反式作用因子通过与顺式作用因子的特异性结合启动真核生物RNA聚合酶对基因的转录。 因此顺式作用因子一般在体外具有与反式作用因子特异性形成DNA-蛋白质复合物的功能，另外真核生物顺式作用因子还具有与其他顺式作用因子一起增强或减弱转录起始的功能。T7启动子能独立地为真核生物表达系统所启动，为确定该序列作为真核生物转录系统顺式作用因子的功能，本文利用CAT基因作为报道基因和竞争性凝胶泳动技术，进一步研究了T7启动子在真核生物转录系统中的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
质粒pT7CAT为前文[2]所构建。各种酶试剂和CAT测试盒购自Promega公司。序列测定试剂盒购自USB公司。α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)购自BioLabs公司。BioTeZ公司合成寡聚核苷酸：T7启动子2条正负序列为T71：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′；T72序列为5′-CTCCCTATAGTG-GTCGTATTA-3′。TATA框2条正负链分别为TA1：5′-ATAAAA-3′；TA2：5′-TTTATA-3′。CAAT框2条正负链分别为CA1：5′-GCCAATCT-3′；CA2：5′-GATTGGCC-3′ 。GC框2条正负链GC1：5′-GGCGG-3′；GC2：5′-CGCCC-3′。八核苷酸序列2条正负链分别为OC1：5′-TTTGCAT-3′；OC2：5′-TGCAAAT-3′ 。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 常规分子生物学技术 DNA分子的体外重组，大肠杆菌DM52的转化，重组DNA分子的序列测定证实，磷酸钙朌NA沉淀法转化CHOJT细胞和HeLa细胞培养根据文献[5]提供的方法进行。
1.2.2 CAT活性检测 CAT实验主要按照文献[2，6]方法进行。106的CHO JT细胞抽提物与0.5Ci的14C-氯霉素在37℃下保温1h。点样于TLC硅胶板上，氯仿和甲醇中薄层层析分离产物，放射性自显影鉴定。其中进行α-鹅膏蕈碱敏感实验时,培养的细胞在DNA转染后，分别在不同的时间内在细胞培养液中添加10g/ml的α-鹅膏蕈碱,35h培养后收获细胞，测试CAT活性。
1.2.3 竞争性凝胶泳动实验 HeLa细胞常规培养至总量1010个，根据Andrews方法[7]制备核提取物。人工合成的T7启动子2条T71和T72寡聚核苷酸片段用γ-32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶进行末
, 百拇医药
端标记。标记产物经Sephadex G-25柱分离纯化。常规的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验如下:20μl体积的反应液中含有cpm值约为5000的标记寡聚核苷酸，10μg的核抽提物，0.5μg的Poly(dI/dC)，10mmol/L Tris-HC1(pH7.9),10mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl, 1mmol/L DTT, 0.5mmol/L EDTA和5%的甘油，室温下放置30min。DNA-蛋白质复合物于5%低离子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，80℃真空干胶，-70℃放射自显影。进行竞争性的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验时,寡聚核苷酸序列除了T7启动子外，分别加入100倍(克分子数)于T7启动子的寡核苷酸序列作为DNA结合蛋白的特异性竞争性序列，其余步骤按常规的凝胶泳动实验进行。
2 结果
2.1 T7启动子为真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别
, 百拇医药 真核生物转录系统共有3种RNA聚合酶：RNA聚合酶(PolⅠ)、RNA聚合酶(PolⅡ)和RNA聚合酶(PolⅢ)。这些RNA聚合酶分别识别不同类型的启动子，并对α-鹅膏蕈碱表现出游同的敏感度.α-鹅膏蕈碱不影响Pol Ⅰ的启动转录活性，但对PolⅡ和Pol Ⅲ的转录起抑制作用，不过其抑制浓度不同，当α-鹅膏蕈碱浓度在1μg/ml以上时，将抑制PolⅡ的活性；α-鹅膏蕈碱浓度在100μg/ml以上时，则抑制Pol 的活性，体内和体外实验都表现出同一现象[8]。根据这一机制，将含有在T7启动子下游组装有CAT基因的pT7CAT质粒3μg转染CHO JT细胞(1×105)，转染后的细胞在5h、20h、30h时分别加入10μg/ml的α-鹅膏蕈碱,各批细胞均培养35h，进行CAT实验(图1)：0h和20h时加入α-鹅膏蕈碱,基本上不能检出CAT活性，30h时加入α-鹅膏蕈碱的转染细胞能检出约20%的CAT活性。10μg/ml的α-鹅膏蕈碱抑制了真核生物转录系统对T7启动子的启动作用。实验显示真核生物RNA Pol Ⅱ负责对T7启动子的转录起始。
, 百拇医药
图1 α-鹅膏蕈碱对T7启动子控制的报道基因产物CAT活性影响检测
A、B、C：分别为转染细胞收获前30h、15h、和5h时加入α-鹅膏蕈碱的实验；D：转染细胞不加α-鹅膏蕈碱
Fig.1 CAT activity from T7 promoter with α-amanitin in the CHO cells A,B,C:CAT activity from the cells exposed to α-amanitin for the last 30h,15h,5h before cells harvesting,respectively;D:CAT activity fromthe cell in absence of α-amanitin
2.2 T7启动子是TBP蛋白的结合序列
真核生物RNA聚合酶识别的启始子控制mRNA的转录，此类启动子包含有多种顺式作用因子，常见的顺式作用因子有TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列。这些序列和相应转录因子结合在转录起始中起作用。T7启动子为RNA聚合酶所识别，启动报道基因的转录。为研究T7启动子与转录因子的作用，利用竞争性凝胶泳动技术(competitive electrophoretic mobility shift assay, CEMSA)来检测T7启动子作为真核生物RNA聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能。实验将已知相应结合蛋白的TATA框、GAAT框、GC框和八核苷酸序列(octamer)作为竞争性分子来测定T7启动子的结合蛋白因子(图2)：在没有竞争性分子存在时，人工合成23bp的T7启动子，可与HeLa细胞核抽提物形成一个复合物(图2，A)；当加入标记的T7启动子和未标记的TATA序列时(克分子数比例为1100)进行竞争实验时，原先的DNA-蛋白质带放射性强度大减弱(图2，B)，表明TATA序列与T7启动子竞争结合蛋白质因子，由于未标记的TATA序列数量上远多于标记的T7启动子序列，所以放射性DNA-蛋白制裁带减弱,结果显示T7启动子能与真核生物TATA结合蛋白结合。图2，C、图2，D和图2，E中的竞争性分子分别是CAAT框、GC框和八核苷酸序列，这些实验中的放射性DNA-蛋白质带依然保持,表明T7启动子结合的蛋白与上述3个DNA序列识别的蛋白质因子是不一样的。TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列分别为TBP、CTF/NF1、SP1和Oct-1所特异性结合[9]，因此竞争性凝胶泳动技术表明T7启动子在真核生物转录系统中是与TBP蛋白质结合的顺式元件。
, 百拇医药
图2 竞争性凝胶泳动实验放射性自显影图
A：无竞争性分子时的CEMSA实验；B、C、D、E：竞争分子分别为无标记的TATA框、CAAT框、GC框、和八核苷酸的CEMSA实验
Fig.2 Autoradiograms of competitive electrophoretic mobility shift assay
A:CEMSA with end-labelled T7 promoter;B,C,D,E:CEMSA with end-labelled T7 promoter and TATA box,CAAT box,GC box ,and octamer ,respectively
2.3 八核苷酸序列和TATA序列对T7启动子的作用
, 百拇医药 质粒pT7CAT是将CAT基因接入pGEM质粒T7启动子下游构建而成，利用质粒T7启动子上游第15个碱基的Pvu 酶切位点。将人工合成的TATA序列和八核酸序列分别插入pT7CAT质粒T7启动子上游，构建成pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒。测序证实两个调控序列已插入PvuⅡ位点(图3和图4)。将pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒各3g转染CHO JT细胞(5×104)，转染后的细胞培养30h，进行CAT实验：pT7TATACAT和pT7CAT质粒表达的CAT基因产物活性差别不大(图5，A和图5，B)。但pT70CTCAT质粒表达的CAT活性比pT7CAT表达的活性要强得多(图5，C和图5，D)，显示八核苷酸序列能增强T7启动子的RNA聚合酶Ⅱ所启动的功能。在真核生物转录中TATA序列作为定位因子起作用的，而八核苷酸序列能增强真核生物启动子的转录功能。实验结果证明了T7启动子能作为真核生物转录启动元件的功能。
图3 重组进pT7质粒的TATA框序列
, 百拇医药
Fig.3 TATA box inserted in pT7CAT
图4 重组进pT7质粒的八核苷酸序列
Fig.4 Octamer inserdted in pT7CAT
图5 调控序列对T7启动子启动CAT基因表达的影响
A：T7启动子控制下的CAT活性；B：T7启动子和TATA框控制下的CAT活性；C、D：T7启动子和八核工业苷酸序列控制下的CAT活性
Fig.5 CAT activity from T7 promoter under the sequence elements
, 百拇医药
A:CAT activity from T7 promoter under the sequence elements control of T7mpromoter,B:CAT activity from teh cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and TATA box;C,D:CAT activity from the cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and octamer
3 讨论
原核和真核细胞的转录系统有着明显的差异，原核生物较为简单，通常细胞内只有1种RNA聚合酶，真核生物细胞内则有3种RNA聚合酶。从整体的转录机制看，Pol Ⅰ和PolⅢ 的转录系统较为简单，更类似于原核生物，但α-鹅膏蕈碱实验显示人微言轻原核系统的T7启动子在真核生物细胞内的作用是依赖于PolⅡ系统。PolⅡ系统是细胞内最为复杂的转录系统，其识别因子多达数十个，T7启动子长仅为23bp，它为何种蛋白质因子所识别，这是人们关心的问题。竞争性DNA-收据结合凝胶泳动实验显示T7启动子结合的反式作用因子与TATA序列结合的因子是一样的。目前已经知道识别TATA序列是TFⅡD 因子，TFⅡD因子是PolⅡ系统基础转录的一个重要反式作用因子，它含有TBP和TAFs两类蛋白质因子，其中TBP是DNA序列识别因子，结合到特异的序列上，从而触发RNA聚合酶转录的起始[10]。T7启动子能与TFⅡD结合，显示了该启动子在PolⅡ系统中作为类似TATA序列顺式作用因子的可能性。真核生物TATA序列具有保守性，其碱基以TA碱基对为主，本实验采用的T7启动子共有23bp，它的序列5′端的5个碱基(TAATA)是AT碱基对，可能这一区域是TFⅡD因子的TBP蛋白识别结合序列，其突变鉴定研究正在进行中。
, 百拇医药
真核生物PolⅡ系统包含有许多顺式作用因子，这些顺式作用因子以“Mix and Match”模式起作用，即不同的顺式作用因子共同或协同起作用。如果T7启动子作为PolⅡ系统的一个顺式作用元件，它将具有与其他顺式作用元件相互作用调控转录起始的功能。本文实验中将八核苷酸序列置于T7启动子上游，增强了转录的起始，表明顺式作用元件八核苷酸序列能与T7启动子作用，即T7启动子确实也是PolⅡ系统的一个顺式作用元件。但当将TATA序列置于T7启动子上游时，并不能增强报道基因的表达活性。从目前实验结果看T7启动子在PolⅡ系统转录中起的作用可能与TATA序列相仿，但加上一个典型的TATA序列也不能增强启动活性，证实了TATA序列与原核生物-10序列功能上的差异，尽管两者都是由TA碱基对组成，但原核生物-10序列与转录的强度有关，而真核生物TATA序列则与转录的定位相关[4]。
T7启动子可能作为TATA序列类似功能的特殊的元件被PolⅡ系统识别。但在Pol系统中，TATA序列不象原核生物启动子的-10序列那样是必不可少的，PolⅡ系统最基本和必要的顺式元件是起始子(initiator)， pT7CAT和衍生质粒中T7启动子区域能被Pol系统起始，说明该区域中应具有起始子，或者Pol 系统有目前尚未知的起始机制。从目前研究看，报道基因mRNA5′末端和T7启动子序列分析显示启动子含有一个类似起始子的序列，突变实验也证实该序列的重要性(另文报道)，所以23碱基对的T7启动子可能还包含着类似起始子的顺式作用因子，对它们的研究将促进对Pol Ⅱ系统转录起始的了解。
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国家自然科学基金资助(39770411)
参考文献
[1]Moffet B A et al. Nucleotide sequences of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1984, 173:265～269.
[2]周天鸿等. T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究. 生物化学杂志，1997，13：(2)154～158.
[3]Bahring S et al., Mapping of transcriptional start and capping points by a modified 5′ RACE technique. Biotechniques, 1994, 16:807～808.
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[4]Lewin B. In: Genes Oxford University Press and Cell Press, 1997. 817～845.
[5]Sambrook J et al. Molecular Cloning: A Laboratory Mannal. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[6]Gorman C M et al. High efficiency DNA-mediated transformation of primate cells. Science, 1983, 221:551～553.
[7]Andrews Nc et al. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA-binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acid Res., 1991, 19:2499～2500.
, 百拇医药
[8]Alberts B et al. In: Molecular Biology of the Cell. New York: Gardan Publishing Inc., 1989, 525.
[9]Zawel L et al. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 1993, 44:67～103.
[10]Burley S K et al. Biochemistry and structural biology of transcription factor II D (TF II D). Ann. Rev. Biochem., 1996, 65:769～800.
1999-04-12
1999-06-30, 百拇医药
单位：李月琴 朱嘉明 李弘剑 谢卫兵 周天鸿(暨南大学生物工程系，广州 510632)；王彤歌(暨南大学附属医院， 广州 510630)
关键词：T7启动子；顺式作用因子；真核生物RNA聚合酶；转录起始
遗传学报000512
摘要：根据α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制，以氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)作为报道基因进行体内表达实验，证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA聚合酶所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶沪动技术,分别以TATA框,CAAT框,GC框和八核苷酸序列(octamer)为竞争性寡核苷酸分子，发现人工合成的T7启动子可能与TFD起始转录因子结合，形成DNA-核蛋白质结合物。TATA框和八核苷酸序列分别接入T7启动子上游，CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶对T7启动子的转录起始作用。实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶的顺式作用因子。
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中图分类号：Q754 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2000)05-0455-07
The Function of T7 Promoter as cis-Acting Elements for
Polymerase II in Eukaryotic Cell
LI YueQin ZHU JiaMing LI HongJian XIE WeiBing ZHOU TianHong
(Department of Biotechnology Jinan University, Guangzhou 510632, China)
WANG TongGe
(Affiliated Hospital of Jinan University Medical College, Guangzhou 510630, China)
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Abstract:Using the chlorampheniol acetyltransterase gene as reporter, the function of phage T7 promoter in mammalian cells was studied by inhibition of transcription with α-amanitin. The experiment proved that the reporter under T7 promoter was transcribed by RNA polymerase II. Competitive electropho retic mobility shift assay (CEMSA) with TATA box, CAAT box, GC box and octamer showed that the TATA box was competitive molecular for synthetic T7 promoter. It is possible that T7 promoter is bound with TF D transcription factor. The TATA box and octamer were inserted into Pvu site upstream from the T7 promoter of pT7CAT. Two recombinant plasmids, pT7TATACAT and pT7OCTCAT, were constructed and transfected into CHO cells. CAT-activity test showed that T7 promoter strength was increased by octamer factor, not by TATA box. These results suggested that T7 promoter functions as cis-acting elements of RNA polymerase transcriptional system in eucaryotic cells.
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Key words: T7 promoter； cis-acting element; RNA polymerase ; Initiation of transcriptionss
T7噬菌体晚期转录系统是特殊的表达系统，其启动子为III型启动子，不能被宿主大肠杆菌
RNA聚合酶识别，只为噬菌体本身编码的T7 RNA聚合酶所识别[1]。T7启动子/T7 RNA聚合酶系统已得到较为深入的研究，并被广泛应用于基因工程中。近年又发现了T7 型启动子也能被哺乳类动物细胞转录系统所启动[2,3]。原核生物和真核生物转录系统具有明显的差异，T7启动子能为两个系统的RNA聚合酶所识别，其独特性值得注意。真核生物转录系统依赖于顺式作用因子(cis-cting element)和反式作用因子(trans-cting element)的相互作用。现已发现多种真核生物转录系统的顺式和反式作用因子，如顺式作用因子TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列(octamer)等，反式作用因子如TBP、CTF、SPl等[4]。反式作用因子通过与顺式作用因子的特异性结合启动真核生物RNA聚合酶对基因的转录。 因此顺式作用因子一般在体外具有与反式作用因子特异性形成DNA-蛋白质复合物的功能，另外真核生物顺式作用因子还具有与其他顺式作用因子一起增强或减弱转录起始的功能。T7启动子能独立地为真核生物表达系统所启动，为确定该序列作为真核生物转录系统顺式作用因子的功能，本文利用CAT基因作为报道基因和竞争性凝胶泳动技术，进一步研究了T7启动子在真核生物转录系统中的作用。
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1 材料和方法
1.1 材料
质粒pT7CAT为前文[2]所构建。各种酶试剂和CAT测试盒购自Promega公司。序列测定试剂盒购自USB公司。α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)购自BioLabs公司。BioTeZ公司合成寡聚核苷酸：T7启动子2条正负序列为T71：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′；T72序列为5′-CTCCCTATAGTG-GTCGTATTA-3′。TATA框2条正负链分别为TA1：5′-ATAAAA-3′；TA2：5′-TTTATA-3′。CAAT框2条正负链分别为CA1：5′-GCCAATCT-3′；CA2：5′-GATTGGCC-3′ 。GC框2条正负链GC1：5′-GGCGG-3′；GC2：5′-CGCCC-3′。八核苷酸序列2条正负链分别为OC1：5′-TTTGCAT-3′；OC2：5′-TGCAAAT-3′ 。
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1.2 方法
1.2.1 常规分子生物学技术 DNA分子的体外重组，大肠杆菌DM52的转化，重组DNA分子的序列测定证实，磷酸钙朌NA沉淀法转化CHOJT细胞和HeLa细胞培养根据文献[5]提供的方法进行。
1.2.2 CAT活性检测 CAT实验主要按照文献[2，6]方法进行。106的CHO JT细胞抽提物与0.5Ci的14C-氯霉素在37℃下保温1h。点样于TLC硅胶板上，氯仿和甲醇中薄层层析分离产物，放射性自显影鉴定。其中进行α-鹅膏蕈碱敏感实验时,培养的细胞在DNA转染后，分别在不同的时间内在细胞培养液中添加10g/ml的α-鹅膏蕈碱,35h培养后收获细胞，测试CAT活性。
1.2.3 竞争性凝胶泳动实验 HeLa细胞常规培养至总量1010个，根据Andrews方法[7]制备核提取物。人工合成的T7启动子2条T71和T72寡聚核苷酸片段用γ-32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶进行末
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端标记。标记产物经Sephadex G-25柱分离纯化。常规的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验如下:20μl体积的反应液中含有cpm值约为5000的标记寡聚核苷酸，10μg的核抽提物，0.5μg的Poly(dI/dC)，10mmol/L Tris-HC1(pH7.9),10mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl, 1mmol/L DTT, 0.5mmol/L EDTA和5%的甘油，室温下放置30min。DNA-蛋白质复合物于5%低离子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，80℃真空干胶，-70℃放射自显影。进行竞争性的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验时,寡聚核苷酸序列除了T7启动子外，分别加入100倍(克分子数)于T7启动子的寡核苷酸序列作为DNA结合蛋白的特异性竞争性序列，其余步骤按常规的凝胶泳动实验进行。
2 结果
2.1 T7启动子为真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别
, 百拇医药 真核生物转录系统共有3种RNA聚合酶：RNA聚合酶(PolⅠ)、RNA聚合酶(PolⅡ)和RNA聚合酶(PolⅢ)。这些RNA聚合酶分别识别不同类型的启动子，并对α-鹅膏蕈碱表现出游同的敏感度.α-鹅膏蕈碱不影响Pol Ⅰ的启动转录活性，但对PolⅡ和Pol Ⅲ的转录起抑制作用，不过其抑制浓度不同，当α-鹅膏蕈碱浓度在1μg/ml以上时，将抑制PolⅡ的活性；α-鹅膏蕈碱浓度在100μg/ml以上时，则抑制Pol 的活性，体内和体外实验都表现出同一现象[8]。根据这一机制，将含有在T7启动子下游组装有CAT基因的pT7CAT质粒3μg转染CHO JT细胞(1×105)，转染后的细胞在5h、20h、30h时分别加入10μg/ml的α-鹅膏蕈碱,各批细胞均培养35h，进行CAT实验(图1)：0h和20h时加入α-鹅膏蕈碱,基本上不能检出CAT活性，30h时加入α-鹅膏蕈碱的转染细胞能检出约20%的CAT活性。10μg/ml的α-鹅膏蕈碱抑制了真核生物转录系统对T7启动子的启动作用。实验显示真核生物RNA Pol Ⅱ负责对T7启动子的转录起始。
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图1 α-鹅膏蕈碱对T7启动子控制的报道基因产物CAT活性影响检测
A、B、C：分别为转染细胞收获前30h、15h、和5h时加入α-鹅膏蕈碱的实验；D：转染细胞不加α-鹅膏蕈碱
Fig.1 CAT activity from T7 promoter with α-amanitin in the CHO cells A,B,C:CAT activity from the cells exposed to α-amanitin for the last 30h,15h,5h before cells harvesting,respectively;D:CAT activity fromthe cell in absence of α-amanitin
2.2 T7启动子是TBP蛋白的结合序列
真核生物RNA聚合酶识别的启始子控制mRNA的转录，此类启动子包含有多种顺式作用因子，常见的顺式作用因子有TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列。这些序列和相应转录因子结合在转录起始中起作用。T7启动子为RNA聚合酶所识别，启动报道基因的转录。为研究T7启动子与转录因子的作用，利用竞争性凝胶泳动技术(competitive electrophoretic mobility shift assay, CEMSA)来检测T7启动子作为真核生物RNA聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能。实验将已知相应结合蛋白的TATA框、GAAT框、GC框和八核苷酸序列(octamer)作为竞争性分子来测定T7启动子的结合蛋白因子(图2)：在没有竞争性分子存在时，人工合成23bp的T7启动子，可与HeLa细胞核抽提物形成一个复合物(图2，A)；当加入标记的T7启动子和未标记的TATA序列时(克分子数比例为1100)进行竞争实验时，原先的DNA-蛋白质带放射性强度大减弱(图2，B)，表明TATA序列与T7启动子竞争结合蛋白质因子，由于未标记的TATA序列数量上远多于标记的T7启动子序列，所以放射性DNA-蛋白制裁带减弱,结果显示T7启动子能与真核生物TATA结合蛋白结合。图2，C、图2，D和图2，E中的竞争性分子分别是CAAT框、GC框和八核苷酸序列，这些实验中的放射性DNA-蛋白质带依然保持,表明T7启动子结合的蛋白与上述3个DNA序列识别的蛋白质因子是不一样的。TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列分别为TBP、CTF/NF1、SP1和Oct-1所特异性结合[9]，因此竞争性凝胶泳动技术表明T7启动子在真核生物转录系统中是与TBP蛋白质结合的顺式元件。
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图2 竞争性凝胶泳动实验放射性自显影图
A：无竞争性分子时的CEMSA实验；B、C、D、E：竞争分子分别为无标记的TATA框、CAAT框、GC框、和八核苷酸的CEMSA实验
Fig.2 Autoradiograms of competitive electrophoretic mobility shift assay
A:CEMSA with end-labelled T7 promoter;B,C,D,E:CEMSA with end-labelled T7 promoter and TATA box,CAAT box,GC box ,and octamer ,respectively
2.3 八核苷酸序列和TATA序列对T7启动子的作用
, 百拇医药 质粒pT7CAT是将CAT基因接入pGEM质粒T7启动子下游构建而成，利用质粒T7启动子上游第15个碱基的Pvu 酶切位点。将人工合成的TATA序列和八核酸序列分别插入pT7CAT质粒T7启动子上游，构建成pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒。测序证实两个调控序列已插入PvuⅡ位点(图3和图4)。将pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒各3g转染CHO JT细胞(5×104)，转染后的细胞培养30h，进行CAT实验：pT7TATACAT和pT7CAT质粒表达的CAT基因产物活性差别不大(图5，A和图5，B)。但pT70CTCAT质粒表达的CAT活性比pT7CAT表达的活性要强得多(图5，C和图5，D)，显示八核苷酸序列能增强T7启动子的RNA聚合酶Ⅱ所启动的功能。在真核生物转录中TATA序列作为定位因子起作用的，而八核苷酸序列能增强真核生物启动子的转录功能。实验结果证明了T7启动子能作为真核生物转录启动元件的功能。
图3 重组进pT7质粒的TATA框序列
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Fig.3 TATA box inserted in pT7CAT
图4 重组进pT7质粒的八核苷酸序列
Fig.4 Octamer inserdted in pT7CAT
图5 调控序列对T7启动子启动CAT基因表达的影响
A：T7启动子控制下的CAT活性；B：T7启动子和TATA框控制下的CAT活性；C、D：T7启动子和八核工业苷酸序列控制下的CAT活性
Fig.5 CAT activity from T7 promoter under the sequence elements
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A:CAT activity from T7 promoter under the sequence elements control of T7mpromoter,B:CAT activity from teh cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and TATA box;C,D:CAT activity from the cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and octamer
3 讨论
原核和真核细胞的转录系统有着明显的差异，原核生物较为简单，通常细胞内只有1种RNA聚合酶，真核生物细胞内则有3种RNA聚合酶。从整体的转录机制看，Pol Ⅰ和PolⅢ 的转录系统较为简单，更类似于原核生物，但α-鹅膏蕈碱实验显示人微言轻原核系统的T7启动子在真核生物细胞内的作用是依赖于PolⅡ系统。PolⅡ系统是细胞内最为复杂的转录系统，其识别因子多达数十个，T7启动子长仅为23bp，它为何种蛋白质因子所识别，这是人们关心的问题。竞争性DNA-收据结合凝胶泳动实验显示T7启动子结合的反式作用因子与TATA序列结合的因子是一样的。目前已经知道识别TATA序列是TFⅡD 因子，TFⅡD因子是PolⅡ系统基础转录的一个重要反式作用因子，它含有TBP和TAFs两类蛋白质因子，其中TBP是DNA序列识别因子，结合到特异的序列上，从而触发RNA聚合酶转录的起始[10]。T7启动子能与TFⅡD结合，显示了该启动子在PolⅡ系统中作为类似TATA序列顺式作用因子的可能性。真核生物TATA序列具有保守性，其碱基以TA碱基对为主，本实验采用的T7启动子共有23bp，它的序列5′端的5个碱基(TAATA)是AT碱基对，可能这一区域是TFⅡD因子的TBP蛋白识别结合序列，其突变鉴定研究正在进行中。
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真核生物PolⅡ系统包含有许多顺式作用因子，这些顺式作用因子以“Mix and Match”模式起作用，即不同的顺式作用因子共同或协同起作用。如果T7启动子作为PolⅡ系统的一个顺式作用元件，它将具有与其他顺式作用元件相互作用调控转录起始的功能。本文实验中将八核苷酸序列置于T7启动子上游，增强了转录的起始，表明顺式作用元件八核苷酸序列能与T7启动子作用，即T7启动子确实也是PolⅡ系统的一个顺式作用元件。但当将TATA序列置于T7启动子上游时，并不能增强报道基因的表达活性。从目前实验结果看T7启动子在PolⅡ系统转录中起的作用可能与TATA序列相仿，但加上一个典型的TATA序列也不能增强启动活性，证实了TATA序列与原核生物-10序列功能上的差异，尽管两者都是由TA碱基对组成，但原核生物-10序列与转录的强度有关，而真核生物TATA序列则与转录的定位相关[4]。
T7启动子可能作为TATA序列类似功能的特殊的元件被PolⅡ系统识别。但在Pol系统中，TATA序列不象原核生物启动子的-10序列那样是必不可少的，PolⅡ系统最基本和必要的顺式元件是起始子(initiator)， pT7CAT和衍生质粒中T7启动子区域能被Pol系统起始，说明该区域中应具有起始子，或者Pol 系统有目前尚未知的起始机制。从目前研究看，报道基因mRNA5′末端和T7启动子序列分析显示启动子含有一个类似起始子的序列，突变实验也证实该序列的重要性(另文报道)，所以23碱基对的T7启动子可能还包含着类似起始子的顺式作用因子，对它们的研究将促进对Pol Ⅱ系统转录起始的了解。
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国家自然科学基金资助(39770411)
参考文献
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1999-04-12
1999-06-30, 百拇医药