两种泥鳅中PdSox8和PdSox9基因的染色体定位
作者：常重杰 周荣家 余其兴
单位：武汉大学生命科学学院， 武汉 430072
关键词：泥鳅；大鳞副泥鳅；基因定位
遗传学报000501
摘要：应用染色体原位杂交技术，以地高辛标记的大鳞副泥鳅PdSox8和PdSox9基因片段为探针，研究了二者在泥鳅和大鳞副泥鳅染色体组中的定位。结果表明，在大鳞副泥鳅中PdSox8和PdSox9分别位于端部着丝粒染色体第4和第2 号即t4和t2染色体上，信号位点距着丝粒的相对距离分别为40.2%和67.5%；在泥鳅中，则分别位于t9和t6上，信息位点距着丝粒的相对距离分别为58.3%和30.8%。
中图分类号： Q953 文献标识码： A 文章编号： 0379-4172(2000)05-0377-06
, 百拇医药
The Chromosome Mapping of PdSox8 and PdSox9 in Two Kinds of Loaches
CHANG ZhongJie, ZHOU RongJia, YU QiQing
(The College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract: With the Dig-labelled PdSox8 and PdSox9 as probes, the chromosome mapping of Sox8 and Sox9 in Paramisgurnus dabryanus and Misgurnus anguillicaudatus were analyzed by chromosome in situ hybridization technique. In P. dabryanus, the PdSox8 and PdSox9 were successfully localized in the No.4 and No.2 telocentric chromosome respectively, the relative distance to centromere is 40.2% and 67.5%; In M. anguillicaudatus, they were localized in the No.9 and No.6 telocentric chromosome respectively, the relative distance to centromere is 58.3% and 30.8%.
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Key words: Paramisgurnus dabryanus, Misgurnus anguillicaudatus, gene mapping
人类性别决定基因SRY(Sex杛elated Region of Y, SRY)的发现是性别决定及分化机制研究领域中的一个重大突破，使人们对于性别决定机制的认识进入了一个新的境界[1]。SRY基因仅存在于雄性哺乳动物中，不同物种的SRY基因彼此间有较大的差异，说明SRY基因在进化历程中是快速变异的。在其他脊椎动物类群中，尚未发现起同样作用的基 因[2]。由于SRY基因的发现，使人们开始认识了一 个新的基因家族，即Sox(SRY杛elated HMG朾ox genes, Sox)基因家族，它们和SRY基因的共同特点是都具有一个保守的HMG朾ox。尽管这个基因家 族以SRY为代表，但其成员与SRY基因有着明显的区别。Sox基因在进化历程中高度保守，从不同分类群物种分离出来的Sox基因，具有相当高的同源性而且在雌雄个体中均存在[3,4]。
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世界上现存鱼类多达20000余种，是脊椎动物中分布最广，种类最多的类群。在脊椎动物系统进化中，鱼类处于承前启后的关键地位。鱼类的性别决定和分化机制以及性染色体一直是人们最感兴趣的研究课题之一。与其他高等脊椎动物相比，大多数鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性[5]。在高等动物中目前已知Sox基因家族的部分成员与性别决定和性别分化具有密切关系[6,7]，在进化历程中也比较保守。因此应用哺乳类中的研究结果指导我们揭示研究其性别决定及其进化机制，研究鱼类的Sox基因将会是一个很好的突破口。本文以大鳞副泥鳅的PdSox8和PdSox9基因片段为探针，对它们在泥鳅和大鳞副泥鳅基因组中的 定位进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
泥鳅和大鳞副泥鳅购于武汉市和广西桂林市农贸市场。
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1.2 实验方法
1.2.1 有丝分裂染色体标本的制备 参照林义浩的PHA活体注射法[8]制备染色体标本。每尾实验鱼按20g体重注射0.2ml PHA(2.5mg/ml)的量注射。间隔24h重复注射1次，共3～5次。届时处死实验动物并尽可能排尽血液，取出肾组织，撕碎加入5ml RPMI 1640无血清培养基，同时加入秋水仙素至终浓度0.2g/ml，于29℃温育3h。常规0.075mol/L KCl低渗，空气干燥法制备染色体标本。
1.2.2 Dig探针标记 依照宝灵曼公司的产品说明书，采用地高辛随机引物法标记经EcoRⅠ或 BamHⅠ单酶切的含有大鳞副泥鳅PdSox8和PdSox9基因片段的质粒，经纯化和估计产量后保存于-20℃备用。
1.2.3 染色体原位杂交(ISH) 取-20℃贮存的染色体标本置37℃过夜，然后于56℃烤片3h，用RNase(0.1g/l溶于2×SSC中)37℃处理1h；2×SSC室温洗2min×3次；70%、90%、100%乙醇各2min系列脱水，室温晾干。在变性液中(甲酰胺42ml+20×SSC 6ml+水12ml)71℃变性3min，立即转入-20℃ 70%乙醇中；经90%、100%乙醇各5min系列脱水。室温晾干。用下述方法准备探针：Dig标记探针100ng、20×SSC 2l，去离子甲酰胺10l，0.5mol/L PBS(pH7.0)2l，纯水4.5l，20%硫酸葡聚糖20l，总体积40l。于100℃变性10min，加探针于玻片上，加盖片并封片。置80℃烤箱中再次变性3min，然后转入湿盒中于37℃杂交过夜。除去盖片于2×SSC、0.1% SDS和0.5× SSC、0.1% SDS中室温充分漂洗。充分封阻后加上100l 11000倍稀释的抗体进行结合反应2h。充分洗涤后取显色液100l于玻片上，避光显色至信号强度适中。用TE终止显色反应，5% Giemsa染色20min。蒸馏水充分冲洗，室温干燥。
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1.2.4 原位杂交信号的统计分析 Ho假设染色体上的杂交信号均为本底造成，它们均匀分布于所有染色体上。X2检验：X2＝Σ(实得数-预期数)2/预期数
将求得X2与X2分布临界值X20.05(n)(显著水平0.05)相比较，n为自由度，若X2>X20.05(n)，则否定Ho假设。说明杂交信号或延伸信号在染色体上不是均匀分布的，即所分析的染色体为特异性杂交的结果。
1.2.5 染色体组型分析和基因位置的确定 选择10个典型的具有杂交信号的分裂相，测量统计所有染色体的相对长度，参照余先觉《中国淡水鱼 类染色体》进行染色体组型分析，确定具有杂交信号的染色体的类型及其在染色体组中的位置；同时测量30个杂交信号距其所在染色体着丝粒的距离，并以此距离占臂长的百分比来表示杂交信号的位置。
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2 结果
PdSox8和PdSox9为大鳞副泥鳅中的Sox8和Sox9基因，系利用兼并引物从其基因组DNA扩增而得。经克隆和序列分析比较而命名。Sox8长500bp，内含有长340bp的内含子；Sox9长530bp，内含子长364bp。泥鳅有二倍体和四倍体两种类型。本实验所用为二倍体类型，2n＝50＝8m+6sm+36t。大鳞副泥鳅2n＝48＝12m+4sm+32t。经原位杂交，PdSox8和PdSox9基因在这两种泥鳅的许多分裂相中均出现杂交信号，部分杂交信号呈双点状，信号也比较明显，也有些杂交信号较弱仅可以在显微镜下辨认。本底比较干净，非特异性杂交 信号较少。杂交信号分布统计结果列于表1。
表1 2种泥鳅中PdSox8和PdSox9基因原位杂交基因定位统计结果
Table 1 The statistical results of PdSox8 and PdSox9 gene mapping on chromosomes of P.daryanus and M.auguillicaudatus 探针
, 百拇医药
Probes
物种名
Species
统计分裂相
Chromosome spreads examined
杂交信号数
Hybridization-signals
信号集中的染色体
Teh chromosome-bearing major singals
特异杂交信号数
Specific singals
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其他染色体上杂交信号数
Singals on the other chrom-osomes
PdSox8
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
108
132
t4
83
49
PdSox9
大鳞副泥鳅
, 百拇医药
P.dabryanus
94
107
t2
69
37
PdSox8
泥鳅
anguillicaudatus
97
120
t9
76
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44
PdSox
泥鳅
anguillicaudatus
101
115
t6
70
45
经统计检验，杂交信号分布具有显著特异性。由此可以判断，PdSox8在大鳞副泥鳅中位于端部着丝粒染色体组第4号上(图版I-1，2)；PdSox8基因位于泥鳅端部着丝粒染色体组第9号上(图版I-5，6)。PdSox9在大鳞副泥鳅中位于端部着丝粒染色体组第2号上(图版I-3，4)；PdSox9基因位于泥鳅端部着丝粒染色体组第6号上(图版I-7，8)。从进行统计的分裂相中，分别选取30个具有特异杂交信号的染色体进行染色体相对长度和杂交信号距着丝粒相对距离的计算，结果列于表2。表2 在PdSox8和PdSox9基因定位研究中,具杂交信号的染色体的相对长度和杂交信号距着丝粒的相对距离
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Table 2 The relative lenghth of the chromosome bearing major signals and the relative distance of hybridization signal to its centromere in the PdSox8 and PdSox9 mapping 基因
Genes
物种名
Species
信号集中的染色体
Teh chromosome-bearing major singals
相对长度
The relative length
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杂交信号距着丝粒的相对距离
The relative distance of signal to the centromere
PdSox8
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
t4
4.05±0.26
40.2%±5.74
PdSox9
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
, 百拇医药
t2
4.14±.38
67.5%±11.25
PdSox8
泥鳅
anguillicaudatus
t9
3.34±0.27
58.3%±8.33
PdSox
泥鳅
anguillicaudatus
, 百拇医药
t6
3.75±.31
30.8%±6.16
3 讨论
鱼类中的基因定位研究是一个进展较缓慢的领域。主要原因有两点：其一是鱼类染色体分带技术远未成熟，染色体的个性不易识别。因此，我们采用统计相对长度来识别染色体的个性，并以杂交信号距着丝粒的相对臂长的百分比来表示杂交信 号的位置；其二是由于目前已克隆的鱼类基因还比较少。目前已报道的基因定位工作主要是利用异源探针所进行的探索性工作[9～11]。Sox基因家族的发现及其与性别决定和分化可能的关系，鉴于鱼类性别决定和分化的原始性、多样性及可塑性，使其成为彻底揭示Sox基因家族及性决定基因进化机制研究的良好材料，对鱼类Sox基因的研究迅速展开，这为利用同源探针进行基因定位研究创造了先决条件。泥鳅和大鳞副泥鳅是亲缘关系很近的两个物种，形态上的差异很小，曾被列入同一属；从核型进化上看，二者的差异在于泥鳅中2对端部着丝粒染色体融合形成1对双臂染色体，也存在一些微小的染色体重排[12]。PdSox9和PdSox8在二者中分别定位于不同的染色体上，也说明了在这两个物种中染色体重排是十分活跃的。尽管目前已克隆的鱼类Sox基因已超过10个[3,13]，但尚未见到1例有关其基因定位的报道。在本文所涉及两个物种中， PdSox9和PdSox8在同一物种中，位于不同的染色体上，这与其他高等动物中Sox基因在基因组中的位置分布是相似的，即Sox家族的基因散布于常染色体及性染色体上；目前尚未见到Sox基因成簇存在的报道。Sox基因的这一特性与另一大类发育基因Hox家族在基因组中的分布特点形成鲜明对照。后者成簇存在于几条染色体的特定位点上。如人类中Hox基因A、B、C、D 4个亚族分别定位于7、17、12和2号染色体上；小鼠中则定位于6、11、15和2号染色体上[14]。
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表3 不同物种中Sox9基因的染色体定位 物种
Species
Sox9基因的位置
Teh site of Sox9
定位方法
Methods used
作者
References
人(Human)
17q24.1—25.1
辐射杂种细胞作图
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radiation hybrid cell mapping ell mapping
Foster,1994
小鼠(Mouse)
11qtip
种间回交
interspecific backcross
Wright,1993
猪(Pig)
12P13—11
PCR-SCH
Lahbib-Mansais,1997
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黄鳝(Monoperus albus)
t6
FISH,PRINS
本室待发表资料,1998 unpubished data
泥鳅
(M.anguillicaudatus)
t6
ISH
本文
this work
大鳞副泥鳅
(P.dabryanus)
, 百拇医药
t2
ISH
本文
thw work
尽管Sox基因在不同物种基因组中的位置分散，但从系统发生角度看，其位置是固定的。如Sox3皆位于X染色体上；Sox2则位于绵羊1号、牛2号；人3q和猪1号染色体上。经染色体描绘证明它们具有很大的同源性。基因比较作图也证明了这些染色体上的基因是保守同线的[15,16]。表3列举了几个物种中Sox9基因的定位结果。人17号染色 体长臂与鼠11号染色体是同源的，Sox9基因位于这些染色体上与性逆转有关的片段内。3种鱼类中，Sox9基因的定位各有不同。这些染色体与人及鼠的17号、11号染色体是否同源呢？尽管鱼类与人和哺乳类进化关系较远，但都属于脊椎动物。从理论上推断，同祖染色体或其片段在染色体组进化历程中部分残存的可能性应当是进化保守性的必然结果。鱼类与人及哺乳类之间存在同祖染色体或其片段也并非没有可能性。因此，详细研究鱼类中的基因定位，寻找能基本维持原始保守状态的同祖染色体(或其片段)和同线群，将有助于揭开脊椎动物染色体组进化上的歧异(evolutionary divergence)发生的机制，从中找到进化线索。并有可能利用人类基因组计划的研究成果促进鱼类中的相应研究。Sox家族和Hox家族是两大类与发育有关的基因，但其在基因组中的分布具有如此巨大的差别。由于同线群的存在，使我们有理由推测， 在原始祖先中，Sox基因也是分散存在的，而并非在进化过程首先成簇存在而后才分散开的，这可能暗示着Sox基因家族与Hox基因家族在进化起源上有较大的不同。
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图 版 说 明
1. 大鳞副泥鳅中PdSox8基因原位杂交定位分裂相； 2. 大鳞副泥鳅中PdSox8基因在不同分裂相中t4染色体上的杂交信号； 3. 大鳞副泥鳅中PdSox9基因原位杂交定位分裂相； 4. 大鳞副泥鳅中PdSox9基因在不同分裂相中t2染色体上的杂交信号； 5. 泥鳅中PdSox8基因在不同分裂相中t9染色体上的杂交信号； 6. 泥鳅中PdSox8基因原位杂交定位分裂相； 7. 泥鳅中PdSox9基因在不同分裂相中t6染色体上的杂交信号； 8. 泥鳅中PdSox9基因原位杂交定位分裂相。▲示杂交信号
Explanations of Plate
1. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of P. dabryanus; 2. Show the hybridization signals of PdSox8 on the t4 chromosome of different metaphase in P. dabryanus; 3. Shows the hybridization signal of PdSox9 on the metaphase of P. dabryanus; 4. Show the hybridization signals of Sox9 on the t2 chromosome of different metaphase in P. dabryanus; 5. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of M. anguillicaudatus; 6. Show the hybridization signals on the t9 chromosome of different metaphase in M. anguillicaudatus; 7. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of M. anguillicaudatus; 8. Shows the hybridization signals on the t6 chromosome of different metaphase in M. anguillicaudatus.▲Shows the dot of hybridization signal
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国家自然科学基金资助(批准号:39770407)
参考文献
[1] Sinclair A H, Berta P, Palmer M S, Hawkins J R, Griffiths B L et al. A gene from the human sex determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA binding motif. Nature, 1990, 346:240～244.
[2] Raymond C S, Shamu C E, Shen M M et al. Evidence for evolutionary conservation of sex determining genes. Nature, 1998, 391:691～695.
, http://www.100md.com
[3] Gubbay J, Collignon J, Koopman R, Capel B, Economou A et al. A gene mapping to the sex determining region of the mouse Y chromosome is a member of a novel family of embryonically expressed genes. Nature, 1990, 346: 245～250.
[4] Fukada S, Tanaka M, Lwaya M et al. The Sox gene family and its expression during embryogenesis in the teleost fish, medaka (cryziaslatipes). Dev, growth Differ, 1995, 37: 379～385.
[5] 余先觉，周 暾， 李 康等. 见： 中国淡水鱼类染色体. 北京： 科学出版社； 1989.
, 百拇医药
[6] Foster J W, Graves J A M, An SRY related sequence on the Marsupial X chromosome: implications for the evolution of the mammalian testis-determing gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 1927～1931.
[7] Foster J W, Dominguez M A, Guioli S et al. Campomelicdysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY-Related gene. Nature, 1994, 372:525～530.
[8]林义浩. 快速获得大量鱼类肾细胞中期分裂相的PHA体内注射法. 水产学报， 1982， 6(3)： 201～208.
, 百拇医药
[9]杜丽萍， 余其兴， 郭一清等. 黄鳝二价体上Px基因E3外显子特异引物原位合成. 遗传学报， 1998， 25(1)： 28～33.
[10]李 奎， 余其兴等. 用地高辛原位杂交技术定位黄鳝rDNA基因于二价体染色3q12～q24和7q14～26. 遗传学报， 1995， 22(2)： 97～102.
[11]张锡元， 童素红等. 草鱼的BHCG基因同类物及其染色体定位. 遗传学报， 1989， 16(4)： 947～954.
[12]李 康， 李渝成， 周 暾， 两种泥鳅染色体组型的比较研究. 动物学研究， 1983， 4(1)： 75～80.
[13] Ito M, Ishirawa M, Suzubi S et al. A rainbow trout SRY ——type gene expressed in pituitary glands. FEBS Lett, 1995, 377(2): 37～40.
, 百拇医药
[14]薛志刚. 同源异形盒基因和胚胎发育. 武汉大学学报(自然科学版)， 1993(6)：105～109.
[15] Lahbib-Mansais Y, Barbosa A, Yerle M et al. Mapping in pig of genes involved in sexual differentiation: AMH, WTI, FTZFI, SOX2, SOX9, AHC, and placental and embryonic CYP19. Cytogenet Cell Genet., 1997, 76: 109～114.
[16] Payen E, Pailhooux E, Gianquinto L et al. The ovine Sox2 gene: sequence, chromosomal localization and gonadal expression. Gene, 1997, 189(1): 143～147.
1999-02-03
1999-12-28, 百拇医药
单位：武汉大学生命科学学院， 武汉 430072
关键词：泥鳅；大鳞副泥鳅；基因定位
遗传学报000501
摘要：应用染色体原位杂交技术，以地高辛标记的大鳞副泥鳅PdSox8和PdSox9基因片段为探针，研究了二者在泥鳅和大鳞副泥鳅染色体组中的定位。结果表明，在大鳞副泥鳅中PdSox8和PdSox9分别位于端部着丝粒染色体第4和第2 号即t4和t2染色体上，信号位点距着丝粒的相对距离分别为40.2%和67.5%；在泥鳅中，则分别位于t9和t6上，信息位点距着丝粒的相对距离分别为58.3%和30.8%。
中图分类号： Q953 文献标识码： A 文章编号： 0379-4172(2000)05-0377-06
, 百拇医药
The Chromosome Mapping of PdSox8 and PdSox9 in Two Kinds of Loaches
CHANG ZhongJie, ZHOU RongJia, YU QiQing
(The College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract: With the Dig-labelled PdSox8 and PdSox9 as probes, the chromosome mapping of Sox8 and Sox9 in Paramisgurnus dabryanus and Misgurnus anguillicaudatus were analyzed by chromosome in situ hybridization technique. In P. dabryanus, the PdSox8 and PdSox9 were successfully localized in the No.4 and No.2 telocentric chromosome respectively, the relative distance to centromere is 40.2% and 67.5%; In M. anguillicaudatus, they were localized in the No.9 and No.6 telocentric chromosome respectively, the relative distance to centromere is 58.3% and 30.8%.
, 百拇医药
Key words: Paramisgurnus dabryanus, Misgurnus anguillicaudatus, gene mapping
人类性别决定基因SRY(Sex杛elated Region of Y, SRY)的发现是性别决定及分化机制研究领域中的一个重大突破，使人们对于性别决定机制的认识进入了一个新的境界[1]。SRY基因仅存在于雄性哺乳动物中，不同物种的SRY基因彼此间有较大的差异，说明SRY基因在进化历程中是快速变异的。在其他脊椎动物类群中，尚未发现起同样作用的基 因[2]。由于SRY基因的发现，使人们开始认识了一 个新的基因家族，即Sox(SRY杛elated HMG朾ox genes, Sox)基因家族，它们和SRY基因的共同特点是都具有一个保守的HMG朾ox。尽管这个基因家 族以SRY为代表，但其成员与SRY基因有着明显的区别。Sox基因在进化历程中高度保守，从不同分类群物种分离出来的Sox基因，具有相当高的同源性而且在雌雄个体中均存在[3,4]。
, http://www.100md.com
世界上现存鱼类多达20000余种，是脊椎动物中分布最广，种类最多的类群。在脊椎动物系统进化中，鱼类处于承前启后的关键地位。鱼类的性别决定和分化机制以及性染色体一直是人们最感兴趣的研究课题之一。与其他高等脊椎动物相比，大多数鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性[5]。在高等动物中目前已知Sox基因家族的部分成员与性别决定和性别分化具有密切关系[6,7]，在进化历程中也比较保守。因此应用哺乳类中的研究结果指导我们揭示研究其性别决定及其进化机制，研究鱼类的Sox基因将会是一个很好的突破口。本文以大鳞副泥鳅的PdSox8和PdSox9基因片段为探针，对它们在泥鳅和大鳞副泥鳅基因组中的 定位进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
泥鳅和大鳞副泥鳅购于武汉市和广西桂林市农贸市场。
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1.2 实验方法
1.2.1 有丝分裂染色体标本的制备 参照林义浩的PHA活体注射法[8]制备染色体标本。每尾实验鱼按20g体重注射0.2ml PHA(2.5mg/ml)的量注射。间隔24h重复注射1次，共3～5次。届时处死实验动物并尽可能排尽血液，取出肾组织，撕碎加入5ml RPMI 1640无血清培养基，同时加入秋水仙素至终浓度0.2g/ml，于29℃温育3h。常规0.075mol/L KCl低渗，空气干燥法制备染色体标本。
1.2.2 Dig探针标记 依照宝灵曼公司的产品说明书，采用地高辛随机引物法标记经EcoRⅠ或 BamHⅠ单酶切的含有大鳞副泥鳅PdSox8和PdSox9基因片段的质粒，经纯化和估计产量后保存于-20℃备用。
1.2.3 染色体原位杂交(ISH) 取-20℃贮存的染色体标本置37℃过夜，然后于56℃烤片3h，用RNase(0.1g/l溶于2×SSC中)37℃处理1h；2×SSC室温洗2min×3次；70%、90%、100%乙醇各2min系列脱水，室温晾干。在变性液中(甲酰胺42ml+20×SSC 6ml+水12ml)71℃变性3min，立即转入-20℃ 70%乙醇中；经90%、100%乙醇各5min系列脱水。室温晾干。用下述方法准备探针：Dig标记探针100ng、20×SSC 2l，去离子甲酰胺10l，0.5mol/L PBS(pH7.0)2l，纯水4.5l，20%硫酸葡聚糖20l，总体积40l。于100℃变性10min，加探针于玻片上，加盖片并封片。置80℃烤箱中再次变性3min，然后转入湿盒中于37℃杂交过夜。除去盖片于2×SSC、0.1% SDS和0.5× SSC、0.1% SDS中室温充分漂洗。充分封阻后加上100l 11000倍稀释的抗体进行结合反应2h。充分洗涤后取显色液100l于玻片上，避光显色至信号强度适中。用TE终止显色反应，5% Giemsa染色20min。蒸馏水充分冲洗，室温干燥。
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1.2.4 原位杂交信号的统计分析 Ho假设染色体上的杂交信号均为本底造成，它们均匀分布于所有染色体上。X2检验：X2＝Σ(实得数-预期数)2/预期数
将求得X2与X2分布临界值X20.05(n)(显著水平0.05)相比较，n为自由度，若X2>X20.05(n)，则否定Ho假设。说明杂交信号或延伸信号在染色体上不是均匀分布的，即所分析的染色体为特异性杂交的结果。
1.2.5 染色体组型分析和基因位置的确定 选择10个典型的具有杂交信号的分裂相，测量统计所有染色体的相对长度，参照余先觉《中国淡水鱼 类染色体》进行染色体组型分析，确定具有杂交信号的染色体的类型及其在染色体组中的位置；同时测量30个杂交信号距其所在染色体着丝粒的距离，并以此距离占臂长的百分比来表示杂交信号的位置。
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2 结果
PdSox8和PdSox9为大鳞副泥鳅中的Sox8和Sox9基因，系利用兼并引物从其基因组DNA扩增而得。经克隆和序列分析比较而命名。Sox8长500bp，内含有长340bp的内含子；Sox9长530bp，内含子长364bp。泥鳅有二倍体和四倍体两种类型。本实验所用为二倍体类型，2n＝50＝8m+6sm+36t。大鳞副泥鳅2n＝48＝12m+4sm+32t。经原位杂交，PdSox8和PdSox9基因在这两种泥鳅的许多分裂相中均出现杂交信号，部分杂交信号呈双点状，信号也比较明显，也有些杂交信号较弱仅可以在显微镜下辨认。本底比较干净，非特异性杂交 信号较少。杂交信号分布统计结果列于表1。
表1 2种泥鳅中PdSox8和PdSox9基因原位杂交基因定位统计结果
Table 1 The statistical results of PdSox8 and PdSox9 gene mapping on chromosomes of P.daryanus and M.auguillicaudatus 探针
, 百拇医药
Probes
物种名
Species
统计分裂相
Chromosome spreads examined
杂交信号数
Hybridization-signals
信号集中的染色体
Teh chromosome-bearing major singals
特异杂交信号数
Specific singals
, 百拇医药
其他染色体上杂交信号数
Singals on the other chrom-osomes
PdSox8
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
108
132
t4
83
49
PdSox9
大鳞副泥鳅
, 百拇医药
P.dabryanus
94
107
t2
69
37
PdSox8
泥鳅
anguillicaudatus
97
120
t9
76
, http://www.100md.com
44
PdSox
泥鳅
anguillicaudatus
101
115
t6
70
45
经统计检验，杂交信号分布具有显著特异性。由此可以判断，PdSox8在大鳞副泥鳅中位于端部着丝粒染色体组第4号上(图版I-1，2)；PdSox8基因位于泥鳅端部着丝粒染色体组第9号上(图版I-5，6)。PdSox9在大鳞副泥鳅中位于端部着丝粒染色体组第2号上(图版I-3，4)；PdSox9基因位于泥鳅端部着丝粒染色体组第6号上(图版I-7，8)。从进行统计的分裂相中，分别选取30个具有特异杂交信号的染色体进行染色体相对长度和杂交信号距着丝粒相对距离的计算，结果列于表2。表2 在PdSox8和PdSox9基因定位研究中,具杂交信号的染色体的相对长度和杂交信号距着丝粒的相对距离
, 百拇医药
Table 2 The relative lenghth of the chromosome bearing major signals and the relative distance of hybridization signal to its centromere in the PdSox8 and PdSox9 mapping 基因
Genes
物种名
Species
信号集中的染色体
Teh chromosome-bearing major singals
相对长度
The relative length
, 百拇医药
杂交信号距着丝粒的相对距离
The relative distance of signal to the centromere
PdSox8
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
t4
4.05±0.26
40.2%±5.74
PdSox9
大鳞副泥鳅
P.dabryanus
, 百拇医药
t2
4.14±.38
67.5%±11.25
PdSox8
泥鳅
anguillicaudatus
t9
3.34±0.27
58.3%±8.33
PdSox
泥鳅
anguillicaudatus
, 百拇医药
t6
3.75±.31
30.8%±6.16
3 讨论
鱼类中的基因定位研究是一个进展较缓慢的领域。主要原因有两点：其一是鱼类染色体分带技术远未成熟，染色体的个性不易识别。因此，我们采用统计相对长度来识别染色体的个性，并以杂交信号距着丝粒的相对臂长的百分比来表示杂交信 号的位置；其二是由于目前已克隆的鱼类基因还比较少。目前已报道的基因定位工作主要是利用异源探针所进行的探索性工作[9～11]。Sox基因家族的发现及其与性别决定和分化可能的关系，鉴于鱼类性别决定和分化的原始性、多样性及可塑性，使其成为彻底揭示Sox基因家族及性决定基因进化机制研究的良好材料，对鱼类Sox基因的研究迅速展开，这为利用同源探针进行基因定位研究创造了先决条件。泥鳅和大鳞副泥鳅是亲缘关系很近的两个物种，形态上的差异很小，曾被列入同一属；从核型进化上看，二者的差异在于泥鳅中2对端部着丝粒染色体融合形成1对双臂染色体，也存在一些微小的染色体重排[12]。PdSox9和PdSox8在二者中分别定位于不同的染色体上，也说明了在这两个物种中染色体重排是十分活跃的。尽管目前已克隆的鱼类Sox基因已超过10个[3,13]，但尚未见到1例有关其基因定位的报道。在本文所涉及两个物种中， PdSox9和PdSox8在同一物种中，位于不同的染色体上，这与其他高等动物中Sox基因在基因组中的位置分布是相似的，即Sox家族的基因散布于常染色体及性染色体上；目前尚未见到Sox基因成簇存在的报道。Sox基因的这一特性与另一大类发育基因Hox家族在基因组中的分布特点形成鲜明对照。后者成簇存在于几条染色体的特定位点上。如人类中Hox基因A、B、C、D 4个亚族分别定位于7、17、12和2号染色体上；小鼠中则定位于6、11、15和2号染色体上[14]。
, 百拇医药
表3 不同物种中Sox9基因的染色体定位 物种
Species
Sox9基因的位置
Teh site of Sox9
定位方法
Methods used
作者
References
人(Human)
17q24.1—25.1
辐射杂种细胞作图
, http://www.100md.com
radiation hybrid cell mapping ell mapping
Foster,1994
小鼠(Mouse)
11qtip
种间回交
interspecific backcross
Wright,1993
猪(Pig)
12P13—11
PCR-SCH
Lahbib-Mansais,1997
, http://www.100md.com
黄鳝(Monoperus albus)
t6
FISH,PRINS
本室待发表资料,1998 unpubished data
泥鳅
(M.anguillicaudatus)
t6
ISH
本文
this work
大鳞副泥鳅
(P.dabryanus)
, 百拇医药
t2
ISH
本文
thw work
尽管Sox基因在不同物种基因组中的位置分散，但从系统发生角度看，其位置是固定的。如Sox3皆位于X染色体上；Sox2则位于绵羊1号、牛2号；人3q和猪1号染色体上。经染色体描绘证明它们具有很大的同源性。基因比较作图也证明了这些染色体上的基因是保守同线的[15,16]。表3列举了几个物种中Sox9基因的定位结果。人17号染色 体长臂与鼠11号染色体是同源的，Sox9基因位于这些染色体上与性逆转有关的片段内。3种鱼类中，Sox9基因的定位各有不同。这些染色体与人及鼠的17号、11号染色体是否同源呢？尽管鱼类与人和哺乳类进化关系较远，但都属于脊椎动物。从理论上推断，同祖染色体或其片段在染色体组进化历程中部分残存的可能性应当是进化保守性的必然结果。鱼类与人及哺乳类之间存在同祖染色体或其片段也并非没有可能性。因此，详细研究鱼类中的基因定位，寻找能基本维持原始保守状态的同祖染色体(或其片段)和同线群，将有助于揭开脊椎动物染色体组进化上的歧异(evolutionary divergence)发生的机制，从中找到进化线索。并有可能利用人类基因组计划的研究成果促进鱼类中的相应研究。Sox家族和Hox家族是两大类与发育有关的基因，但其在基因组中的分布具有如此巨大的差别。由于同线群的存在，使我们有理由推测， 在原始祖先中，Sox基因也是分散存在的，而并非在进化过程首先成簇存在而后才分散开的，这可能暗示着Sox基因家族与Hox基因家族在进化起源上有较大的不同。
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图 版 说 明
1. 大鳞副泥鳅中PdSox8基因原位杂交定位分裂相； 2. 大鳞副泥鳅中PdSox8基因在不同分裂相中t4染色体上的杂交信号； 3. 大鳞副泥鳅中PdSox9基因原位杂交定位分裂相； 4. 大鳞副泥鳅中PdSox9基因在不同分裂相中t2染色体上的杂交信号； 5. 泥鳅中PdSox8基因在不同分裂相中t9染色体上的杂交信号； 6. 泥鳅中PdSox8基因原位杂交定位分裂相； 7. 泥鳅中PdSox9基因在不同分裂相中t6染色体上的杂交信号； 8. 泥鳅中PdSox9基因原位杂交定位分裂相。▲示杂交信号
Explanations of Plate
1. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of P. dabryanus; 2. Show the hybridization signals of PdSox8 on the t4 chromosome of different metaphase in P. dabryanus; 3. Shows the hybridization signal of PdSox9 on the metaphase of P. dabryanus; 4. Show the hybridization signals of Sox9 on the t2 chromosome of different metaphase in P. dabryanus; 5. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of M. anguillicaudatus; 6. Show the hybridization signals on the t9 chromosome of different metaphase in M. anguillicaudatus; 7. Shows the hybridization signal of PdSox8 on the metaphase of M. anguillicaudatus; 8. Shows the hybridization signals on the t6 chromosome of different metaphase in M. anguillicaudatus.▲Shows the dot of hybridization signal
, 百拇医药
国家自然科学基金资助(批准号:39770407)
参考文献
[1] Sinclair A H, Berta P, Palmer M S, Hawkins J R, Griffiths B L et al. A gene from the human sex determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA binding motif. Nature, 1990, 346:240～244.
[2] Raymond C S, Shamu C E, Shen M M et al. Evidence for evolutionary conservation of sex determining genes. Nature, 1998, 391:691～695.
, http://www.100md.com
[3] Gubbay J, Collignon J, Koopman R, Capel B, Economou A et al. A gene mapping to the sex determining region of the mouse Y chromosome is a member of a novel family of embryonically expressed genes. Nature, 1990, 346: 245～250.
[4] Fukada S, Tanaka M, Lwaya M et al. The Sox gene family and its expression during embryogenesis in the teleost fish, medaka (cryziaslatipes). Dev, growth Differ, 1995, 37: 379～385.
[5] 余先觉，周 暾， 李 康等. 见： 中国淡水鱼类染色体. 北京： 科学出版社； 1989.
, 百拇医药
[6] Foster J W, Graves J A M, An SRY related sequence on the Marsupial X chromosome: implications for the evolution of the mammalian testis-determing gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 1927～1931.
[7] Foster J W, Dominguez M A, Guioli S et al. Campomelicdysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY-Related gene. Nature, 1994, 372:525～530.
[8]林义浩. 快速获得大量鱼类肾细胞中期分裂相的PHA体内注射法. 水产学报， 1982， 6(3)： 201～208.
, 百拇医药
[9]杜丽萍， 余其兴， 郭一清等. 黄鳝二价体上Px基因E3外显子特异引物原位合成. 遗传学报， 1998， 25(1)： 28～33.
[10]李 奎， 余其兴等. 用地高辛原位杂交技术定位黄鳝rDNA基因于二价体染色3q12～q24和7q14～26. 遗传学报， 1995， 22(2)： 97～102.
[11]张锡元， 童素红等. 草鱼的BHCG基因同类物及其染色体定位. 遗传学报， 1989， 16(4)： 947～954.
[12]李 康， 李渝成， 周 暾， 两种泥鳅染色体组型的比较研究. 动物学研究， 1983， 4(1)： 75～80.
[13] Ito M, Ishirawa M, Suzubi S et al. A rainbow trout SRY ——type gene expressed in pituitary glands. FEBS Lett, 1995, 377(2): 37～40.
, 百拇医药
[14]薛志刚. 同源异形盒基因和胚胎发育. 武汉大学学报(自然科学版)， 1993(6)：105～109.
[15] Lahbib-Mansais Y, Barbosa A, Yerle M et al. Mapping in pig of genes involved in sexual differentiation: AMH, WTI, FTZFI, SOX2, SOX9, AHC, and placental and embryonic CYP19. Cytogenet Cell Genet., 1997, 76: 109～114.
[16] Payen E, Pailhooux E, Gianquinto L et al. The ovine Sox2 gene: sequence, chromosomal localization and gonadal expression. Gene, 1997, 189(1): 143～147.
1999-02-03
1999-12-28, 百拇医药