国产狂犬病纯化疫苗的研制和应用前景
作者：俞永新
单位：俞永新(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
关键词：
中国计划免疫000327 中图分类号：R512.99 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)03-0176-03
众所周知，狂犬病一旦出现症状几乎是100%死亡，因此唯一的预防措施就是在被疯动物致伤前或致伤后注射狂犬病疫苗。70年代前世界各国所用的狂犬病疫苗都是粗制的成年动物(绵羊、山羊、家兔)或乳鼠的脑组织或鸡胚组织生产的疫苗，这种疫苗不但副反应大，免疫效果也很差。因此暴露后要连续接种14～21针，副反应率高达50%，尤其是变态反应性脑脊髓炎发生率高达1/500～1/2 000。70年代开始国外首先研制成功以人二倍体细胞为基质的细胞狂犬病疫苗，经实验室和暴露前、后临床试验均证明，这种新型疫苗的安全性和免疫性较以往的疫苗好，并经世界卫生组织(WHO)认可，将暴露后的免疫程序改为5针，即0、3、7、14、28天各接种1次。以后国外先后又研制成功Vero细胞、鸡胚细胞疫苗和鸭胚疫苗，这些疫苗都是经过高度纯化，安全性和免疫效果都达到或超过二倍体细胞疫苗[1]。然而由于这些现代疫苗的价格昂贵，在狂犬病主要流行的亚洲、非洲、南美等国家尚难接受，到目前为止全球只有20%的暴露后处理是用这些疫苗[2]。我国在80年代前也只是生产和使用羊脑组织狂犬病疫苗，其免疫程序和副反应与国际上相似，免疫失败病例也经常发生。1980年以后，我国研制成功以地鼠肾细胞为基质的灭活狂犬病疫苗，并开始全面应用[3，4]。由于疫苗未经浓缩和纯化，所以病毒含量低，抗原量少。虽然较羊脑疫苗大大降低了副反应，不再出现变态反应性脑脊髓炎，但实验室检定和人体应用后效果不够满意。1993年开始将地鼠肾原制疫苗改为浓缩3～5倍的浓缩狂犬病疫苗，实验室质量检定疫苗效价达到WHO规定的2.5IU/剂标准，但大面积应用后发现副反应很大，主要表现为注射部位剧烈疼痛，大面积肿胀，全身不适，发热，全身性荨麻疹，瘙痒，过敏性紫癜，血管神经性水肿，个别出现休克，神志不清，并有危及生命者。严重不良反应发生率5%～10%。且这些副反应均需临床药物处理才能缓解，有的需要住院治疗[5～8]。由于局部肿胀或全身反应致使一些患者无法完成全程注射，或改用法国进口的纯化疫苗。
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分析地鼠肾浓缩疫苗引起副反应的原因，主要是疫苗生产过程中加入异质蛋白如小牛血清、含病毒的豚鼠脑组织和培养病毒的地鼠肾细胞蛋白。据报告[9]，用地鼠肾细胞为基质生产的疫苗，以地鼠肾细胞蛋白抗血清进行免疫印迹试验，可以检测到疫苗内含有分子量为P67k和P45k(肌纤蛋白)的二种细胞源多肽。这些本来极微量的杂蛋白经浓缩后含量加大，增加了反应原。特别是当前我国的流行性乙型脑炎灭活疫苗也是未纯化的地鼠肾细胞疫苗，一般儿童在1～6岁时已经过数次接种，这对以后地鼠肾细胞狂犬病疫苗的接种更容易引起过敏反应。
鉴于上述原因，国家药品监督管理局已决定尽快生产和使用纯化的狂犬病疫苗替代未纯化的浓缩疫苗。目前，我国自行研制的狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞纯化疫苗已取得了可喜的进展，据了解已经有辽宁生物技术公司、沈阳安迪生物高科技公司、海南生物制品研究所取得了这类疫苗的生产文号。我国自行生产的这种新疫苗的共同特点是纯化后的疫苗去除了99.5%以上的杂蛋白，豚鼠过敏试验未出现过敏反应，每剂蛋白含量≤120μg，疫苗免疫效价超过WHO规定的2.5IU/剂。人体接种后的副反应未出现浓缩苗的异常过敏反应和中、重度副反应，轻度副反应与法国维尔博疫苗(PVRV)相近，无显著性差异。人体接种后的抗体阳转率，我国的纯化苗与法国的PVRV均为100%，抗体几何平均滴度(GMT)在10IU左右与法国PVRV无差别。因此可以说我国研制成功的地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞疫苗已经达到或接近国际上先进的狂犬病疫苗的质量水平[10]。原代地鼠肾细胞纯化疫苗与德国Chiron Behring厂生产的原代鸡胚细胞(PCEC)疫苗(Rabipur)相似，都是用动物的原代细胞培养病毒，经灭活纯化后制成。Rabipur疫苗已有14年的临床经验，疫苗已在欧洲、亚洲、非洲和美洲广泛应用，证明其安全有效[2]。
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纯化疫苗除无严重异常反应和一般副反应很轻外，其免疫效果也比未纯化疫苗高，人体免疫后的抗体水平大大超过0.5 IU/ml的国际标准，这可能与排除疫苗内杂蛋白的免疫干扰有关。此外，纯化狂犬病疫苗较未纯化的浓缩疫苗具有更多的优越性和更广的适用性：
(1)更适用于臂部肌内注射 WHO狂犬病专家委员会多次提出建议，狂犬病疫苗的接种部位不应接种在臀部肌内，因臀部脂肪多，病毒抗原吸收差，免疫效果不好，建议应接种在臂部三角肌内[11，12]。但是由于未纯化浓缩疫苗接种后局部红肿面积大，难于多次注射，因此不少医生将疫苗注射在臀部。
(2)更容易完成全程免疫 据了解不少患者由于浓缩疫苗的副反应大，无法完成全程免疫而中断，这对狂犬病的预防十分不利，很容易造成免疫失败。
(3)更适用于首针加倍量或3倍量注射 根据多年的实际临床经验，尽管应用质量高的狂犬病疫苗，对某些免疫低下和特殊人群也可能出现免疫失败病例，如老年人，严重营养不良者，慢性病人，先天性或获得性免疫缺陷病人，接受免疫抑制药物者，在注射疫苗前1天或更早时已经注射过抗血清者，暴露后48小时或更长时间后才开始疫苗接种者，或需要用血清而得不到者。因此，WHO狂犬病专家建议对这些人群应在首针加倍或3倍量于不同部位各注射1剂。最近还推荐2-1-1的免疫程序(即当日接种2剂，7天和21天各注射1针)[11,12]。该程序在免疫后7天早期中和抗体阳转率(≥0.5IU/ml)可达65%～83%，最晚14天达100%[2]。由于早期抗体对狂犬病预防的重要性，因此采用这种措施有重要意义。而要实施这种免疫策略，所用疫苗必须是无副反应或副反应极轻、安全性高的疫苗。
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(4)更适宜于推广暴露前的预防免疫 当前95%以上的狂犬病是由带毒犬引起的。儿童喜爱逗玩家犬，与犬关系密切，被健康带毒犬感染不易觉察，不能进行暴露后免疫。如被疯动物致伤，由于儿童的自卫能力差，一般致伤的程度都很严重，尽管及时接种疫苗，失败机会也比较多。以往由于狂犬病疫苗的副反应大，无法推行对儿童的暴露前免疫。而当前已经有了各种高度纯化的安全有效的疫苗，因此WHO狂犬病专家建议在以犬为主要传染源的狂犬病疫区应该对儿童进行暴露前免疫。经暴露前免疫的儿童在暴露后接种疫苗，可产生免疫回忆反应，迅速产生早期抗体，水平高，预防效果好，而且只接种2剂(0、7天)即可，也可不必注射抗血清[11]。因此只有副反应很轻的纯化疫苗才有可能适用于暴露前免疫预防的推广应用。
(5)更适宜于推广皮内多点的免疫方法 由于现代疫苗的价格高，发展中国家难于接受，经多年临床观察已研究成功皮内多点的免疫方法适用于暴露前和暴露后注射，该方法疫苗用量较肌内法节省5倍，费用低，效果与肌内法相当，已经WHO批准应用[13]。皮内多点注射(2～8点)所用疫苗必须是副反应很轻的安全疫苗。
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纯化狂犬病疫苗研制成功标志着我国多年停滞不前的狂犬病细胞疫苗已进入一个新台阶，并可与国外的同类疫苗相比，但是还应该注意以下几点：
(1)疫苗质量包括疫苗的稳定性应始终保持高水平，厂家在制品质量上不能放松，应严格执行质量规格标准，不得以未纯化疫苗假冒充当纯化疫苗出售。在保证质量前提下改进生产工艺，提高生产效率，降低成本，使疫苗的价格低于国外进口的疫苗。
(2)国家药品监督管理部门应加大抽检力度，特别应从市场抽样，发现低劣产品应严加处罚直至吊销生产文号。
(3)国家疫苗检定机构应提高疫苗检定质量，提高检定方法的敏感性，建立简单易行的检测手段，如病毒抗原量测定、过敏原测定和过敏试验等。
(4)疫苗的流通应由厂家委托自己的代理商办理，通过卫生防疫机构销售和疫苗接种，在流通过程中收费应合理，尽可能减轻群众对疫苗的经济负担。
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(5)卫生防疫机构或医院应严格按照国家规定的免疫方案(包括接种部位)进行疫苗接种和暴露后的处理原则(包括彻底清洗伤口，必要时抗血清注射等)，以充分发挥纯化狂犬病疫苗的作用，减少免疫失败病例，降低我国的狂犬病发生率。
作者简介：俞永新，男，福建省仙游县人，中国药品生物制品检定所研究员，主要从事虫媒病毒、狂犬病病毒、出血热病毒的基础研究、检测和实验诊断，疫苗开发研究，疫苗质量控制。研究方向：新型病毒性疫苗的研究开发，疫苗质量控制的新方法新技术。
参考文献：
[1] 俞永新.现行人用疫苗[A].林放涛狂犬病学[C].福州：福建科学技术出版社，1992，206～221.
[2] Vodopija I, Baklaic Z, Vodopija R, et al. Rabipur: a reliable vaccine for rabies protection[J]. Vaccine, 1999, 17: 1739～1741.
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[3] 陆隆沫，俞永新，梁名奕，等.地鼠肾组织培养狂犬病灭活疫苗健康人群接种反应观察和血清抗体测定[J].病毒学集刊，1982，2：81—86.
[4] 俞永新.狂犬病[A].许龙善等. 再度肆虐人类的疾病[C].兰州：兰州医药出版社，1998，210—228.
[5] 赵健生.狂犬病疫苗注射引起过敏性紫癜一例[J].中国计划免疫，1998，4(2)：66.
[6] 张莹，李向群，温玉祥，等.浓缩狂犬病疫苗人体接种反应观察[J].中国生物制品杂志，1996，6(2)：80.
[7] 曹润轨.两种浓度地鼠肾组织狂犬病疫苗接种反应[J].中国人兽共患病杂志.1994，10(1)：58.
[8] 王海燕，王琳 ，吴光济，等.注射狂犬病疫苗后神志不清、抽搐40分钟一例[J].中国人兽共患病杂志，1994，10(1)：62.
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[9] Atanasiu P, Perrin P., Segre L, et al. Evaluation and comparative studies of inactivated rabies vaccines obtained in the heterologous diploid and polyploid cells(HAK, BHK and Vero)[J]. Develop Biol Standard, 1982, 50: 173—182.
[10] 董关木，刘增顺，郑海发，等.精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗的效果观察[J].中国生物制品杂志，1999，12(3)：181—183.
[11] World Health Organization. WHO Expert Committee on rabies. Eight report[R]. Technical report series. Geneva Switzerland, 1992, 1: 84.
[12] 俞永新.人和动物狂犬病防治研究进展[J].中国人兽共患病杂志，1998，14(4)：56—60.
[13] WHO recommendation on rabies post-exposure treatment and correct technique of intradermal immunization against rabies[J]. WHO/EMC/ZOO. 1996, 6: 4—7.
收稿日期：1999-11-29； 修回日期：2000-01-11, 百拇医药
单位：俞永新(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
关键词：
中国计划免疫000327 中图分类号：R512.99 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)03-0176-03
众所周知，狂犬病一旦出现症状几乎是100%死亡，因此唯一的预防措施就是在被疯动物致伤前或致伤后注射狂犬病疫苗。70年代前世界各国所用的狂犬病疫苗都是粗制的成年动物(绵羊、山羊、家兔)或乳鼠的脑组织或鸡胚组织生产的疫苗，这种疫苗不但副反应大，免疫效果也很差。因此暴露后要连续接种14～21针，副反应率高达50%，尤其是变态反应性脑脊髓炎发生率高达1/500～1/2 000。70年代开始国外首先研制成功以人二倍体细胞为基质的细胞狂犬病疫苗，经实验室和暴露前、后临床试验均证明，这种新型疫苗的安全性和免疫性较以往的疫苗好，并经世界卫生组织(WHO)认可，将暴露后的免疫程序改为5针，即0、3、7、14、28天各接种1次。以后国外先后又研制成功Vero细胞、鸡胚细胞疫苗和鸭胚疫苗，这些疫苗都是经过高度纯化，安全性和免疫效果都达到或超过二倍体细胞疫苗[1]。然而由于这些现代疫苗的价格昂贵，在狂犬病主要流行的亚洲、非洲、南美等国家尚难接受，到目前为止全球只有20%的暴露后处理是用这些疫苗[2]。我国在80年代前也只是生产和使用羊脑组织狂犬病疫苗，其免疫程序和副反应与国际上相似，免疫失败病例也经常发生。1980年以后，我国研制成功以地鼠肾细胞为基质的灭活狂犬病疫苗，并开始全面应用[3，4]。由于疫苗未经浓缩和纯化，所以病毒含量低，抗原量少。虽然较羊脑疫苗大大降低了副反应，不再出现变态反应性脑脊髓炎，但实验室检定和人体应用后效果不够满意。1993年开始将地鼠肾原制疫苗改为浓缩3～5倍的浓缩狂犬病疫苗，实验室质量检定疫苗效价达到WHO规定的2.5IU/剂标准，但大面积应用后发现副反应很大，主要表现为注射部位剧烈疼痛，大面积肿胀，全身不适，发热，全身性荨麻疹，瘙痒，过敏性紫癜，血管神经性水肿，个别出现休克，神志不清，并有危及生命者。严重不良反应发生率5%～10%。且这些副反应均需临床药物处理才能缓解，有的需要住院治疗[5～8]。由于局部肿胀或全身反应致使一些患者无法完成全程注射，或改用法国进口的纯化疫苗。
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分析地鼠肾浓缩疫苗引起副反应的原因，主要是疫苗生产过程中加入异质蛋白如小牛血清、含病毒的豚鼠脑组织和培养病毒的地鼠肾细胞蛋白。据报告[9]，用地鼠肾细胞为基质生产的疫苗，以地鼠肾细胞蛋白抗血清进行免疫印迹试验，可以检测到疫苗内含有分子量为P67k和P45k(肌纤蛋白)的二种细胞源多肽。这些本来极微量的杂蛋白经浓缩后含量加大，增加了反应原。特别是当前我国的流行性乙型脑炎灭活疫苗也是未纯化的地鼠肾细胞疫苗，一般儿童在1～6岁时已经过数次接种，这对以后地鼠肾细胞狂犬病疫苗的接种更容易引起过敏反应。
鉴于上述原因，国家药品监督管理局已决定尽快生产和使用纯化的狂犬病疫苗替代未纯化的浓缩疫苗。目前，我国自行研制的狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞纯化疫苗已取得了可喜的进展，据了解已经有辽宁生物技术公司、沈阳安迪生物高科技公司、海南生物制品研究所取得了这类疫苗的生产文号。我国自行生产的这种新疫苗的共同特点是纯化后的疫苗去除了99.5%以上的杂蛋白，豚鼠过敏试验未出现过敏反应，每剂蛋白含量≤120μg，疫苗免疫效价超过WHO规定的2.5IU/剂。人体接种后的副反应未出现浓缩苗的异常过敏反应和中、重度副反应，轻度副反应与法国维尔博疫苗(PVRV)相近，无显著性差异。人体接种后的抗体阳转率，我国的纯化苗与法国的PVRV均为100%，抗体几何平均滴度(GMT)在10IU左右与法国PVRV无差别。因此可以说我国研制成功的地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞疫苗已经达到或接近国际上先进的狂犬病疫苗的质量水平[10]。原代地鼠肾细胞纯化疫苗与德国Chiron Behring厂生产的原代鸡胚细胞(PCEC)疫苗(Rabipur)相似，都是用动物的原代细胞培养病毒，经灭活纯化后制成。Rabipur疫苗已有14年的临床经验，疫苗已在欧洲、亚洲、非洲和美洲广泛应用，证明其安全有效[2]。
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纯化疫苗除无严重异常反应和一般副反应很轻外，其免疫效果也比未纯化疫苗高，人体免疫后的抗体水平大大超过0.5 IU/ml的国际标准，这可能与排除疫苗内杂蛋白的免疫干扰有关。此外，纯化狂犬病疫苗较未纯化的浓缩疫苗具有更多的优越性和更广的适用性：
(1)更适用于臂部肌内注射 WHO狂犬病专家委员会多次提出建议，狂犬病疫苗的接种部位不应接种在臀部肌内，因臀部脂肪多，病毒抗原吸收差，免疫效果不好，建议应接种在臂部三角肌内[11，12]。但是由于未纯化浓缩疫苗接种后局部红肿面积大，难于多次注射，因此不少医生将疫苗注射在臀部。
(2)更容易完成全程免疫 据了解不少患者由于浓缩疫苗的副反应大，无法完成全程免疫而中断，这对狂犬病的预防十分不利，很容易造成免疫失败。
(3)更适用于首针加倍量或3倍量注射 根据多年的实际临床经验，尽管应用质量高的狂犬病疫苗，对某些免疫低下和特殊人群也可能出现免疫失败病例，如老年人，严重营养不良者，慢性病人，先天性或获得性免疫缺陷病人，接受免疫抑制药物者，在注射疫苗前1天或更早时已经注射过抗血清者，暴露后48小时或更长时间后才开始疫苗接种者，或需要用血清而得不到者。因此，WHO狂犬病专家建议对这些人群应在首针加倍或3倍量于不同部位各注射1剂。最近还推荐2-1-1的免疫程序(即当日接种2剂，7天和21天各注射1针)[11,12]。该程序在免疫后7天早期中和抗体阳转率(≥0.5IU/ml)可达65%～83%，最晚14天达100%[2]。由于早期抗体对狂犬病预防的重要性，因此采用这种措施有重要意义。而要实施这种免疫策略，所用疫苗必须是无副反应或副反应极轻、安全性高的疫苗。
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(4)更适宜于推广暴露前的预防免疫 当前95%以上的狂犬病是由带毒犬引起的。儿童喜爱逗玩家犬，与犬关系密切，被健康带毒犬感染不易觉察，不能进行暴露后免疫。如被疯动物致伤，由于儿童的自卫能力差，一般致伤的程度都很严重，尽管及时接种疫苗，失败机会也比较多。以往由于狂犬病疫苗的副反应大，无法推行对儿童的暴露前免疫。而当前已经有了各种高度纯化的安全有效的疫苗，因此WHO狂犬病专家建议在以犬为主要传染源的狂犬病疫区应该对儿童进行暴露前免疫。经暴露前免疫的儿童在暴露后接种疫苗，可产生免疫回忆反应，迅速产生早期抗体，水平高，预防效果好，而且只接种2剂(0、7天)即可，也可不必注射抗血清[11]。因此只有副反应很轻的纯化疫苗才有可能适用于暴露前免疫预防的推广应用。
(5)更适宜于推广皮内多点的免疫方法 由于现代疫苗的价格高，发展中国家难于接受，经多年临床观察已研究成功皮内多点的免疫方法适用于暴露前和暴露后注射，该方法疫苗用量较肌内法节省5倍，费用低，效果与肌内法相当，已经WHO批准应用[13]。皮内多点注射(2～8点)所用疫苗必须是副反应很轻的安全疫苗。
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纯化狂犬病疫苗研制成功标志着我国多年停滞不前的狂犬病细胞疫苗已进入一个新台阶，并可与国外的同类疫苗相比，但是还应该注意以下几点：
(1)疫苗质量包括疫苗的稳定性应始终保持高水平，厂家在制品质量上不能放松，应严格执行质量规格标准，不得以未纯化疫苗假冒充当纯化疫苗出售。在保证质量前提下改进生产工艺，提高生产效率，降低成本，使疫苗的价格低于国外进口的疫苗。
(2)国家药品监督管理部门应加大抽检力度，特别应从市场抽样，发现低劣产品应严加处罚直至吊销生产文号。
(3)国家疫苗检定机构应提高疫苗检定质量，提高检定方法的敏感性，建立简单易行的检测手段，如病毒抗原量测定、过敏原测定和过敏试验等。
(4)疫苗的流通应由厂家委托自己的代理商办理，通过卫生防疫机构销售和疫苗接种，在流通过程中收费应合理，尽可能减轻群众对疫苗的经济负担。
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(5)卫生防疫机构或医院应严格按照国家规定的免疫方案(包括接种部位)进行疫苗接种和暴露后的处理原则(包括彻底清洗伤口，必要时抗血清注射等)，以充分发挥纯化狂犬病疫苗的作用，减少免疫失败病例，降低我国的狂犬病发生率。
作者简介：俞永新，男，福建省仙游县人，中国药品生物制品检定所研究员，主要从事虫媒病毒、狂犬病病毒、出血热病毒的基础研究、检测和实验诊断，疫苗开发研究，疫苗质量控制。研究方向：新型病毒性疫苗的研究开发，疫苗质量控制的新方法新技术。
参考文献：
[1] 俞永新.现行人用疫苗[A].林放涛狂犬病学[C].福州：福建科学技术出版社，1992，206～221.
[2] Vodopija I, Baklaic Z, Vodopija R, et al. Rabipur: a reliable vaccine for rabies protection[J]. Vaccine, 1999, 17: 1739～1741.
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[3] 陆隆沫，俞永新，梁名奕，等.地鼠肾组织培养狂犬病灭活疫苗健康人群接种反应观察和血清抗体测定[J].病毒学集刊，1982，2：81—86.
[4] 俞永新.狂犬病[A].许龙善等. 再度肆虐人类的疾病[C].兰州：兰州医药出版社，1998，210—228.
[5] 赵健生.狂犬病疫苗注射引起过敏性紫癜一例[J].中国计划免疫，1998，4(2)：66.
[6] 张莹，李向群，温玉祥，等.浓缩狂犬病疫苗人体接种反应观察[J].中国生物制品杂志，1996，6(2)：80.
[7] 曹润轨.两种浓度地鼠肾组织狂犬病疫苗接种反应[J].中国人兽共患病杂志.1994，10(1)：58.
[8] 王海燕，王琳 ，吴光济，等.注射狂犬病疫苗后神志不清、抽搐40分钟一例[J].中国人兽共患病杂志，1994，10(1)：62.
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[9] Atanasiu P, Perrin P., Segre L, et al. Evaluation and comparative studies of inactivated rabies vaccines obtained in the heterologous diploid and polyploid cells(HAK, BHK and Vero)[J]. Develop Biol Standard, 1982, 50: 173—182.
[10] 董关木，刘增顺，郑海发，等.精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗的效果观察[J].中国生物制品杂志，1999，12(3)：181—183.
[11] World Health Organization. WHO Expert Committee on rabies. Eight report[R]. Technical report series. Geneva Switzerland, 1992, 1: 84.
[12] 俞永新.人和动物狂犬病防治研究进展[J].中国人兽共患病杂志，1998，14(4)：56—60.
[13] WHO recommendation on rabies post-exposure treatment and correct technique of intradermal immunization against rabies[J]. WHO/EMC/ZOO. 1996, 6: 4—7.
收稿日期：1999-11-29； 修回日期：2000-01-11, 百拇医药