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编号:10257967
雷公藤碱戊对系统性红斑狼疮患者B细胞免疫功能的体外实验研究
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 1999年第1期
     作者:虞海燕 秦万章 吴厚生

    单位:虞海燕 秦万章 (上海医科大学附属中山医院,上海210012);吴厚生 (上海医科大学医学检验系,上海210012)

    关键词:雷公藤碱戊;红斑狼疮;B细胞

    中国免疫学杂志990108 中国图书分类号 R593.2 R392.12

    摘 要 目的:探讨雷公藤碱戊的免疫药理作用。方法:采用系统性红斑狼疮(SLE)病人外周血单个核细胞(PBMC)体外培养观察雷公藤碱戊对SLE病人PBMC的B细胞功能的影响及时效关系。结果:雷公藤碱戊能抑制SLE的PBMC自发性增殖反应以及正常人和SLE病人PBMC对SAC刺激后的增殖反应。同时在培养的72 h前加入雷公藤碱戊均能对正常人PBMC在PWM诱导下的IgG产生呈现抑制效应。结论:雷公藤碱戊对B细胞功能的多个环节具有抑制作用,其抑制B细胞产生IgG 的作用环节可能在于抑制了B细胞的活化增殖阶段。
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    The study of the effect of Wilforidine on SLE patients'B cell simmunofunction in vitro

    YU Hai-Yan, QIN Wan-Zhang, WU Hou-Sheng.

    Zhongshan Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 210032

    Abstract Objective:The authors attempted to study wilforidine's immunopharmacologic effect on the SLE patients.Methods:Adopted SLE patients peripheral blood mononuclear cells(PBMC)cultured in vitro and investigated the influence of Wilforidine on PBMC's B cell functions and the time-effect correlation of Wilforidine on PBMC's IgG production induced by PWM.Results:Wilforidine not only inhibited the spontaneous proliferation of PBMC's from SLE patients but also inhibited the proliferation of the PBMC induced by SAC.It could inhibit SLE patients PBMC's IgG production induced by PWM. The time-effect results showed that the Wilforidine had obvious inhibition effect on IgG production when added the drug before 72 hour of the culture time in vitro.Conclusion:These data suggested that Wilforidine could inhibited various B cell's function.The main points of inhibition effect on B cell's IgG production may be on the stage of B cells activation and proliferation.
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    Key words Wilforidine Systemic lupus erythematosus B cells

    雷公藤治疗自身免疫性疾病已被大家所熟知,它具有明确的免疫抑制功能。雷公藤碱戊(简称碱戊)是其中的一种活性单体。为进一步了解它的免疫药理作用并推测它是否是雷公藤治疗SLE的有效成分之一,本文采用SLE病人外周血单个核细胞(简称PBMC)体外培养观察碱戊对SLE病人的B细胞功能的影响。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象 SLE患者22例,选自本院自身免疫病专科门诊。病例均符合1982年美国风湿病协会(ARA)修正的诊断标准[1],平均年龄为30.0±8.3岁。其中女性21例,正常人对照选自上海医科大学医学检验系员工,以性别、年龄配对。

    1.2 药品与试剂
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    1.2.1 雷公藤碱戊是雷公藤去皮根的醋酸乙酯提取物中经反复硅胶柱层析而得的结晶,经核磁共振及光谱鉴定而得。

    1.2.2 有丝分裂原 植物血凝素PHA-M(DIFCO,USA),美洲商陆PWM(SIGMA,USA),金葡菌Cowan-I株SAC(上海医科大学检验免疫室提供)。

    1.3 方法

    1.3.1 淋巴细胞增殖试验 人的肝素抗凝静脉血以淋巴细胞分离液分离PBMC,洗涤并重悬,细胞悬液配成2×106 个/ml,按每孔100 μl加至96孔细胞培养板中,同时加入有丝分裂原和碱戊,置5%CO2 37℃培养72 h,以3H-TdR掺入法测定细胞的增殖反应,以cpm值表示。

    1.3.2 细胞毒性试验 取配制好的细胞悬液100 μl/孔加于96孔板内,同时加不同浓度的碱戊,培养48 h后加0.2%台盼蓝滴片计数活细胞百分率。
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    1.3.3 自发性淋巴细胞增殖试验 将分离并洗涤好的PBMC(2×106个/ml)悬液单独或与碱戊一起,置37℃ 5% CO2培养箱中培养6 h,以3H-TdR掺入法测定细胞增殖量,以cpm值表示。

    1.3.4 IgG的产生与检测 分离并充分洗涤好的PBMC悬液(2×106 个/ml)与PWM(10 μg/ml)共育,并加入碱戊,置37℃ 5% CO2培养箱中培养7 d后收集上清,置-70℃冰箱保存待测。IgG的含量(ng/ml)则以酶联免疫吸附法测定。

    2 结果

    2.1 碱戊对正常人和SLE患者的PBMC自发性增殖的影响 SLE患者PBMC在体外的自发增殖反应明显增高,其3H-TdR掺入量平均为362.5±187.0,约为正常人(3H-TdR掺入量为177.6±187.0)的2倍(P<0.05)。而碱戊(10 μg/ml)能明显抑制SLE患者PBMC的自发性淋巴细胞增殖反应,其3H-TdR掺入量为169.6±27.0(P<0.05)。但对于正常人的自发性淋转无明显抑制作用,其3H-TdR掺入量为251.0±126.0(P>0.05)。 为了排除药物本身毒性的影响,我们对碱戊进行了细胞毒性研究,结果发现在所用的实验浓度下(10 μg/ml)碱戊对细胞无直接的毒性作用,它们的存活率分别为:对照组91.0%±2.6%,碱戊组89.0%±6.3%,两组间的差别无显著意义(P>0.05)。进一步以10倍的试验浓度做毒性试验发现碱戊对细胞也无直接毒性作用,对照组存活率为91.0%±2.6%,碱戊组为89.3%±4.8%(P>0.05)。
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    2.2 碱戊对正常人及SLE患者SAC诱导的B细胞增殖反应的影响 如表1所示,碱戊对正常人及SLE患者的B细胞增殖反应均具有明显的抑制作用,它的抑制率在正常人与SLE患者之间分别为67.12%±24%,62.63%±24%(P>0.05)。

    2.3 碱戊对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响 SLE的PBMC在未受刺激时IgG的分泌量明显高于正常对照,而经PWM刺激后IgG的分泌量均明显增高,碱戊对正常人和SLE病人的PBMC在PWM刺激下的IgG分泌均有明显的抑制作用,其抑制率分别为53.86%±16%和58.90%±6%,两者之间无明显差异(P>0.05),见表2。进一步观察它们作用的时效关系发现分别在培养的0、24、48、72 h加入碱戊均能抑制PWM诱导的PBMC的IgG产生,结果分别为对照组1 237.2±782 ng/ml,0 h组405.0±179 ng/ml,24 h组468.5±276 ng/ml,48 h组为318.6±185 ng/ml,72 h组为310.4±123 ng/ml(P<0.05),而在培养96 h以后加入碱戊则不呈现抑制作用(P>0.05),IgG的分泌量分别为96 h组1 221.0±978 ng/ml,120 h组1 203.0±811 ng/ml。
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    表1 雷公藤碱戊对SAC激发PBMC增殖反应的影响(n=10)

    Tab.1 The influence of Wilforidine on PBMC's proliferation induced by SAC (n=10) Groups

    3 H-TdR incorporation(cpm,±s)

    IR(%)

    P

    Control

    SAC control

    Wilforidine+SAC
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    Normal individuals

    288±130

    2 766±1 799

    620±327

    67.12±24

    <0.05

    SLE patients

    598±264

    4 291±3 941

    639±877

    62.63±24

    <0.05
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    Note:P value indicate the comparison between the SAC group and the Wilforidine+SAC group;IR:Inhibition Rate表2 雷公藤碱戊对PWM诱导PBMC分泌IgG的影响(n=6)

    Tab.2 The influence of Wilforidine on PBMC's IgG production induced by PWM (n=6) Groups

    IgG production(ng/ml,±s)

    IR(%)

    P

    Control
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    PWM control

    Wilforidine+PWM

    Normal individuals

    317.5±150

    2 766.0±1 799

    620.0±327

    53.86±16

    <0.05

    SLE patients

    564.0±320

    4 291.0±3 941
, 百拇医药
    639.0±877

    58.90±6

    <0.05

    Note:IR:Inhibition Rate

    3 讨论

    系统性红斑狼疮是一种以B细胞功能亢进为特征的自身免疫性疾病。本文结果显示雷公藤碱戊能明显抑制SLE增高的PBMC自发性增殖。SLE病人PBMC自发性增殖的增高目前认为可能是由于体内B细胞的过度活化而致活化B细胞的增多在体外自发性增殖之故[2],故推测碱戊具有抑制已活化的B细胞的增殖功能。SAC是选择性作用于静止期B细胞的有丝分裂原[3],碱戊对于SLE患者和正常人PBMC对SAC诱导的增殖反应均有明显的抑制作用,抑制率在两者之间无明显差异。这说明它也能抑制B细胞的活化增殖功能。
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    PWM是T细胞依赖的B细胞激活剂,碱戊对PWM诱导正常人及SLE病人PBMC产生IgG均有明显的抑制作用。时效结果显示在培养0、12、48、72 h加入均能表现出抑制反应,据细胞体外活化分裂周期,静止期的细胞在体外经有丝分裂原的活化后,从G0期进入G1期,进一步进入S期经历了72 h,而后再分化成浆母细胞进而成为浆细胞分泌IgG。因此我们可以进一步证实碱戊对IgG的抑制作用环节也在于细胞的活化和增殖阶段,而不是分化分泌阶段。

    碱戊的毒性试验表明碱戊毒性小,以10倍的最适浓度做毒性试验发现碱戊对细胞仍无直接的毒性作用。

    综上所述,碱戊对B细胞功能的多个环节有抑制作用,主要环节在于抑制B细胞增殖活化阶段,因其毒性小,将是一种很有前景的活性单体。

    虞海燕 现工作单位:浙江医科大学附属邵逸夫医院皮肤科,杭州 310016
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    作者简介:虞海燕,女,33岁,皮肤科专业硕士研究生;

    指导老师,秦万章,男,教授,主要研究自身免疫性结缔组织病;

    吴厚生,男,教授,主要研究基础免疫检验学

    4 参考文献

    1 Tan E M,Cohen A S,Fries J F et al. The 1982 revised criteria for the classification of SLE.Arthritis Rheum, 1982;25(11):1271

    2 Yona K,Morimasa K,Asano T et al. Characterization of the spontaneous DNA synthesizing and/or IgG secreting cells in peripheral blood from patients with SLE.Clin Immunol Immunopathol,1985;35(1):57

    3 Kehrl I H,Muraguchi A, Butler J L et al. Human B cell activation,proliferation and differation. Immunological Rev,1984;78:75

    〔收稿1998-01-29 二次修回1998-08-29〕, http://www.100md.com