人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定
作者：王 辉 邓洁英 郑德先 史轶蘩
单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院，北京100730
关键词：生长激素基因；调控序列；人淋巴细胞
中国免疫学杂志990110 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素(irGH)基因调控序列的核苷酸顺序。方法：通过PCR扩增出人淋巴细胞irGH基因5′近端的调控序列，然后将其与质粒PGEM7Zf(+)连接，经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定，获得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重组质粒，进行序列测定。结果：显示irGH基因5′近端的调控序列与垂体细胞GH基因的5′近端调控序列的核苷酸顺序完全相同。结论：该结果进一步证明免疫系统与神经内分泌系统的密切关系。
, http://www.100md.com
Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human lymphocyte
WANG Hui,DENG Jie-Ying,ZHENG De-Xian et al.
Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730
Abstract Objective：Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human 1ymphocyte.Methods:The immunoreactive growth hormone(irGH) DNA fragments were obtained by PCR with normal human peripheral blood lymphocyte DNA as template.Then,the plasmids of PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp) were constructed by ligation of irGH DNA with PGEM7Zf(+),transformation,blue/white color selection and restriction enzyme analysis.The 5′-flanking region of irGH were sequenced by using sanger's dideoxynucleitide chain-temination reaction.Results:It was demonstrated that the sequence data of 5′-flanking region(-484-+2 bp) in irGH gene was identical to that of pituitary GH gene.Conclusion:The results indicate a close relationship between immune system and neuroencrine system.
, 百拇医药
Key words Growth hormone gene Promoter Lymphocytes
已发现经典的内分泌腺体、神经元、神经胶质细胞能够产生多种细胞因子，中枢及外周免疫器官也能产生多种激素和神经肽，此外还证实免疫系统和神经内分泌系统的细胞能表达细胞因子、激素及神经肽的受体[1]。淋巴细胞能分泌免疫反应性生长激素(Immunoreactive GH，irGH)，它是淋巴细胞的一种自分泌和旁分泌生长因子，在抗原性、分子量、生物活性及mRNA大小等方面与垂体GH相似。本实验室证实人淋巴细胞表达的irGH cDNA编码序列与垂体hGH cDNA的序列是相同的[2，3]，但目前有研究表明淋巴细胞分泌GH与垂体分泌GH的调控机制是不同的。本实验室为了从分子水平上探讨淋巴细胞irGH基因表达的调控机制，首先克隆irGH基因的5′上游调控序列，进行序列分析和鉴定。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 菌株及质粒 DH5α及PGEM7Zf(+)质粒为本室保存。
1.2 试剂 内切酶(SmaI、BamHI、EcoRI)、T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR产物纯化系统、fmol DNA测序试剂盒均为美国Promeaga公司产品。DNA分子量标准λDNA/EcoRI+HindⅢ、PBR322/hinfⅠ为华美公司产品，PCR引物由北京赛百胜(美国)生物工程公司合成，32P-dATP为北京亚辉公司产品。
1.3 PCR引物的设计 为了扩增irGH基因5′上游序列，按照文献[4]设计出上游引物(P1)(-484--467 bp):5′-GACTGAATCGTGCTCAC-3′和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5′-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3′。
1.4 irGH基因(-484-+464 bp)片段的扩增 取正常人抗凝外周血，分离出淋巴细胞，用酚抽提法分离DNA，纯化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 μl和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 μl终反应体积中按以下方式进行PCR扩增；95℃，5 min；94℃，1 min，60℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用Wizard PCR产物纯化系统回收。
, 百拇医药
1.5 irGH(-484-+464 bp)重组质粒的构建 首先取3.0 μg PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 μl反应体系中，25℃水浴水解3 h。然后加入PCR扩增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 μg加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 μl。12℃水浴3 h，将irGH DNA片段两端补齐。然后加入0.1倍体积的3 mmol/L醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，放入-20℃冰箱1 h，取出后4℃ 离心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷冻干燥3 min，加入下列试剂：6 U T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液2 μl、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 μl，补足至20 μl，16℃水浴过夜。然后取DH5a感受态细胞100 μl，加入10 μl连接缓冲液进行转化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行蓝、白斑筛选，即为irGH(-484-+464 bp)重组质粒。
1.6 irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒的构建 取数个白色菌落分别种入含有氨苄青霉素(50 μg/ml)LB培养基的试管中，37℃振荡过夜，采用碱裂解法进行质粒的少量提取，1%琼脂糖凝胶电泳，选出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒，如图1所示用BamHI酶切、鉴定获得正确的克隆，即irGH (-484-+2 bp)质粒。
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1.7 irGH基因5′上游核苷酸序列的测定 以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒为模板，用PUC/M13正反向引物行双链双脱氧DNA人工测序，按fmol测序试剂盒说明进行操作。
图1 PGEM7Zf(+)-irGH测序质粒的构建
Fig.1 Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH
2 结果
2.1 PCR扩增irGH基因片段(-484-+464 bp)结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳可见一大约900 bp的特异条带，该条带即为包括irGH 5′上游调控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。
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2.2 PGEM7Zf(+)-irGH DNA重组克隆的鉴定 PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端连接后，经蓝、白斑筛选，获得数10个白色菌落。取其中8个白色菌落进行质粒少量提取，琼脂糖电泳分析表明3个质粒为含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后经BamHI酶切分析，如图2所示，质粒1、2切下的片段小(+3-+464 bp)证明为正向连接，而质粒3切下的片段大(-484-+464 bp)为反向连接。然后将切下了小片段的质粒1、2用T4 DNA连接酶连接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒。
图2 重组质粒的琼脂糖电泳
Fig.2 Photogram of reconstructed plasmid digested with BamHI and analyzed by electrophoresis in agarose gel containing EB
, 百拇医药
2.3 irGH DNA 5′上游核苷酸调控序列的测定结果 如图3，与垂体GH基因的调控序列是一致的。
-484 GACTGAATCG TGCTCACAAC CCCCACAATC TATTGGCTGT GCTTGGCCCC TTTTCCCAAC
-424 ACACACATTC TGTCTGGTGG GTGGAGGTTA AACATGCGGG GAGGAGGAAA GGGATAGGAT
-364 AGAGAATGGG ATGTGGTCGG TAGGGGGTCT CAAGGACTGG CTATCCTGAC ATCCTTCTCC
-304 GCGTTCAGGT TGGCCACCAT GGCCTGCGGC CAGAGGGCAC CCACGTGACC CTTAAAGAGA
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-244 GGACAAGTTG GGTGGTATCT CTGGCTGACA CTCTGTGCAC AACCCTCACA ACACTGGTGA
-184 CGGTGGGAAG GGAAAGATGA CAAGCCAGGG GGCATGATCC CAGCATGTGT GGGAGGAGCT
-124 TCTAAATTAT CCATTAGCAC AAGCCCGTCA GTGGCCCCAT GCATAAATGT ACACAGAAAC
-64 AGGTGGGGGCA ACAGTGGGAG AGAAGGGGCC AGGTATAAAA AGGGCCCACA AGAGACCAG
-4 CTCAAG
图3 人irGH DNA 5′上游调控核苷酸序列
, 百拇医药
Fig.3 Nucleotide sequence of the 5′-flanking region of irGH gene of human lymphocytes
3 讨论
Hiestand等于1986年首先报道了用大鼠的GH和PRL特异性的mRNA探针进行斑点杂交，发现激活的淋巴细胞胞浆中有GH和PRL的mRNA存在[5]，随后人们就irGH分子量的大小、mRNA的表达量及irGH的分泌等方面进行了研究，证明在胸腺、骨髓、外周血细胞及脾脏分离出的T和B细胞都可分泌irGH。Kao等研究发现GHRH、TRH、CRH、胰岛素、睾酮、雌激素、胸腺素-5、生长抑素、IGF-I、肾上腺素等均不影响淋巴细胞系H9细胞分泌irGH[6]，Hattori等报道外源性GH能增加植物血凝素(PHA)刺激的人外周血淋巴细胞irGH的分泌，并且是剂量依赖性的，这表明淋巴细胞irGH和垂体GH的分泌调控机制是不同的[7]。刘军喜等对人外周血淋巴细胞的irGH cDNA及Rohn等对大鼠脾脏淋巴细胞的irGH cDNA分别进行了克隆和序列分析，结果证明淋巴细胞irGH cDNA与垂体GH cDNA的核苷酸序列完全相同[2，3]，并且Rohn还证明大鼠irGH的调控序列(-300 bp)与大鼠垂体GH基因调控序列是一致的[8]。有研究表明：人GH的289 bp调控序列就可满足垂体GH基因表达的需要[9]，为深入探讨irGH表达的调控机制，本研究首先对irGH基因5′上游调控序列(-484 bp-+2 bp)进行了克隆和测序分析。垂体细胞表达GH主要受垂体特异性转录调控因子Pit-1蛋白影响，Pit-1蛋白结合GH基因的部位在5′上游调控序列-80 bp左右和-122 bp左右两个位点。目前尚不清楚为什么淋巴细胞irGH和垂体GH分泌调控不同。Gellersen等通过对Pit-1 mRNA的RT-PCR研究发现胸腺细胞、Jurkat淋巴瘤细胞及PHA刺激的外周血淋巴细胞均有较弱的Pit-1条带存在，并且Pit-1条带的强弱与这些细胞分泌催乳素(hPRL)的多少无关[10]，我们推测人淋巴细胞irGH和垂体GH表达调控机制不同的原因可能是：淋巴细胞受细胞因子的自分泌和旁分泌影响；淋巴细胞内调控GH表达的Pit-1蛋白表达量太少，对irGH表达不起主要调控作用。要阐明淋巴细胞irGH表达的调控机理还需进行更深入的研究。
, http://www.100md.com
本实验证明人外周血淋巴细胞分泌的irGH基因调控序列(+484--2 bp)与垂体GH相应调控序列是完全一致的，这为我们进一步探讨irGH分泌的基因调控机制和irGH对淋巴细胞功能的影响打下了良好的基础。
人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定 国家自然科学基金资助(39370340)
人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定 王辉 河南新乡医学院免疫学教研室，新乡453003
郑德先 中国医学科学院基础医学研究所生化室，北京100005
作者简介：王 辉，男，33岁，在职博士生，副教授，主要从事神经内分泌免疫学方面的研究；
邓洁英，女，58岁，教授，博士生导师，主要从事垂体激素及疾病的基础研究
, 百拇医药
4 参考文献
1 王 辉，邓洁英，史轶蘩.淋巴细胞分泌的免疫反应性生长激素的研究进展.国外医学*免疫学分册，1997；20(4)：196
2 刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性生长激素mRNA的扩增与鉴定.中国医学科学院学报，1996；18(5)：370
3 刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性在生长激素cDNA的克隆、序列测定与人垂体生长激素cDNA的比较研究.中华内分泌代谢杂志，1997；13(1)：3
4 Chen E Y,Liao Y C,Smith D H et al.The human growth hormone locus; nucleotide sequence,biology,and evolution.Genomics,1989;4:479
, 百拇医药
5 Hiestand P C,Mekler P,Nordmann R. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporine.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:2599
6 Kao T L,Meyer W J. Inhibition of immunoreactive growth hormone secretion from lymphoid cell lines by Dexamethasone.Life Sci,1992;51:1033
7 Hattori N,Shimatsu A,Sugita M et al. Immunoreactive growth hormone secretin by human lymphocytes :augmented release by exogenous GH.Biochem Biophysi Res Commun,1990;168(2):396
, 百拇医药
8 Rohn W M,Weight D A.Cloning and nucleotide sequencing of rat lymphocyte growth hormone cDNA.Neuroimmunomodulation,1995;2(2):108
9 Theil L E,Karin M.Transcriptional control of GH expression andanterior pituitary develepment .Endocrine Rev,1993;14(6):670
10 Gellersen B，Kempf R,Telgmann R et al. Nonpituitary human prolactin gene transcription is independent of Pit-1 and differentially controlled in lymphocytes and in endometrial stroma.Molecular Endocri,1994;8(3):356
〔收稿1997-09-16 修回1998-03-05〕, 百拇医药
单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院，北京100730
关键词：生长激素基因；调控序列；人淋巴细胞
中国免疫学杂志990110 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素(irGH)基因调控序列的核苷酸顺序。方法：通过PCR扩增出人淋巴细胞irGH基因5′近端的调控序列，然后将其与质粒PGEM7Zf(+)连接，经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定，获得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重组质粒，进行序列测定。结果：显示irGH基因5′近端的调控序列与垂体细胞GH基因的5′近端调控序列的核苷酸顺序完全相同。结论：该结果进一步证明免疫系统与神经内分泌系统的密切关系。
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Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human lymphocyte
WANG Hui,DENG Jie-Ying,ZHENG De-Xian et al.
Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730
Abstract Objective：Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human 1ymphocyte.Methods:The immunoreactive growth hormone(irGH) DNA fragments were obtained by PCR with normal human peripheral blood lymphocyte DNA as template.Then,the plasmids of PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp) were constructed by ligation of irGH DNA with PGEM7Zf(+),transformation,blue/white color selection and restriction enzyme analysis.The 5′-flanking region of irGH were sequenced by using sanger's dideoxynucleitide chain-temination reaction.Results:It was demonstrated that the sequence data of 5′-flanking region(-484-+2 bp) in irGH gene was identical to that of pituitary GH gene.Conclusion:The results indicate a close relationship between immune system and neuroencrine system.
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Key words Growth hormone gene Promoter Lymphocytes
已发现经典的内分泌腺体、神经元、神经胶质细胞能够产生多种细胞因子，中枢及外周免疫器官也能产生多种激素和神经肽，此外还证实免疫系统和神经内分泌系统的细胞能表达细胞因子、激素及神经肽的受体[1]。淋巴细胞能分泌免疫反应性生长激素(Immunoreactive GH，irGH)，它是淋巴细胞的一种自分泌和旁分泌生长因子，在抗原性、分子量、生物活性及mRNA大小等方面与垂体GH相似。本实验室证实人淋巴细胞表达的irGH cDNA编码序列与垂体hGH cDNA的序列是相同的[2，3]，但目前有研究表明淋巴细胞分泌GH与垂体分泌GH的调控机制是不同的。本实验室为了从分子水平上探讨淋巴细胞irGH基因表达的调控机制，首先克隆irGH基因的5′上游调控序列，进行序列分析和鉴定。
1 材料与方法
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1.1 菌株及质粒 DH5α及PGEM7Zf(+)质粒为本室保存。
1.2 试剂 内切酶(SmaI、BamHI、EcoRI)、T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR产物纯化系统、fmol DNA测序试剂盒均为美国Promeaga公司产品。DNA分子量标准λDNA/EcoRI+HindⅢ、PBR322/hinfⅠ为华美公司产品，PCR引物由北京赛百胜(美国)生物工程公司合成，32P-dATP为北京亚辉公司产品。
1.3 PCR引物的设计 为了扩增irGH基因5′上游序列，按照文献[4]设计出上游引物(P1)(-484--467 bp):5′-GACTGAATCGTGCTCAC-3′和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5′-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3′。
1.4 irGH基因(-484-+464 bp)片段的扩增 取正常人抗凝外周血，分离出淋巴细胞，用酚抽提法分离DNA，纯化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 μl和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 μl终反应体积中按以下方式进行PCR扩增；95℃，5 min；94℃，1 min，60℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用Wizard PCR产物纯化系统回收。
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1.5 irGH(-484-+464 bp)重组质粒的构建 首先取3.0 μg PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 μl反应体系中，25℃水浴水解3 h。然后加入PCR扩增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 μg加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 μl。12℃水浴3 h，将irGH DNA片段两端补齐。然后加入0.1倍体积的3 mmol/L醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，放入-20℃冰箱1 h，取出后4℃ 离心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷冻干燥3 min，加入下列试剂：6 U T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液2 μl、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 μl，补足至20 μl，16℃水浴过夜。然后取DH5a感受态细胞100 μl，加入10 μl连接缓冲液进行转化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行蓝、白斑筛选，即为irGH(-484-+464 bp)重组质粒。
1.6 irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒的构建 取数个白色菌落分别种入含有氨苄青霉素(50 μg/ml)LB培养基的试管中，37℃振荡过夜，采用碱裂解法进行质粒的少量提取，1%琼脂糖凝胶电泳，选出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒，如图1所示用BamHI酶切、鉴定获得正确的克隆，即irGH (-484-+2 bp)质粒。
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1.7 irGH基因5′上游核苷酸序列的测定 以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒为模板，用PUC/M13正反向引物行双链双脱氧DNA人工测序，按fmol测序试剂盒说明进行操作。
图1 PGEM7Zf(+)-irGH测序质粒的构建
Fig.1 Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH
2 结果
2.1 PCR扩增irGH基因片段(-484-+464 bp)结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳可见一大约900 bp的特异条带，该条带即为包括irGH 5′上游调控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。
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2.2 PGEM7Zf(+)-irGH DNA重组克隆的鉴定 PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端连接后，经蓝、白斑筛选，获得数10个白色菌落。取其中8个白色菌落进行质粒少量提取，琼脂糖电泳分析表明3个质粒为含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后经BamHI酶切分析，如图2所示，质粒1、2切下的片段小(+3-+464 bp)证明为正向连接，而质粒3切下的片段大(-484-+464 bp)为反向连接。然后将切下了小片段的质粒1、2用T4 DNA连接酶连接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒。
图2 重组质粒的琼脂糖电泳
Fig.2 Photogram of reconstructed plasmid digested with BamHI and analyzed by electrophoresis in agarose gel containing EB
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2.3 irGH DNA 5′上游核苷酸调控序列的测定结果 如图3，与垂体GH基因的调控序列是一致的。
-484 GACTGAATCG TGCTCACAAC CCCCACAATC TATTGGCTGT GCTTGGCCCC TTTTCCCAAC
-424 ACACACATTC TGTCTGGTGG GTGGAGGTTA AACATGCGGG GAGGAGGAAA GGGATAGGAT
-364 AGAGAATGGG ATGTGGTCGG TAGGGGGTCT CAAGGACTGG CTATCCTGAC ATCCTTCTCC
-304 GCGTTCAGGT TGGCCACCAT GGCCTGCGGC CAGAGGGCAC CCACGTGACC CTTAAAGAGA
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-244 GGACAAGTTG GGTGGTATCT CTGGCTGACA CTCTGTGCAC AACCCTCACA ACACTGGTGA
-184 CGGTGGGAAG GGAAAGATGA CAAGCCAGGG GGCATGATCC CAGCATGTGT GGGAGGAGCT
-124 TCTAAATTAT CCATTAGCAC AAGCCCGTCA GTGGCCCCAT GCATAAATGT ACACAGAAAC
-64 AGGTGGGGGCA ACAGTGGGAG AGAAGGGGCC AGGTATAAAA AGGGCCCACA AGAGACCAG
-4 CTCAAG
图3 人irGH DNA 5′上游调控核苷酸序列
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Fig.3 Nucleotide sequence of the 5′-flanking region of irGH gene of human lymphocytes
3 讨论
Hiestand等于1986年首先报道了用大鼠的GH和PRL特异性的mRNA探针进行斑点杂交，发现激活的淋巴细胞胞浆中有GH和PRL的mRNA存在[5]，随后人们就irGH分子量的大小、mRNA的表达量及irGH的分泌等方面进行了研究，证明在胸腺、骨髓、外周血细胞及脾脏分离出的T和B细胞都可分泌irGH。Kao等研究发现GHRH、TRH、CRH、胰岛素、睾酮、雌激素、胸腺素-5、生长抑素、IGF-I、肾上腺素等均不影响淋巴细胞系H9细胞分泌irGH[6]，Hattori等报道外源性GH能增加植物血凝素(PHA)刺激的人外周血淋巴细胞irGH的分泌，并且是剂量依赖性的，这表明淋巴细胞irGH和垂体GH的分泌调控机制是不同的[7]。刘军喜等对人外周血淋巴细胞的irGH cDNA及Rohn等对大鼠脾脏淋巴细胞的irGH cDNA分别进行了克隆和序列分析，结果证明淋巴细胞irGH cDNA与垂体GH cDNA的核苷酸序列完全相同[2，3]，并且Rohn还证明大鼠irGH的调控序列(-300 bp)与大鼠垂体GH基因调控序列是一致的[8]。有研究表明：人GH的289 bp调控序列就可满足垂体GH基因表达的需要[9]，为深入探讨irGH表达的调控机制，本研究首先对irGH基因5′上游调控序列(-484 bp-+2 bp)进行了克隆和测序分析。垂体细胞表达GH主要受垂体特异性转录调控因子Pit-1蛋白影响，Pit-1蛋白结合GH基因的部位在5′上游调控序列-80 bp左右和-122 bp左右两个位点。目前尚不清楚为什么淋巴细胞irGH和垂体GH分泌调控不同。Gellersen等通过对Pit-1 mRNA的RT-PCR研究发现胸腺细胞、Jurkat淋巴瘤细胞及PHA刺激的外周血淋巴细胞均有较弱的Pit-1条带存在，并且Pit-1条带的强弱与这些细胞分泌催乳素(hPRL)的多少无关[10]，我们推测人淋巴细胞irGH和垂体GH表达调控机制不同的原因可能是：淋巴细胞受细胞因子的自分泌和旁分泌影响；淋巴细胞内调控GH表达的Pit-1蛋白表达量太少，对irGH表达不起主要调控作用。要阐明淋巴细胞irGH表达的调控机理还需进行更深入的研究。
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本实验证明人外周血淋巴细胞分泌的irGH基因调控序列(+484--2 bp)与垂体GH相应调控序列是完全一致的，这为我们进一步探讨irGH分泌的基因调控机制和irGH对淋巴细胞功能的影响打下了良好的基础。
人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定 国家自然科学基金资助(39370340)
人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定 王辉 河南新乡医学院免疫学教研室，新乡453003
郑德先 中国医学科学院基础医学研究所生化室，北京100005
作者简介：王 辉，男，33岁，在职博士生，副教授，主要从事神经内分泌免疫学方面的研究；
邓洁英，女，58岁，教授，博士生导师，主要从事垂体激素及疾病的基础研究
, 百拇医药
4 参考文献
1 王 辉，邓洁英，史轶蘩.淋巴细胞分泌的免疫反应性生长激素的研究进展.国外医学*免疫学分册，1997；20(4)：196
2 刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性生长激素mRNA的扩增与鉴定.中国医学科学院学报，1996；18(5)：370
3 刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性在生长激素cDNA的克隆、序列测定与人垂体生长激素cDNA的比较研究.中华内分泌代谢杂志，1997；13(1)：3
4 Chen E Y,Liao Y C,Smith D H et al.The human growth hormone locus; nucleotide sequence,biology,and evolution.Genomics,1989;4:479
, 百拇医药
5 Hiestand P C,Mekler P,Nordmann R. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporine.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:2599
6 Kao T L,Meyer W J. Inhibition of immunoreactive growth hormone secretion from lymphoid cell lines by Dexamethasone.Life Sci,1992;51:1033
7 Hattori N,Shimatsu A,Sugita M et al. Immunoreactive growth hormone secretin by human lymphocytes :augmented release by exogenous GH.Biochem Biophysi Res Commun,1990;168(2):396
, 百拇医药
8 Rohn W M,Weight D A.Cloning and nucleotide sequencing of rat lymphocyte growth hormone cDNA.Neuroimmunomodulation,1995;2(2):108
9 Theil L E,Karin M.Transcriptional control of GH expression andanterior pituitary develepment .Endocrine Rev,1993;14(6):670
10 Gellersen B，Kempf R,Telgmann R et al. Nonpituitary human prolactin gene transcription is independent of Pit-1 and differentially controlled in lymphocytes and in endometrial stroma.Molecular Endocri,1994;8(3):356
〔收稿1997-09-16 修回1998-03-05〕, 百拇医药